PLoS ONE: Exosomer Afledte fra Pladecellekræft hoved- og halscancer Fremme Cell Overlevelse efter ioniserende stråling

Abstrakt

Exosomer er nanometer-størrelse ekstracellulære vesikler, der menes at fungere som intercellulære kommunikatorer. Her rapporterer vi, at exosomer er i stand til at ændre stråling reaktion af hoved og hals kræft cellelinjer BHY og FaDu. Exosomer blev isoleret fra det konditionerede medium af bestrålede såvel som ikke-bestrålede hoved- og halscancer celler ved seriel centrifugering. Kvantificering ved hjælp NanoSight teknologi angivet en øget exosom frigivelse fra bestrålet sammenlignet med ikke-bestrålede celler 24 timer efter behandling. For at teste om de frigivne exosomer påvirke strålingen reaktion af andre celler exosomerne blev overført til ikke-bestrålede og bestrålede recipientceller. Vi fandt en øget optagelse af exosomer isoleret fra både bestrålede og ikke-bestrålede celler ved bestrålede recipientceller sammenlignet med ikke-bestrålede modtagende celler. Funktionelle analyser fra exosome overførsel viste, at alle exosomer (fra ikke-bestrålede og bestrålede donor celler) øge udbredelsen af ​​ikke-bestrålede modtagende celler og overlevelsen af ​​bestrålede modtagende celler. De overlevelsesfremmende virkninger er mere udtalt, når exosomer isoleret fra bestrålede sammenlignet med ikke-bestrålede donorceller overføres. En mulig mekanisme for den forøgede overlevelse efter bestråling kunne være stigningen i DNA dobbelt-strenget pause reparation overvåget ved 6, 8 og 10 timer efter overførslen af ​​exosomer isoleret fra bestrålede celler. Dette er ophævet ved destabilisering af exosomer. Vores resultater viser, at stråling påvirker både overflod og handling af exosomer på modtagende celler. Exosomer overfører prosurvival virkninger ved at fremme udbredelsen og radioresistance af hoved- og halscancer celler. Tilsammen har dette studie indikerer en funktionel rolle exosomer i svaret af tumorceller til stråling inden for et terapeutisk dosisområde og tilskynder, at exosomer er nyttige objekter af undersøgelsen til en bedre forståelse af tumor stråling respons.

Henvisning : Mutschelknaus L, Peters C, Winkler K, Yentrapalli R, Heider T, Atkinson MJ, et al. (2016) Exosomer Afledte fra Pladecellekræft hoved- og halscancer Fremme Cell Overlevelse efter ioniserende stråling. PLoS ONE 11 (3): e0152213. doi: 10,1371 /journal.pone.0152213

Redaktør: Pierre Busson, Gustave Roussy, FRANCE

Modtaget: November 16, 2015; Accepteret: 10 marts 2016; Udgivet: 23 Mar 2016

Copyright: © 2016 Mutschelknaus et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser: DMEM, Dulbeccos modificerede Eagles medium; DSB, dobbelt-streng brud; EXO, exosomer; HNSCC, hoved og hals pladecellekarcinom

1 Indledning

Exosomer er en underklasse af ekstracellulære mikrovesikler, der udskilles af de fleste celletyper, herunder tumorceller. De er endocytisk oprindelse og frigives til det ekstracellulære miljø gennem fusion af cytosoliske multivesikulære organer med plasmamembranen. Exosome last omfatter en bred vifte af proteiner, mRNA’er, microRNA og lange ikke-kodende RNA’er [1-4]. Funktionelle undersøgelser viser, at exosomer fungere som ekstracellulære kommunikatorer ved at levere deres indhold til et mål celle via membran fusion, eller alternativt ved endocytose [5]. I 2007 Valadi et al. påvist, at exosomer kan shuttle-RNA mellem celler. Overførslen af ​​murine mast celle exosomer til humane mastceller resultater i oversættelsen af ​​murine mRNA, der beviser, at de leverede RNA-molekyler er funktionelle i modtagerlandene celler [3].

