PLoS ONE: Epiteliale til Mesenchymale Transition er mekanistisk Linked med Stem Cell Underskrifter i prostatakræft Cells

Abstrakt

Baggrund

Håndtering af patienter diagnosticeret med prostatakræft (PCA) er meget effektiv; dog tumor tilbagefald med kastrationsniveau Resistant Prostate Cancer (CRPC) og efterfølgende metastase fører til ringe overlevelse resultat, hvilket antyder, at der er et stort behov for hidtil ukendte mekanistisk forståelse af tumortilbagevenden, hvilket ville være kritisk for at designe nye terapier. Den gentagelse og metastaser af PCa er tæt forbundet med biologi prostatakræft stamceller eller kræft-initierende celler, der minder om købet af Epithelial til Mesenchymale Transition (EMT) fænotype. Stigende tyder på, at EMT-type celler deler mange biologiske egenskaber med cancer stamceller-lignende celler.

Metodologi /vigtigste resultater

I denne undersøgelse fandt vi, at PCA celler med EMT fænotype viste stem- ligesom celle funktioner karakteriseret ved forøget ekspression af Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B og /eller Notch1 overensstemmelse med øget klonogene og kugle (prostasphere) dannende evne og tumorigenecity i mus, som blev forbundet med nedsat ekspression af miR-200 og /eller lad-7 familie. Tilbageførsel af EMT ved re-ekspressionen af ​​miR-200 hæmmede prostasphere-dannende evne EMT-type celler og reducerede udtryk for Notch1 og Lin28B. Nedregulering af Lin28B steget lad-7 udtryk, som var i overensstemmelse med undertrykt selvfornyelse kapacitet.

Konklusioner /Betydning

Disse resultater tyder på, at miR-200 spillede en central rolle i at knytte karakteristika af cancer stamceller-lignende celler med EMT-lignende celle signaturer i PSA. Selektiv eliminering af cancer stamceller-lignende celler ved at vende EMT fænotypen til Mesenchymale-Epithelial Transition (MET) fænotype under anvendelse hidtil ukendte midler ville være nyttige til forebyggelse af tumortilbagevenden især ved at fjerne de celler, der er “Root Cause” af tumorudvikling og gentagelse

Henvisning:. Kong D, Banerjee S, Ahmad A, Li Y, Wang Z, Sethi S, et al. (2010) Epithelial til Mesenchymale Transition er mekanistisk Linked med stamcelle Signaturer i prostatacancerceller. PLoS ONE 5 (8): e12445. doi: 10,1371 /journal.pone.0012445

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Juni 28, 2010; Accepteret: August 6, 2010; Udgivet: 27 August, 2010

Copyright: © 2010 Kong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af en bevilling fra National Cancer Institute, National Institutes of Health (NIH) (5R01CA083695-08 til FHS) (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nye beviser tyder på, at de fleste solide tumorer, herunder prostatakræft (PCA) kan opstå fra cancer stamceller [1]. De cancer stamceller er celler inden en tumor, der har kapacitet til selv-fornyelse og tumor-initierende kapacitet, og differentiere ind i de heterogene slægter af kræftceller, der omfatter i en tumor masse. Disse tumor-initierende celler kunne give et reservoir for celler, der forårsager tumor tilbagefald efter behandling. Wang et al. har vist, at oprindelsen af ​​PCA-celler er fra de differentierede luminale epitelceller stamceller [2]. Men der er en større grad af fænotypisk heterogenitet af celler i PCa, især inden metastatiske steder. Metastaser omfatter ofte sjældne celler, som er fænotypisk udifferentieret [3], hvilket antyder, at metastaser-initierende celler ikke kan være den eneste celler, som er afledt af androgen receptor-positive luminale celler. Selv skal fuldt belyst oprindelse PCA celler, en række stærke beviser tyder på, at tumor-initierende celler eller cancer stamceller spiller en afgørende rolle i udviklingen og gentagelse af PCa at kastrere resistent prostatacancer (CRPC) og dens efterfølgende metastaser.

