PLoS ONE: Nanopartikel Provokeret Cell Magneto-Rotation: Overvågning Morfologi, Stress and Drug følsomhed en Suspenderet Single Cancer Cell

Abstrakt

Enkelt celle analyse har tilladt kritiske opdagelser i narkotika testning, immunbiologi og stamcelleforskning. Derudover en ændring fra to til tre dimensionelle vækstbetingelser påvirker radikalt celle adfærd. Dette allerede resulteret i nye bemærkninger om genekspression og kommunikationsnetværk og i bedre forudsigelser af celle reaktioner på deres omgivelser. Det er dog stadig vanskeligt at studere størrelsen og formen af ​​enkeltceller, der er frit ophængt, hvor morfologiske ændringer er meget signifikant. Beskrevet her er en ny metode til kvantitativ realtidsovervågning af cellens størrelse og morfologi, på enkelte levende suspenderede cancerceller, unconfined i tre dimensioner. Præcisionen er sammenlignelig med de bedste optiske mikroskoper, men derimod er der ikke behov for at begrænse cellen til billedplanet. Den her først introduceret

celle magnetorotation

(CM) metoden er gjort mulig ved

nanopartikel-induceret celle magnetisering

. Ved at anvende et roterende magnetfelt, er den magnetisk mærkede celle aktivt roteres, og den roterende periode måles i realtid. En ændring i morfologi inducerer en ændring i den roterende periode af det suspenderede celle (for eksempel når cellen bliver større den roterer langsommere). Evnen til at overvåge, i realtid, celle hævelse eller død, på enkelt celle niveau, demonstreres. Denne metode kunne således anvendes til multiplex realtid enkelt celle morfologi analyse, med konsekvenser for narkotika-test, lægemiddelforskning, genomforskning og tre-dimensionelle dyrkning

Henvisning:. Elbez R, McNaughton BH, Patel L, Pienta KJ , Kopelman R (2011) Nanopartikel induceret Cell Magneto-Rotation: Overvågning Morfologi, Stress and Drug følsomhed en Suspenderet Single Cancer Cell. PLoS ONE 6 (12): e28475. doi: 10,1371 /journal.pone.0028475

Redaktør: Christina Chan, Michigan State University, USA

Modtaget: Marts 8, 2011; Accepteret: November 8, 2011; Udgivet: December 13, 2011

Copyright: © 2011 Elbez et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH-R01-EB007977 (RK), NIH-R33CA125297-03S1 (RK) og NIH-R21EB009550 (RK)). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

heterogenitet, dvs. ikke-ensartethed, der findes i kræft cellepopulationer, og den allestedsnærværende celledifferentiering, har ført til en øget interesse for de enkelte celle undersøgelser [1] – [4]. Historisk set blev en tumor menes at stamme fra de successive afdelinger af et enkelt “mor celle”, hvilket indebærer den antagelse, at alle cellerne i en tumor delte den samme genetiske kode. Imidlertid har de seneste resultater ændret denne teori, understregede behovet for værktøjer, der kan overvåge og spore enkelte celler i en high throughput fashion [5] – [8]. Øjeblikket, standard assays udført på cellepopulationer foretage individuelle mønstre svært tilgængelige, på grund af virkningerne af gennemsnit [9]. Flowcytometri for eksempel er blevet massivt anvendt i de sidste 20 år, for sin evne til at udføre hurtig analyse på et meget højt antal celler ad gangen (10000 celler /s). Tidspunkt analyse kan også udføres ved hjælp af denne teknik, men det er ikke muligt at spore hver celle for sig.

Så igen, er det særlig vigtigt, at selv et lille mindretal af celler, såsom stamceller, hvis adfærd kunne anses for at være statistisk irrelevant i forhold til det store flertal af befolkningen, kan have en kritisk biologisk og medicinsk virkning. For eksempel brugen af ​​

Imatinib

stof, der er målrettet mod

BCR-abl

fusionsprotein hos patienter med kronisk myeloid leukæmi (CML) først syntes at være en af ​​de mest succesfulde målrettede behandlinger. Men behandlingen ikke fjerne CML stamceller, og med tilbagetrækningen af ​​Imatinib sygdommen genopstod [10], [11]. Som følge heraf har fokus på celle-til-celle variationer også tilladt vigtigste gennembrud i forståelsen af ​​celledifferentiering, narkotika reaktion, protein mekanismer og dynamikker, samt af den vigtige rolle, stamceller spiller, især for cancer stamceller [12]. Metastase er afhængig af kræftceller cirkulerer i det vaskulære netværk. Cellerne er ansvarlige for kræft formering til sekundære tumor sites er yderst sjældent (nogle få celler per million i blodet), og de går gennem en cirkulerende etape, før udfyldelse af andre væv. Derfor, sammen med enkelt celle analyse, tredimensionelle analyser tillader også en bedre forståelse af cellulære dynamik [13] – [15], ved at indsnævre kløften mellem