absorberede exosomer er i stand til at modificere biologiske funktioner recipientcellerne, hvor de kan give en ny fænotype, såsom metastase [6], angiogenese [7] og migration [8]. Den exosomal sammensætningen af ​​ekstracellulære miljø er modificeret ved cellulære stressfaktorer, der fører til ændret, for det meste beskyttende virkninger på recipientceller. Således exosomer afledt fra celler udsat for oxidativt stress yde modstand mod oxidativ stress til ikke-eksponerede recipientceller [9]. I brystcancercellelinier, hypoxi øger også frigivelsen af ​​exosomer bærer forøgede mængder af miR-210. Dette øger overlevelse og invasion af modtagende celler [10]. I forbindelse med ioniserende stråling exosomer afledt af bestrålede gliomceller forbedre migrationen af ​​modtagerens gliomceller [11]. Exosomer kan således påvirke kommunikationen af ​​stråling virkninger mellem ikke-målrettede og målrettede celler (tilskuer-lignende signalering), såsom genomisk ustabilitet [12-14].

Planocellulært karcinom er fælles maligniteter i hoved og halsregionen . Radiochemotherapy eller strålebehandling er den mest almindelige behandling for HNSCC (hoved og hals planocellulært karcinom) patienter med lokalt fremskreden og inoperable tumorer [15]. Men terapi modstand og tumor tilbagefald udgør en stor udfordring, og deres mekanismer er ikke godt forstået. Da exosomer dukker spillere i resistens vil vi vurdere, om exosomer kunne påvirke strålingen reaktion hoved og hals skællede carcinomceller [16-19]. Til dette formål bestemmes vi virkningen af ​​ioniserende stråling inden for en moderat dosisområde på exosome frigivelse og optagelse i HNSCC. For at analysere en formodet funktionelle rolle af exosomer tilføjede vi exosomer isoleret fra forskelligt bestrålede donorceller, og analyseret resulterer virkninger på spredning, overlevelse og DNA-reparation af modtagerens HNSCC efter en behandling med ioniserende stråling.

2 Materialer og Metoder

2.1 Cell kultur og bestråling

Hoved- og halskræft cellelinjer BHY (DSMZ nr .: ACC 404) og FaDu (ATCC

®HTB43

™) blev inkuberet ved 37 ° C og en relativ luftfugtighed på 95%. BHY celler blev dyrket i højglucose DMEM dyrkningsmedium (Dulbeccos modificerede Eagles medium, Gibco) plus 10% føtalt kalveserum (Bio Sælg), 2 mM L-glutamin og natriumpyruvat ved 10% CO

2. FaDu celler blev holdt i lav glucose DMEM (GE Healthcare) suppleret med 10% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin og 25 mM HEPES ved 5% CO

2. Cellelinie identiteter blev valideret ved sekventering af ni forskellige loci: D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, VWA, TH01, AM, TPOX, CSF1PO (udført af Eurofins Genomics, S1 og S2 Tables). En mycoplasma screening viste negative resultater.

Celler blev bestrålet med y-stråler, der udsendes af en

137caesium kilde på bestrålingsanlægget HWM-D2000 (Wälischmiller Engineering) med en dosis på 1 Gy pr 2,04 minutter.

2.2 isolering af exosomer

til isolering af exosomer protokollen af ​​Thery et al. blev tilpasset [20] (Fig 1A). 5 × 10

5-celler blev podet pr 10 cm petriskål, 72 timer senere blev mediet erstattet med 8 ml exosom-frit medium, og cellerne blev bestrålet over et moderat dosisinterval på 0-9 Gy. Exosomer isoleret fra ikke-bestrålede celler modtaget forkortelsen EXO 0 Gy, mens exosomer fra bestrålede celler blev navngivet EXO 3 Gy, EXO 6 og EXO 9 Gy. Exosom isolation blev gennemført fra det konditionerede medium opsamlet 24 og 48 timer efter bestråling. For at eliminere løsnede celler, døde celler samt cellulære fragmenter blev cellekultursupernatanten centrifugeret med 10.000 g i 30 minutter og derefter passeret gennem et filter med en porestørrelse på 0,22 um. Et ultracentrifugeringstrin med 100.000 g aktiveret sedimenteringen af ​​exosomer (75 minutter, 4 ° C). Supernatanten blev kasseret, og exosomal pellet blev resuspenderet i 2 ml PBS. Efter gentagelse af en anden ultracentrifugeringstrin (100.000 g) blev supernatanten bortkastet, og exosomer blev resuspenderet i PBS. Exosomal præparater blev opbevaret ved -20 ° C. Exosom donorceller høstedes 24 og 48 timer efter bestråling ved anvendelse af en celleskraber. Efter vask af cellulære pellet to gange med PBS, blev pelleten nedfrosset ved -20 ° C. Til fremstilling af exosom-frit medium, blev bovine exosomer fjernet fra føtalt kalveserum ved centrifugering ved 100.000 g i 14 timer.