Nylige undersøgelser har vist, at somatiske celler kan omprogrammeres til pluripotente embryonale stamceller-lignende celler ved co-ekspression af pluripotens stamceller markører såsom Oct4, Sox2, Nanog og Lin28 [4], [5], som rejser muligheden for, at kombineret udtryk for stamcelle-associerede faktorer og særlige onkogener kan også fremkalde en udifferentieret tilstand i kræftceller. Interessant cellelinier afledt fra humane PCA prøve viste epitelial fænotype. Imidlertid immortalisering af disse celler efter hTERT viste ekspressionen af ​​pluripotens stamcellemarkører, herunder Oct4, nonag, og Sox2 [6], som kan være forbundet med sygdommens progression, fordi overekspression af Oct4, Sox2, Nanog og c-myc har blevet fundet i dårligt differentierede tumorer [7]. Jeter et al. har vist, at knock-down af Nanog i PCA-celler faldt betydeligt langsigtet klonogene vækst og inhiberede tumorvækst [8]. Oct4 er også blevet vist at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​PCa [9].

Epithelial til mesenkymale overgang (EMT) er en afgørende proces for morfogenese under fosterudviklingen, men på det seneste har det også været impliceret i konvertering af tidlige fase tumorer i invasive maligniteter [10]. Progression af de fleste karcinomer mod malignitet er forbundet med tabet af epitheldifferentiering og ved at skifte retning mesenkymale fænotype, som er ledsaget af forøget cellemotilitet og invasion. Nyere undersøgelser har vist, at EMT spiller en kritisk rolle ikke kun tumormetastase men også i tumortilbagevenden, der menes at være tæt knyttet med biologi cancer stamceller-lignende celler eller cancerceller-initierende celler [11] – [13]. Men de mekanismer, hvorved EMT-celler genererer, stamme-lignende celler mangler at blive belyst. MikroRNA’er (miRNA) dukker op som master-regulatorer af celledifferentiering og involveret i købet af EMT fænotype under tumor progression [14]. To evolutionære konserverede familier, MIR-200 og lad-7 er blevet vist at regulere differentieringsprocesser under udviklingen. Interessant nok har nyere undersøgelser også vist, at MIR-200 familien ikke kun kunne regulere de processer af EMT ved at målrette E-box-bindende protein ZEB1 og ZEB2 [15], men var også forbundet med stamceller-lignende celle signaturer ved at regulere ekspressionen af ​​Bmi1 [ ,,,0],16], [17]. Lad-7 familie af miRNA har vist sig at virke som en tumorsuppressor ved at målrette Ras, høj mobilitet gruppe A2 (HMGA2) og c-myc, og faldt lad-7-ekspression er blevet forbundet med forøget tumorigenicitet og dårlig patient prognose. Endnu vigtigere er, lad-7 familiemedlemmer regulerer selv-fornyelse af brystkræftceller [18], som er forbundet med stamcelle-fænotype. Nylige undersøgelser har også dokumenteret, at lin28B kunne blokere ophobningen af ​​modent lad-7 [19], som igen regulerer “stemness” ved at inhibere selvfornyelse, de cellulære egenskaber ved cancer stamceller-lignende celler i forbindelse med tumor gentagelse. Gentagelse af PCa menes at være stærkt forbundet med biologi prostatakræft stamceller eller kræft-initierende celler [11], [20], [21], og samtidig øge beviser har vist, at celler med EMT fremkaldt af forskellige faktorer er rige kilde af cancer stamceller-lignende celler [12], [13], [22], [23].

Derfor er det vigtigt at identificere hvilke faktorer kan inducere EMT og hvordan EMT-celler kunne blive en ressource for cancer stamceller-lignende celler, hvilket yderligere understreger mekanistisk rolle sådanne faktorer mod udviklingen af ​​nye og målrettede behandlinger for CRPC. Undersøgelser har vist, at blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) signalering bidrager til EMT [24], [25]. For nylig har vi og andre vist, at PDGF-D kunne regulere kræftcellen invasion og angiogenese, der var i overensstemmelse med købet af EMT fænotype [26] – [30]. Interessant nok har forøget ekspression af PDGF-D også blevet fundet i human PCa [31], hvilket antyder, at PDGF-D kunne spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​humane PCa bidraget med EMT-fænotypiske eller cancer stamceller-lignende celler. I denne undersøgelse fandt vi, at PDGF-D over-udtrykkende PC3-celler erhvervet EMT fænotype og delte stamceller-lignende celletræk karakteriseret ved forøget ekspression af stamcellemarkører såsom Notch1, Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B, hvilket var i overensstemmelse med forbedret klonogene, prostasphere-dannende evne samt øget tumorgenicitet i mus. Samtidigt fandt vi ARCaP