(A) Scheme of exosome analyse. (B) Transmission elektronmikrografi, der viser exosomer isoleret fra cellekultursupernatanten af ​​3 Gy-bestrålede BHY-celler [skala bar: 100 nm]. (C) repræsentant immunoblot af HSP70, actin, CD63 og calnexin udført med exosom lysater (exo) og cellelysater (CP) høstet 24 timer efter bestråling. DMEM-medium, blev DMEM medium suppleret med exosom-depleteret føtalt kalveserum samt supernatanten efter ultracentrifugering indlæst som kontroller. (D) Størrelse distribution af exosomer fra ikke-bestrålede BHY celler målt med NanoSight teknologi. (E) Relativ exosome overflod af BHY exosomer isolerede 24 timer efter bestråling med 0, 3, 6 og 9 Gy [n = 6, p-værdi 0,05].

2.3 Elektronmikroskopi af exosomer

Ufortyndet prøve (isoleret fra 3 ml konditioneret medium) blev absorberet på glød afladet kulstof belagt net (G2400C fra Plano) i 2 minutter. Opløsningen blev blottet af og negativt farvet med 4% ammoniummolybdat (Sigma-Aldrich) opløsning i 30 sekunder. Mikrografer blev registreret med et Jeol JEM 100CX elektronmikroskop ved 100 kV på Kodak SO163 film. Negativer var digitaliseret med en Hasselblad Flextight X5 scanner ved 3000 dpi, hvilket resulterer i en pixelstørrelse på 0,25 nm /px. For visualisering billeder blev arkiveret lodret til en nm /px.

2.4 exosome kvantificering og bestemmelse af exosomal størrelse-fordeling

exosome beløb og størrelsesfordeling blev analyseret ved hjælp af NanoSight LM10 (Malvern) mikroskop. Exosom præparater (isoleret fra 5 ml konditioneret medium) blev fortyndet 1: 100 til 1: 2000 med H

2O at opnå 15 til 50 partikler pr Ramme til sporing. Prøver blev hver analyseret tre gange i 30 sekunder.

2.5 exosome optagelse

Exosomer (isoleret fra 15 ml konditioneret medium) blev farvet med den grønne fluorescerende farvestof PKH67 (MINI67-1KT, Sigma-Aldrich Chemie). Med det formål 50 pi exosome opløsning blev resuspenderet i 250 pi af fortyndingsmidlet C plus 1,5 pi af farvestof (1 mM). Efter 10 minutters inkubation ved stuetemperatur overdreven farvestof blev fjernet ved hjælp Exosom spin-søjler (Invitrogen) ifølge fabrikantens protokol. Som styre en lige stor del af farvestof i fortynder C plus 50 pi PBS blev behandlet ligner exosomer (exosome negativ kontrol, -exo).

For at måle optagelsen af ​​exosomer 50.000 celler i 200 pi medium blev podet i 48 brønds plader. Efter 24 timers ens mængder af PKH67-farvede exosomer blev tilsat til bestrålede og ikke-bestrålede recipientceller. Efter yderligere 3, 6, 8, 10 og 24 timer blev cellerne vasket tre gange med PBS, trypsineres og resuspenderes i 500 pi PBS. Optagelse blev målt på en FACSCAN LSRII (Becton-Dickinson, excitation = 490 nm, emission = 502 nm). Til fluorescens blev mikroskopi celler vasket tre gange med PBS fikseret med 4% paraformaldehyd vasket igen med PBS og dækket med Vectashield

® herunder Hoechst 33342 for kerner farvning. Billeder blev taget med fluorescens mikroskop BZ-9000 fra Keyence.

2.6 Inkubation af modtagende celler med exosomer

For at bestemme den biologiske aktivitet af exosomer (spredning, overlevelse og DSB reparation) vi inkuberes den recipientceller med exosomer isoleret fra identiske antal donorceller. Exosomerne blev udvundet efter mængder til opnåelse af en tredobbelt koncentration af exosomer sammenlignet med de native betingelser.