M celler med EMT fænotype også delte stamceller-lignende celle signaturer karakteriseret ved øget ekspression af transkriptionsfaktor Notch1 og forbedret klonogene, prostasphere-dannende evne i forhold til kontrol-celler (ARCaP

E celler) med epitelial fænotype. Disse EMT-type celler viste også nedsat ekspression af MIR-200 eller lad-7, og vending af EMT ved at tvinge ekspression af MIR-200 signifikant inhiberede klonogene og prostasphere-dannende evne, hvilket var i overensstemmelse med inhiberingen af ​​Notch1 og Lin28B ekspression. Desuden knock-down af Lin28B steget markant lad-7 udtryk, hvilket tyder på, at miR-200 og lad-7 kunne fungere som et mål for forebyggelse af tumor tilbagefald og metastaser i PCa.

Resultater

Klonogen evne blev forøget i PC3 PDGF-D og ARCaP

M-celler, der har EMT fænotype

resultaterne fra Western blot-analyse og cellemorfologi samt vores offentliggjorte data har vist, at overekspression af PDGF -D induceret EMT fænotype i PC3-celler [26], [28] (fig. 1A), hvilket var i overensstemmelse med højere niveauer af PDGF-D i cellelysater og konditionerede medium (CM) fra PC3 PDGF-D-celler sammenlignet med PC3 Neo celler (fig. S1A og S1B). ARCaP

M celler med mesenchymale morfologi viste en forøget ekspression af mesenchymale markører og nedsat ekspression af epiteliale markører sammenlignet med ARCaP

E celler med epitelial fænotype (Fig. 1B). For at bestemme om celler med EMT fænotype kunne have stamceller-lignende cellekarakteristika, udførte vi klongenicitetsassayet. Vi fandt, at klonogene evne blev øget betydeligt i PC3 PDGF-D-celler i forhold til PC3 Neo celler (Fig. 1C, venstre panel). Fig. 1C, højre panel, endvidere angivet, at PC3 PDGF-D-celler udviste en 11-fold stigning i koloni numre forhold til PC3 Neo-celler. ARCaP

M-celler også vist en øget klonogene kapacitet viser 3 gange stigning i koloni tal i forhold til ARCaP

E-celler (Fig. 1d). Blød agar-assay, også kendt som forankringsuafhængig vækst assay blev udført. PC3 PDGF-D-celler udviste dramatisk stigning i klonogene potentiale i forhold til PC3 Neo-celler (fig. 1E, venstre panel). Fig. 1E, højre panel, klart viste koloni tal genereres fra PC3 Neo og PC3 PDGF-D celler pr mikroskopisk felt (40 X). Disse resultater viste en stigning i klonogenisk evne EMT celler

(A) Fotografier af celler blev vist:. PC3 Neo celler udviste afrundede epitelcelle form og PC3 PDGF-D-celler udviste en fibroblastisk-fænotype (venstre panel , original forstørrelse, 200 X). Western blot analyse viste ekspressionen af ​​transskription repressorer forbundet med EMT og mesenchymale samt epiteliale markører i PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler (højre panel, passage 10 til 20). (B) morfologi ARCaP

M og ARCaP

E celler blev vist (venstre panel) .Western blot-analyse, der er angivet den øgede ZEB1, vimentin og Notch1 udtryk og faldt E-cadherinekspression i ARCaP

M-celler sammenlignet med ARCaP

E (højre panel). (C) og (D) Fotografier af kolonier fra PC3 Neo og PC3 PDGF-D eller ARCaP

M og ARCaP

E blev vist (venstre panel). Kolonien numre blev talt, og dataene blev præsenteret som relative koloni antal PC3 Neo eller ARCaP

E udformet som en (højre panel). (E) Kolonierne dyrket på blød agar blev fotograferet (venstre panel, bar, 200 um). Kolonien numre blev talt under et fasekontrastmikroskop. Dataene blev præsenteret som koloni numre pr felt (højre panel). **, P 0,01 sammenlignet med Neo eller ARCaP

E-celler (N: PC3 Neo celler, D: PC3 PDGF-D-celler, p10: passage 10, E-cad: E-cadherin)

Self-fornyelse kapaciteten blev øget med EMT celler

for yderligere at afgøre, om celler med EMT fænotype kunne vise stamceller-lignende celle egenskaber, vi testede sfære-dannende (betegnes som prostasphere) evne PC3 PDGF D-celler sammenlignet med PC3 Neo samt ARCaP

M-celler sammenlignet med ARCaP

E-celler ved dyrkning i suspensionskulturer, som er en

in vitro

mål for stamceller-lignende cellekarakteristika. Vi fandt, at PC3 PDGF-D-celler udviste signifikant forøget evne til at danne prostaspheres forhold til PC3 Neo-celler (fig. 2A og 2B). De prostaspheres fra PC3 Neo var mindre end 100 um i diameter efter 6 dage, mens 40% af de prostaspheres fra PC3 PDGF-D-celler var 100-200 um, 20% af prostaspheres fra PC3 PDGF-D-celler var større end 200 um (fig. 2C). For yderligere at bekræfte, om de prostaspheres er afkom af individuelle celler snarere end aggregater af flere celler blev prostaspheres (P1) opsamlet, og cellerne blev udpladet på en celle per brønd i 96-brønds plade med ultralav binding. Efter 12 dage, fandt vi, at en til to nye prostaspheres blev genereret fra enkelt PC3 PDGF-D-celler, mens kun 20% enkeltceller af PC3 Neo genereret nye prostaspheres (P2, fig. 2D). ARCaP

M celler udviste også en øget prostasphere-dannende kapacitet (fig. 2E og 2F), hvilket tyder på, at celler med EMT fænotype har erhvervet øget selvfornyelse kapacitet. Baseret på disse resultater blev der gennemført yderligere mekanistiske forsøg fokuseret ved hjælp PC3 PDGF-D-celler sammenlignet med PC3 Neo-celler og sammenlignet med ARCaP

M og ARCaP

E-celler, uanset hvor berettiget.

(A) Prostaspheres fra PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler blev fotograferet og vist (bar, 100 um). (B) Antallet af prostaspheres blev talt under mikroskop. (C) Prostaspheres blev fotograferet og størrelsen af ​​prostaspheres i diameter blev målt ved anvendelse softwareimage analyseprogram Scion Image. (D) Den prostaspheres (P1) blev opsamlet og genudpladet med en tæthed på én celle pr brønd i 96-brønds plade med ultralav binding. Efter 12 dages inkubation blev antallet af prostaspheres (P2) talt under et fasekontrastmikroskop. (E) Antallet af prostaspheres fra ARCaP

E og ARCaP

M-celler blev talt under mikroskop. (F) Prostaspheres fra ARCaP

E og ARCaP

M-celler blev fotograferet og vist (bar, 100 um). **, P 0,01 sammenlignet med Neo eller ARCaP

E celler. (Neo: PC3 Neo celler, PDGF-D: PC3 PDGF-D-celler)

Gen-ekspression profilering af stamcelle-markører i celler med EMT fænotype

for at opdage de gener, der regulerer og vedligeholdelse af stamcelle fænotype af PC3 PDGF-D-celler, der har EMT underskrifter, vi udførte microarray at bestemme genekspression profilering af PC3 PDGF-D-celler i forhold til PC3 Neo celler. Vi fandt, at PC3 PDGF-D-celler udviste dramatiske ændringer i ekspression af gener associeret med EMT fænotype (tabel S1). Interessant transkriptionsfaktorer Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B, kendt for at være tilstrækkelig til at omprogrammere muse eller humane somatiske celler til udifferentierede, pluripotente stamceller, viste sig at være signifikant forøget i PC3 PDGF-D-celler sammenlignet med PC3 Neo-celler. Samtidigt, nedstrøms mål for disse transkriptionsfaktorer såsom Zic2, Zic3, Sall2 og Sall4 var også signifikant opreguleret (tabel S2). For yderligere at bekræfte resultaterne fra microarray genekspression analyser, vi har udført real time RT-PCR og Western blot-analyse af udvalgte gener. Resultaterne fra real time RT-PCR viste 2 til tusind-fold stigning i mRNA niveauer af disse transkriptionsfaktorer og deres downstream mål i PC3 PDGF-D-celler (fig. 3A). Western blot-analyse viste også, at proteinet udtryk for Sox2, Nanog, Stat3, Lin28B og Oct4 var signifikant højere i PC3 PDGF-D-celler sammenlignet med PC3 Neo celler fra passage 10 til passage 20 (fig. 3B).