2.7 Proliferation og klonogene overlevelse efter overførsel af exosomer

Virkningen af ​​exosomer på proliferation blev bestemt med Presto blå

™ Cell levedygtighed Reagent Protocol (Life Technologies). 500 eller 1500 celler per brønd blev podet i plader med 96 brønde i 100 ul exosom-frit medium. Efter 24 timer exosomer (isoleret fra 300 pi konditioneret medium) blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i yderligere 72 timer. Til måling af celleproliferation 10 pi Presto blå reagens blev tilsat per brønd, inkuberet i 40 minutter ved 37 ° C og fluorescensen blev bestemt (excitation 560 nm; emission: 590 nm). I en pladelæser (Tecan)

For overlevelse bestemmelse blev en klonogen overlevelse assay udføres. Celler blev podet i plader med 12 brønde og sham behandlet eller bestrålet med 1, 2, 3, 6 og 10 Gy. Umiddelbart efter exosomer (fra 2,5 ml konditioneret medium) blev overført på cellerne, som derefter blev inkuberet i 5 dage for at tillade kolonidannelse fra enkeltceller. Efterfølgende blev cellerne vasket to gange med PBS, fikseret med 100% ethanol (30 minutter) og endelig farvet med Giemsa-opløsning (Boehringer Ingelheim, 1:20 i PBS, 30 minutter). Overdreven farvestof blev fjernet, og kolonier med mere end 30 celler blev talt.

2.8 Påvisning af DNA dobbelt-strengbrud efter overførsel af exosomer

1.000 til 6.000 celler blev podet i plader med 96 brønde. Efter at have nået en konfluens på 50-70% blev mediet erstattet med 100 pi exosom-frit medium, blev cellerne straks bestråles med 2 Gy og exosomer isoleret fra 300 pi konditioneret medium blev tilsat. Efter en inkubation på 1, 6, 8 eller 10 timer ved 37 ° C antallet af DNA DSB’er blev bestemt ved 53BP1 farvning. En fiksering trin med 4% paraformaldehyd blev efterfulgt af en permeabilisering med 0,2% Triton X-100. Efterfølgende blev cellerne blokeret med PBS + (1% bovint serumalbumin, 0,15% glycin) i 60 minutter og inkuberet natten over med det primære antistof 53BP1 (fortynding 1: 500, NB100-305, Novus Biologicals) ved 4 ° C. Den følgende dag blev cellerne inkuberet med de sekundære antistoffer gede-anti-kanin Alexa-488 (fortynding 1: 200, A-11034, Life Technologies) og fåre-anti-muse Cy-3 (fortynding 1: 500, 016-160- 084, Jackson Lab) i 1 time. Kerner blev farvet med Hoechst 33342 (SIGMA-Aldrich Chemie), og cellerne blev dækket med Vectashield

® Montering Medium (Linaris). Analyse blev udført med fluorescensmikroskop Biorevo BZ-9000 (Keyence). For alle forsøgsbetingelser de eksponeringstider blev opretholdt, og foci antal 60 celler pr tilstand blev bestemt.

2.9 Validering af exosomal stabilitet

For at teste stabiliteten blev exosomer inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C, enten med RNase a fra Qiagen (5 pg /pl eller 400 pg /pl) eller et detergent-peptidase-blanding (0,2% Triton X-100 /Trypsin, 2: 1). Derefter exosomer blev anvendt i DNA-reparation assays som beskrevet ovenfor.

2,10 Proteinanalyse

Celler blev lyseret i lysisbuffer II (25 mM Tris pH 7,5, 120 mM NaCl, 1% Triton X -100, 1% PSMF, 1 mM nov, 1 mM leupeptin) i 1 time på is. Efter centrifugering proteinkoncentrationen af ​​de indsamlede supernatanter blev bestemt ved anvendelse af BCA-assay under anvendelse af bovint serumalbumin som standard (Pierce

™ BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific).

Western blot-analyse blev udført ifølge standardprocedurer anvendelse af 10 ug af cellulært protein og et volumen på 12 pi exosome lysat svarende til exosomet beløb i 30 ml konditioneret medium for SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Adskilte proteiner blev blottet på nitrocellulose membraner og inkuberet med primære antistoffer rettet mod CD63 (sc15363, SantaCruz), HSP70 (MA3-007, Affinity Bioreagents), actin (SAB1305567, SIGMA-Aldrich Chemie) og calnexin (sc11397, SantaCruz). Peberrodsperoxidasekonjugeret anti-kanin- og anti-muse-antistoffer (sc2004 og sc2005, Santacruz) blev anvendt til at påvise antigen-antistof-binding via chemoluminescens (Amersham ECL påvisning kit, GE Healthcare).

2.11 Statistisk analyse

data repræsenterer middelværdien af ​​uafhængige, biologiske replikater ± standardafvigelse (SD). Betydningen af ​​n-fold ændringer blev beregnet ved anvendelse af den parrede t-test. At sammenligne hjælp af tre eller flere variable tosidet ANOVA blev anvendt. For alle statistisk analyse p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant og p 0,01 og p 0.001 blev anset yderst signifikant.

3 Resultater

3.1 Stråling øger exosome løsladelse fra hoved- og halscancer celler

Exosomer frigivet af hoved og hals tumorcellelinie BHY var isoleret ved differential ultra-centrifugering. For at validere isolation metode exosomer blev visualiseret ved transmission elektronmikroskopi. Den repræsentative mikrografi viste runde, skålformede strukturer med en diameter på 30-100 nm (Fig 1B). For yderligere kontrol af exosomet identitet den exosomal markørproteiner HSP70, actin og CD63 blev påvist ved western blot i BHY exosomer samt i lysater af BHY celler. Ingen påviselige proteiner var til stede i ubrugt dyrkningsmedium, i ubrugt medium suppleret med exosom-depleteret føtalt kalveserum eller i supernatanten af ​​konditioneret medium efter ultracentrifugering. Fraværet af calnexin i exosom lysater viser, at exosom præparater ikke var forurenet med cellemembraner afledt af apoptotiske legemer eller døde celler (Fig 1C). Endvidere størrelsesfordelingen og antallet af isolerede exosomer blev kvantificeret i seks uafhængige præparater til hver behandling ved anvendelse NanoSight teknologi. Denne tilgang bekræftede en homogen exosome præparat med en gennemsnitlig størrelse på 111-124 nm (n = 6) for de exosomer isoleret fra enten bestrålede eller ikke-bestrålede celler (Fig 1D). Den NanoSight måling viste også en stigning i antallet af exosomer genvundet fra bestrålede (EXO 3 Gy, EXO 6 Gy) sammenlignet med ikke-bestrålede (exo 0 Gy) celler 24 timer efter bestråling (fig 1E).

3.2 Stråling øger optagelsen af ​​exosomer ved recipientceller

Vi sammenlignede uptake kinetik for exosomer isoleret fra bestrålede og ikke-bestrålede donorceller samt deres optagelse af bestrålede og ikke-bestrålede modtagende celler. Derfor blev celler co-dyrket med PKH67-mærkede exosomer og exosome optagelse blev fulgt ved fluorescensmikroskopi og flowcytometri.

Fluorescens mikroskopi afslørede en tidsafhængig optagelse af exosomer. Efter 3 timer begyndte klynger af mærkede exosomer at akkumulere langs cellemembraner. Et stigende antal exosomer knyttet over tid og forårsagede diffus cytoplasma mærkning, som indebar en internalisering og opløsningen af ​​exosomer (Fig 2A).

PKH67-mærket exosomer isoleret fra bestrålede og ikke-bestrålede BHY celler blev co-dyrket med BHY celler. (A) Repræsentative fluorescens mikroskopi billeder til exosome optagelse efter 3, 6 og 24 timer inkubation. Exosomer blev farvet i grønt og kerner blev farvet blå med Hoechst 33342. (B) Optagelse af exosomer isoleret fra 6 Gy-bestrålede (EXO 6 Gy) og ikke-bestrålede BHY celler (EXO 0 Gy) efter 3, 6, 8, 10 og 24 timers inkubation. Mean fluorescens af ubehandlede celler og celler efter inkubation med farvede exosomer eller en exosom-negativ kontrol (-exo) er vist (n = 3). (C) Afhængighed af exosomal optagelse blev bestemt efter 24 timer ved anvendelse af en seriefortynding af en exosome præparat. (D) Optagelse af mærkede exosomer af 0, 2 og 4 Gy-bestrålede recipientceller efter 24 timer. I alle eksperimenter en minimum på 10.000 celler blev analyseret for hver prøve [n ≥ 3, ± SD, p-værdi 0,05].