(A) ekspressionen af ​​gener på mRNA-niveauer for Oct4, Nanog, Sox familie gener og Lin28B i PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler blev bestemt ved anvendelse af real time RT-PCR. (B) Resultaterne fra Western blot viste, at de udtryk for Oct4 Sox2, Nanog, Stat3 og Lin28B blev øget væsentligt i PC3 PDGF-D-celler. (C) Real time RT-PCR blev anvendt til at kvantificere mRNA ekspressionen af ​​europæiske demokratifond, EZH2 og Suz12a. Relative mRNA niveauer blev normaliseret til GAPDH. (D) Resultaterne fra Western blot viste, at ekspressionen af ​​EZH2 blev øget betydeligt i PC3 PDGF-D-celler. (E) mRNA niveauer for Notch signalering faktorer i PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler blev bestemt ved anvendelse af real time RT-PCR. (F) Resultaterne fra Western blot viste, at de udtryk for Notch og Notch-ligander blev forøget betydeligt i PC3 PDGF-D-celler. GAPDH blev anvendt for protein loading kontrol. (N: PC3 Neo celler, D: PC3 PDGF-D-celler, P10: passage 10).

Polycomb gruppe proteiner er kendt for at være involveret i reguleringen af ​​gen undertrykkelse gennem kromatin ændringer, der er afgørende for bevarelse af de embryonale og voksne stamceller [32], [33]. Polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2) indeholder Suz12, EZH2, europæiske demokratifond og RBAP underenheder og funktioner i de embryonale og voksne stamceller til at undertrykke udviklingsmæssige gener, der fortrinsvis aktiveres under differentiering. Endvidere har yderligere undersøgelser vist, at PRC2 målgener co-besat af stamcelle regulatorer såsom Oct4, Sox2 og Nanog [34]. Under dataanalyse af vores microarray data, fandt vi, at niveauerne af EZH2 og Suz12a mRNA blev forøget i PC3 PDGF-D-celler sammenlignet med PC3 Neo-celler (Tabel S2), der blev yderligere bekræftet ved real time RT-PCR (fig. 3C). Desuden protein niveauer af EZH2 var signifikant opreguleret i PC3 PDGF-D-celler i forhold til PC3 Neo-celler (fig. 3D), og disse resultater tyder klart, at EMT-type karakteristika PC3 PDGF-D-celler er i overensstemmelse med underskrifter fra stamceller eller cancer stamceller-lignende celler.

Notch signalering har vist sig at spille en vigtig rolle i pluripotens og selv-fornyelse kapacitet både embryonale og voksne stamceller [35], [36]. Resultaterne fra vores microarray data viste, at mRNA-niveauer af Notch, Notch-ligander, delta-lignende, Jagged samt Notch downstream mål som Hes og Hey var signifikant højere i PC3 PDGF-D-celler sammenlignet med PC3 Neo-celler (tabel S2) . Real time RT-PCR viste 2 til 350 gange forøgelse i mRNA-niveauer af Notch signalering gener (fig. 3E), der blev yderligere bekræftet ved Western blot-analyse som vist i fig. 3F. Ligeledes har vi også fundet signifikant forøget niveau af Notch1 udtryk i ARCaP

M-celler sammenlignet med ARCaP

E-celler (fig. 1B, højre panel).

MIR-200b og miR-200C udtryk knyttet cancer stamceller signaturer med EMT fænotype

i vores tidligere undersøgelser, fandt vi signifikant nedregulering af miR-200 familie i PC3 PDGF-D-celler med EMT fænotype [28], som var i overensstemmelse med vores miRNA microarray data (tabel S3). For at afsløre, om udtryk for miR-200 familien er forbundet med stamcelle underskrifter blev PC3 PDGF-D-celler transficeret med miR-200a, miR-200b og miR-200c. Vi fandt, at transfektion af miR-200b og miR-200c induceret tilbageførsel af EMT til MET fænotype (Fig. 4A). Endnu vigtigere, re-ekspression af MIR-200b og MIR-200C inhiberede signifikant prostasphere-dannende evne PC3 PDGF-D-celler (fig. 4B). Desuden var størrelsen af ​​prostaspheres også reduceret i PC3 PDGF-D-celler transficeret med MIR-200b og MIR-200c sammenlignet med transfektion med kontrol miRNA (fig. S2A og S2B). Imidlertid transfektion af PC3 PDGF-D-celler med MIR-200a havde ingen virkning på prostasphere-dannende evne, men øget størrelsen af ​​prostaspheres sammenlignet med kontrol (fig. 4B, fig. S2A og fig. S2B). Disse resultater tyder på, at miR-200b og miR-200c, men ikke miR-200a hæmmede selv-fornyelse af PC3 PDGF-D-celler ved at styre target gen udtryk for miR-200b og miR-200c. Således vurderede vi udtryk for de formodede mål for miR-200b og miR-200c som Notch1, Bmi1 og lin28B i PC3 PDGF-D-celler transficeret med miR-200 familie, fordi miR-200b og miR-200c har tre eller én formodet bindingssteder i 3’UTR af Lin28B, Bmi1 mRNA (fig. S3) og Notch1 mRNA. MIR-200b og miR-200C transfektion reduceres dramatisk udtryk for Notch1 og lin28B, men havde ingen effekt på ekspressionen af ​​Bmi1 (fig. 4C). Ekspressionen af ​​ZEB1 viste sig at være nedreguleret ved tvungen ekspression af MIR-200b og MIR-200c (fig. 4C), hvilket var i overensstemmelse med tilbageførsel af EMT fænotype (Fig 4A). Vi fandt også, at miR-200C-ekspression undertrykt i ARCaP