Vi kvantificeret også exosomet optagelse ved flowcytometri. De opnåede resultater bekræftede vores tidligere mikroskopi observationer og viste, at optagelsen af ​​exosomer var tidsafhængig (figur 2B) og lineær med den ekstra antal exosomer (fig 2C). Virkningen af ​​stråling på optagelsen af ​​exosomer efter recipientceller blev undersøgt ved at sammenligne uptake kinetik exosomer isoleret fra ikke-bestrålede celler til disse exosomer isoleret fra bestrålede celler. Fig 2B viser, at der ikke var nogen signifikant forskel i kinetikken mellem optagelsen af ​​exosomer afledt af bestrålede eller ikke-bestrålede donorceller. Der var imidlertid en dosisafhængig forøgelse af optagelsen af ​​exosomer af bestrålede recipientceller sammenlignet med ikke-bestrålede celler. Således blev exosomal optagelse signifikant forøget 1,3 gange for exosomer afledt af ikke-bestrålede celler og 1,4 gange for exosomer fra bestrålede donorceller, hvis de blev inkuberet i 24 timer med bestrålede recipientceller (4 Gy) sammenlignet med optagelse af ikke-bestrålet recipientceller (fig 2D). Tilsammen disse resultater viste, at exosome optagelse af recipientceller var tid og koncentrationsafhængig og at bestråling af recipientceller øget deres evne til at optage exosomer.

3,3 Exosomer fra enten ikke-bestrålede eller bestrålede celler øger overlevelsen af ​​modtagerens celler

Vi var interesserede, om exosomer fra bestrålede celler udviser de samme biologiske effekter i modtagerlandene celler som exosomer fra ikke-bestrålede celler. For at løse dette spørgsmål, vi tilføjet exosomer isoleret fra donor celler bestrålet med 0, 3, 6 og 9 Gy til ikke-bestrålede modtagende celler og måles celleproliferation. BHY celler behandlet med exosomer viste større spredning end celler dyrket uden exosomer (Fig 3A). Følgelig udpladningseffektivitet i kolonidannelse assayet er større for celler dyrket med exosomer end for celler dyrket uden exosomer (Fig 3B). Der blev imidlertid ingen signifikant forskel detekteret mellem behandlingerne med exosomer isoleret fra 0, 3, 6 eller 9 Gy-bestrålede celler (Fig 3A).

(A) Proliferation af celler dyrket i 3 dage i medium indeholdende exosomer isoleret fra bestrålede eller ikke-bestrålede celler. Som en kontrol en lige stor del af PBS uden exosomer blev tilføjet til de modtagende celler. (B) Plating effektivitet af celler dyrket i 5 dage i medium indeholdende exosomer isoleret fra bestrålede eller ikke-bestrålede celler. Som en kontrol en lige stor del af PBS uden exosomer blev tilføjet til de modtagende celler. (C) Klonogen overlevelse BHY celler co-dyrket med exosomer isoleret fra bestrålede eller ikke-bestrålede celler og kontrolceller (BHY + PBS) blev inkuberet i 5 dage efter bestråling med de angivne doser [n = 3, ± SD, p- værdi: * hvis p 0,05, ** hvis p 0,01 og **** hvis p 0,0001].

Næste indflydelse exosomer på stråling følsomhed BHY celler blev analyseret. Celler blev inkuberet med exosomer, derefter bestrålet med doser på op til 10 Gy og inkuberet i 5 dage. Efterfølgende blev klonogene overlevelse bestemmes. I overensstemmelse med den observerede proliferation-stimulerende virkning af exosomer på ikke-bestrålede recipientceller (Fig 3A og 3B) overlevelse af bestrålede recipientceller blev forøget ved tilsætning af exosomer (fig 3C og S3 Table). Her, exosomerne isoleret fra celler bestrålet med 6 Gy inducerede en større grad af stråling modstand end exosomer fra ikke-bestrålede celler (Fig 3B). Disse resultater tyder på, at exosomer fra BHY celler generelt støtter spredning og stråling modstand.

3.4 Exosomer påvirker satser DNA dobbelt-strenget pause reparation

Siden Dutta et al. viste, at exosomer frigivet fra brystcancerceller kan ændre phosphoryleringsstatussen af ​​DNA beskadigelse reparation proteiner [21], analyserede vi hastigheden af ​​DNA dobbelt-strenget pause (DSB) reparation i bestrålede recipientceller at belyse mekanismen for øget overlevelse af celler efter tilsætning af exosomer. Exosomer fra bestrålede og ikke-bestrålede BHY celler blev overført til bestrålede BHY celler (2 Gy), og antallet af DNA DSB-foci blev analyseret efter 1 og 6 timer. Kvantificering af DNA DSB-reparation foci 1 time efter eksponering for stråling viste ingen forskel i antallet af induceret foci mellem kontrolceller og celler inkuberet med exosomer enten fra ikke-bestrålede eller fra bestrålede donorceller (Fig 4A). Seks timer efter behandlingen fandt vi et nedsat antal reparation foci i BHY celler inkuberet med exosomer isoleret 24 timer efter bestråling af BHY celler sammenlignet med celler inkuberet med exosomer fra ikke-bestrålede BHY celler, hvilket antyder en hurtigere hastighed på reparation (Fig 4B og 4C). Lignende effekter blev set efter 6 timer for exosomer isolerede 48 timer efter bestråling (Fig 4C). Også analyse af fordelingen af ​​foci numre pr celler efter inkubering med exosomer afspejlede den øgede reparation i celler behandlet med exosomer fra bestrålede donorceller. Især antallet af celler med høj foci nummer ( 12) er faldet efter inkubering med EXO 6 Gy (S1A Fig). Desuden de observerede virkninger var også til stede 8 og 10 timer efter bestråling (S1B Fig). Hvis cellerne blev præ-inkuberet i 24 timer med de exosomer, derefter bestrålet med 2 Gy og faste efter 6 timer, jo hurtigere reparation induceret af exosomer fra bestrålede donorceller var stadig observeres (S1B Fig). En tilsætning af exosomer fra ikke-bestrålede BHY celler syntes at stige en smule foci nummer i sammenligning med kontrollen (PBS) i recipientcellerne 6 timer efter bestråling (fig 4B og 4C). Denne effekt var ikke til stede, efter præ-inkubering af celler med exosomer og efterfølgende bestråling (S1c Fig).

(A) Antal 53BP1 foci i BHY celler 1 time efter bestråling med 0 og 2 Gy og overførsel af BHY exosomer isoleret 24 timer efter bestråling med 0 og 6 Gy [n = 5]. (B) Repræsentative billeder af 53BP1 foci i BHY celler 6 timer efter 2 Gy og overførsel af BHY exosomer isoleret 24 timer efter bestråling med 0, 3, 6 eller 9 Gy (53BP1 foci grøn, kerner blå). (C) Antal 53BP1 foci i BHY celler 6 timer efter 2 Gy og overførsel af BHY exosomer isolerede 24 og 48 timer efter bestråling [n

1 (kontrol EXO 0 Gy 24 timer; EXO 6 Gy 24 h) = 6 , n

2 (EXO 0 Gy 48 h; EXO 3 Gy; EXO 6 Gy 48 h EXO 9 Gy) = 3]. (D) Antal 53BP1 foci i FaDu celler 6 timer efter 2 Gy og overførsel af FaDu exosomer [n = 3]. (E) Antal 53BP1 foci i FaDu celler 6 timer efter 2 Gy og overførsel af BHY exosomer [n = 3]. (F) Antal 53BP1 i BHY celler efter 2 Gy og overførsel af destabiliseret BHY exosomer. Exosomer fra BHY celler isoleret 24 timer efter bestråling med 0 og 6 Gy blev behandlet med RNase A eller en blanding af Triton og trypsin [n

1 (kontrol intakt) = 6; n

2 (RNase A 5 ug /ul) = 2; n

3 (RNase A 400 pg /pl; Triton + trypsin) = 3]. For alle eksperimenter på ± SD blev vist og p-værdier beregnet på kontrol blev anset for at være væsentlig, hvis * p 0,05 og højsignifikant ** hvis p 0,01, mens

▲ p 0,05 og

▲▲ p 0.01 angiver signifikante forskelle til EXO 0 Gy.

exosom-stimuleret DNA-reparation blev bekræftet ved hjælp af en anden hoved- og halscancer cellelinje FaDu. Igen inkubationen af ​​FaDu recipientceller med exosomer isoleret fra bestrålede FaDu celler faldt mængden af ​​DNA-reparation foci (fig 4D). For at teste celletypespecificiteten af ​​exosom-inducerede virkninger vi tilføjet exosomer isoleret fra BHY celler til bestrålede FaDu celler. Exosomer fra BHY celler er i stand til at udføre lignende radioprotektive virkninger på FaDu celler (Fig 4E).