M-celler sammenlignet med ARCaP

E-celler (fig. 4D). Desuden re-ekspressionen af ​​miR-200C i ARCaP

M celler ved transfektion med præ-miR-200C forstadier markant reduceret prostasphere-dannende kapacitet i forhold til transfektion med kontrol miRNA (Fig. 4E). Disse resultater var i overensstemmelse med nedregulering af Notch1 ekspression og tilbageførsel af EMT fænotype som karakteriseret ved forøget ekspression af E-cadherin og nedsat ekspression af ZEB1 samt cellulære morfologi ændring i ARCaP

M-celler transficeret med præ-MIR-200C forstadier (fig. 4F og fig. 4G).

PC3 PDGF-D-celler blev transficeret med præ-mIR-200. 3 dage efter transfektion blev cellerne delt og transficeret gentagne gange med præ-MIR-200 hver 3-4 dage i 14 dage. (A) Fotografier af celler er vist: transfektion af PC3 PDGF-D-celler med præ-miR-200 i 14 dage, miR-200b og miR-200c vendt EMT celler til MET cellemorfologi. (B) Cellerne blev indsamlet til generering af prostaspheres efter 14 dages transfektion med præ-miR-200. MIR-200b og miR-200C reduceret antallet af prostaspheres. (C) Western Blot viser, at Notch1, Lin28B og ZEB1 udtryk blev nedreguleret i PC3 PDGF-D-celler transficeret med miR-200b og miR-200c. (D) Niveauet af miR-200C faldt betydeligt i ARCaP

M ved hjælp af real time RT-PCR. (E) Transfektion af præ-MIR-200C efter 6 dage reducerede prostasphere-dannende evne i ARCaP

M-celler (Bar: 100 um). (F) Western blot viste, at re-ekspression af MIR-200C ved transfektion af præ-MIR-200C forøgede E-cadherin ekspression og undertrykt ekspression af ZEB1 og Notch1 i ARCaP

M-celler, som i overensstemmelse med ændringen fra mesenkymale til epitelcelle morfologi (G). *, P 0,05 sammenlignet med kontrol; **, P 0,01 i forhold til kontrol. (Con: kontrol, 200a: pre-miR-200a, 200b: pre-miR-200b, 200c: pre-miR-200c, E-cad: E-cadherin)

Nedregulering. af Notch1 af MIR-200 var delvist ansvarlig for inhiberingen af ​​colonogenic og prostasphere-dannende evne PC3 PDGF-D-celler

MIR-200b og MIR-200C har en bindingssteder i 3’UTR af Notch1 (fig. 5A). For at bestemme om Notch1 er direkte mål for MIR-200b og MIR-200c, analyserede vi aktiviteten af ​​3’UTR af Notch1 i PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler transficeret med 3’UTR af Notch1 luciferase plasmid samt PC3 PDGF -D celler cotransficeret med 3’UTR af Notch1 luciferase plasmid og mIR-200b eller mIR-200c. Vi fandt, at aktiviteten af ​​3’UTR af Notch1 luciferase blev øget betydeligt i PC3 PDGF-D-celler i forhold til PC3 Neo celler på grund af lavere niveauer af miR-200b og miR-200c i PC3 PDGF-D-celler. Desuden re-ekspressionen af ​​miR-200b eller miR-200C reduceres dramatisk aktiviteten af ​​3’UTR af Notch1 luciferase i PC3 PDGF-D-celler, mens re-ekspressionen af ​​miR-200a med en base af frø sekvens end miR-200b og miR-200c havde ingen effekt på aktiviteten af ​​3’UTR af Notch1 luciferase (fig. 5B). Disse resultater antyder, at MIR-200b og MIR-200C regulerer Notch1 ekspression ved binding til 3’UTR af Notch1 mRNA. For at bestemme om Notch1 spillede en vigtig rolle i opretholdelsen stamcellerne behandlede vi PC3 PDGF-D-celler med DAPT, en γ-sekretase inhibitor, som inhiberer aktiveringen af ​​Notch. Fuld længde Notch1 er normalt meget lav på grund af dets spaltning af mange enzymer i disse celler; vi fandt imidlertid, at ekspressionen af ​​fuld længde Notch1 var lidt mere i γ-sekretase behandlede celler. Vi fandt også, DAPT væsentligt reduceret klonogen evne PC3 PDGF-D-celler (fig. 5C, øvre panel), hvilket var i overensstemmelse med Western blot data, der viser, at DAPT behandling inhiberede aktiv form af Notch1 (fig. 5C, nedre panel). Endvidere transfektion af Notch1 siRNA dramatisk fortrængt prostasphere-dannende evne PC3 PDGF-D-celler (fig. 5D og 5E), og som svarer til nedregulering af Notch1 proteinekspression (fig. 5F). Disse resultater tyder på, at miR-200 medieret nedregulering af Notch1 var delvist ansvarlig for selvfornyelse kapacitet og colonogenic vækst i EMT-lignende celler med stamcelle funktioner.

(A) bevares, forudsagde bindingssteder for frø sekvenser af MIR-200b og mir-200C i 3’UTR af Notch1 mRNA. (B) MIR-200b og MIR-200C inhiberede Notch1 3’UTR luciferaseaktivitet. **, P 0,01 i forhold til Neo kontrol celler; #, S 0,01 sammenlignet med PDGF-D kontrolceller. (C) DAPT behandling, en γ-sekretase hæmmer, reducerede klonogene evne i PC3 PDGF-D-celler (øvre panel) .Western blot, der viser, at DAPT behandling reducerede aktiv form af Notch1 i dosisafhængig måde (nederste panel). (D) og (E) viser, at transfektion af Notch1 siRNA efter 9 dage undertrykte den prostasphere-dannende evne i PC3 PDGF-D-celler (Bar: 100 pm), hvilket er i overensstemmelse med nedregulering af Notch1 ekspression (F). **, P 0,01 i forhold til kontrol. (Neo: PC3 Neo celler, PDGF-D: PC3 PDGF-D-celler, Con: kontrol, 200a: pre-miR-200a, 200 mia: pre-miR-200 mia, 200C: pre-miR-200C)

Lin28B hæmmede produktionen af ​​lad-7, der regulerer selvfornyelse ved at styre ekspressionen af ​​Sox2, Nanog og Oct4