Endelig destabiliseret vi exosomer gennem høj koncentration RNase A behandling eller ved at tilføje en detergent-peptidase-blanding. Destabiliseret 0 Gy og 6 Gy exosomer var ude af stand til at ændre antallet af reparation foci sammenlignet med ubehandlede exosomer indikerer et tab af funktion på grund af behandlingen (fig 4F). Sammenfattende disse resultater, exosomer indflydelse reparation af DNA DSB’er på en dosisafhængig, celletype uspecifik måde.

4 Diskussion

Cell kommunikation via exosomer er i stand til at påvirke skæbnen for celler i stresssituationer [9, 10, 22, 23]. Vi viser nu et bidrag på exosomer til øget overlevelse af hoved- og halscancer celler efter bestråling. Exosomer udskilles inden 24 timer efter bestråling have en indvirkning på spredning, celle overlevelse, og DNA-reparation effektivitet. Som følge heraf kan celle kommunikation via exosomer under anti-tumor stråling resistens af cancerceller og forbedre overlevelse hoved- og halscancer celler både i og uden for strålefeltet. Derfor vil være behov for en bedre forståelse af de underliggende mekanismer af exosomer i strålingen reaktion for at forbedre strategier for strålebehandling.

4.1 Exosomer øge overlevelsen og spredning af hoved og hals pladecarcinom celler

Vi viser, at exosomer påvirke skæbne bestrålede og ikke-bestrålede BHY og FaDu hoved- og halscancer celler. Exosomer øger overlevelsen af ​​bestrålede recipientceller. De prosurvival virkninger af exosomer fra bestrålede donorceller var mere udtalte end dem induceret af exosomer fra ikke-bestrålede donorceller. I overensstemmelse Hazawa et al. viste, at overførslen af ​​exosomer fra ikke-bestrålede celler til 8 Gy-bestrålede mesenchymstamceller resulterer i forøget overlevelse [24].

Tilsvarende exosomer inducere proliferation i ikke-bestrålede recipientceller. Denne effekt er uafhængig af stråling-behandling af exosome donorceller. I nyere litteratur virkningerne af exosomer på proliferation diskuteres kontroversielt. Svarende til vores resultater, exosomer afledt af blære cancerceller, kronisk myeloid leukæmi celler eller mastceller øge udbredelsen af ​​modtagende celler efter exosome overførsel [8, 25-27]. Imidlertid Jella et al. viste nedsat levedygtighed af keratinocytter efter inkubation i exosom-holdigt dyrkningsmedium [14].

4.2 Exosomer påvirker DNA dobbelt-strenget pause reparation efter ioniserende stråling i hoved og hals pladecarcinom celler

Vi antaget, at exosomer kan fremme overlevelse ved at udløse DNA-reparation, som det blev påvist, at phosphorylering af kritiske DNA reparation proteiner påvirkes af exosomer [21]. Vores resultater viste, at DNA-reparation ikke var påvirket af exosomer på et tidligt tidspunkt efter bestråling (1 time), medens øget DNA-reparation blev fundet efter inkubation med exosomer fra bestrålede donorceller på senere tidspunkter (6-10 h). Den øgede DNA-reparation lige blev detekteret for en 6 timers inkubation ved hvilken kun et begrænset antal exosomer er forbundet til cellerne, og efter en præinkubation med exosomer antager vi, at en lille mængde af exosomer er tilstrækkelig til at inducere de observerede virkninger. Forskellige aspekter af virkningen af ​​exosomer på DNA-reparation blev analyseret i to nylige undersøgelser. En viste, at et forøget antal DNA reparation foci blev observeret efter overførsel af exosomer fra ikke-bestrålede brystcancerceller til normale humane primære mammaepitelceller [21]. Brug kometen-assay, Al-Mayah et al. på den anden side viste, at exosomer øger DNA beskadigelse af brystcancer epitelcancerceller [12].