Vores resultater præsenteret ovenfor, viste, at miR-200b og miR-200c hæmmede lin28B udtryk (fig. 4C), som vides at binde til primær lad-7 og præ-let-7 RNA og inhiberer akkumuleringen af ​​modne lad-7 miRNA [19]. Resultaterne fra vores miRNA microarray data viste, at alle medlemmer af lad-7 familie blev væsentligt reduceret i PC3 PDGF-D-celler (Tabel S3). Disse resultater blev bekræftet ved real time RT-PCR assay (Fig. 6A). Knock-down af Lin28B af siRNA steget kraftigt modne lad-7 udtryk (figur 6B.); tyder lin28B reguleret modne lad-7-ekspression i PC3 PDGF-D-celler. Det er velkendt, at lade-7 familie spiller en kritisk rolle i reguleringen af ​​selvfornyelse i embryonale stamceller og brystcancer stamceller-lignende celler [18], [37]. For at bestemme, om lad-7 kunne styre selv-fornyelse af PC3 PDGF-D-celler, vi udførte kuglen-dannende assay. Re-ekspressionen af ​​udvalgte lad-7 familie såsom lad-7a, lad-7b, lad-7d eller en kombination af Lad-7a, lad-7b og lad-7d markant hæmmet prostasphere-dannende evne (Fig. 6C og 6D) og samtidig reduceret størrelsen af ​​prostaspheres (fig. 6C, S4A og s4b). Da Lin28B inhiberer akkumulering af modent lad-7 ved binding til pre-let-7 RNA og derved blokerer behandling af præ-let-7 RNA, PC3 PDGF-D-celler med højt Lin28B blev co-transficeret med præ-bogstav 7 og Lin28B siRNA. Vi fandt, at prostasphere numre fra celler co-transficeret med præ-let-7 og Lin28B siRNA var mindre end den for transfektion med præ-let-7 alene (figur 6D.); dog med undtagelse af lad-7d, var der ingen forskel i prostasphere størrelse mellem præ-let-7 alene og co-transfektion med præ-let-7 og Lin28B siRNA (Fig. 6C, S4A og s4b). Disse resultater var i overensstemmelse med data fra Western blot-analyse viser, at re-ekspressionen af ​​lad-7 betydeligt hæmmet Sox2 og Nanog udtryk i PC3 PDGF-D-celler ved transfektion af præ-lad-7a, præ-lad-7b eller samarbejde transfektion af præ-let-7a, præ-let-7b eller præ-let-7d med Lin28B siRNA. Transfektion af præ-lad-7d alene var i stand til at inhibere ekspressionen af ​​Lin28B og Oct4 men havde marginal virkning på Sox2 og Nanog udtryk (fig. 6E).

(A) De niveauer for lad-7 familie i PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler blev bestemt ved anvendelse af real time RT-PCR. (B) Real time RT-PCR blev anvendt til at kvantificere ekspressionen af ​​lad-7 i PC3 PDGF-D-celler transficeret med Lin28B siRNA i 3 dage. (C) Mikrofotografier viser prostaspheres genereret fra PC3 PDGF-D-celler transficeret med præ-let-7 eller en kombination af præ-let-7 og Lin28B siRNA 14 dage efter transfektion (bar: 100 pm). (D) Cellerne blev indsamlet til prostasphere-dannende assay efter 14 dages transfektion. Lad-7a, lad-7b, lad-7d og kombination af Let-7a, lad-7b, lad-7d samt co-transfektion med lad-7 og Lin28B siRNA faldt antallet af prostaspheres. (E) Resultaterne fra Western blot viste udtryk for Lin28B, Sox2, Nanog, og Oct4 i PC3 PDGF-D-celler transficeret med præ-let-7 eller cotransficeret med præ-lad-7 og Lin28B siRNA efter 9 dages transfektion. *, P 0,05 sammenlignet med kontrol; **, P 0,01 i forhold til kontrol. (Con: kontrol, a: pre-let-7a, abd: kombination af præ-lad-7a, præ-lad-7a, præ-lad-7d, al: kombination af præ-lad-7a og Lin28B siRNA, Lin28B- si: Lin28B siRNA, Neo: PC3 Neo celler, PDGF-D:. PC3 PDGF-D-celler)

Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B var forpligtet til selv-fornyelse af PC3 PDGF-D-celler

Vi har vist, at lade-7 familie reguleret selvfornyelse og hæmmede Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B udtryk i PC3 PDGF-D-celler med EMT fænotype. For at vurdere den mekanistiske link af disse molekyler (Sox2, NANOG, Oct4 og Lin28B) med selvfornyelse kapacitet PC3 PDGF-D-celler, vi bankede ned udtryk for Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B af siRNA transfektion hjælp Sox2 , Nanog, Oct4 og Lin28B specifikke siRNA. Vi fandt, at knock-down af Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B betydeligt undertrykt prostasphere-dannende evne (fig. 7A). Desuden PC3 PDGF-D-celler transficeret med Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B siRNA viste signifikant øget antallet af prostaspheres i mindre størrelse (30-50 um), sammenlignet med transficeret med kontrol siRNA samtidig med nedsat antal prostaspheres med 50 um i diameter (fig. 7B). Disse resultater stemte overens med protein ekspression resulterer som vist i fig. 7C, hvilket tyder på, at Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B er nødvendige for selv-fornyelse af PC3 PDGF-D-celler.

(A) Enkelt celle suspensioner af PC3 PDGF-D transficeret med Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B siRNA og inkuberet i 24 timer blev udpladet på ultralave adhærente brønde i 6-brønds plade ved 2000 celler /brønd. Efter 3 dage blev antallet af prostaspheres talt under mikroskop. (C).