in vitro

in vivo

adfærd [7]. Men alle tidligere nævnte enkelt celle analyseteknikker begrænset af deres indespærring af cellen i to dimensioner. For at overvinde denne begrænsning, vi ansætter en ny tilgang med

suspenderet celle magneto-rotation

(CM).

Konkret bruger vi en

nanopartikel induceret Cell Magneto-rotation metode

, hvor den drivende magnetfelt og den roterende celle er

out-of-synch

med hinanden. Cellerne er indlejret med 30 nm kommercielle magnetiske nanopartikler (Ocean Nanotech®) og drejes under et ydre magnetfelt på ca. 1 mT, ved about100 Hz. Vi bemærker, at tusind gange (1000 ×) højere marker, i størrelsesordenen 1T, anvendes til MRI. Desuden har magnetiske nanopartikler været meget anvendt i biologi [16] – [20]. Således CM-metoden er designet til at være biokompatibel og ikke-toksisk. Den levende celle roteres

asynkront

(se supplerende information S1) i suspension, og dens rotationsfrekvens er yderst følsom over for enhver morfologi ændring. Som rapporteret her, betyder magneto-rotation ikke påvirke cellens levedygtighed, og giver mulighed for tidstro analyse, der skal udføres. Ændringer i cellemorfologi angives kvantitativt ved den enkelte celles rotation periode. Tendenserne i rotation sats tillader forskelsbehandling mellem en sund celle, en døende celle eller en hævelse celle. Derudover denne nye teknik er let at tilpasse til enhver mikroskopopstilling, er fluorescerende-label fri, og er kompatibel med samtidig fluorescens og /eller andre optisk billeddannelse og spektroskopi metoder samt magnetisk separation og berigelsesteknikker. Andre metoder, der anvendes til at spore morfologiske ændringer af enkelte biologiske celler omfatter Atomic force mikroskopi [21] (AFM) og Optisk Pincet [22] (OT). Disse fremgangsmåder kan tilbyde højere opløsning, men er begrænset af binding af celler til en overflade (AFM), eller af den irreversible skader forårsaget af laser trapping (OT). Endvidere med OT for hver cellelinie, levedygtighed Undersøgelser har, der skal gøres for hver celle type for at forhindre lysbeskadigelse, hvilket begrænser dens anvendelighed [23]. Brugen af ​​udkragninger er også blevet rapporteret at spore massen af ​​levende celler [24], men der er ingen publikationer endnu på enkelte kræftceller i suspension.

Resultater

Model for rotation af magnetisk mærkede celler

for at kontrollere, at cellerne kan magnetisk manipuleret, placeret vi dem i midten af ​​magnetiske spoler med magnetiske amplituder af en mT, som vist i figur 1b. Spolerne selv er tilpasset til platformen af ​​et mikroskop for at optage videoer (se supplerende figur S4 og supplerende Video S1). De enkelte celler roterer ved frekvenser i området fra 0,05 Hz til 2 Hz i denne opsætning (meget lavere end de 100 Hz kørsel felter, på grund af drift i

asynkron regime

, se nedenfor). Fokusering en laveffekt, 1,45 mW HeNe laser gennem mikroskopet, er den forreste spredt signal registreres med en fotodiode [25]. Cellen levedygtighed påvirkes ikke af denne lav intensitet laser, som vist i supplerende figur S3 og supplerende tabeller S1 og S2. Når cellen roterer, den producerer roterende-afhængig modulation, der kan måles med fotodioden. Med real-time signalbehandling, rotation periode af cellen og derfor dens størrelse /morfologi kan overvåges i realtid.

a) Skematisk af komplet opsætning. En levende celle Array® plade, med 100 um brønde, er placeret på platformen af ​​et mikroskop, som et sæt af elektromagneter er blevet tilpasset. Bemærk, at cellen ikke sidder fast på bunden af ​​brønden. Under 60 × mål, undergår laserstrålen fremadrettet spredning fra det roterende celle (15 til 20 um), og variationerne i den forreste spredt lys er fanget i sand tid af en fotodetektor og analyseres på en computer. b) Skema af en roterende celle anbragt inden de magnetiske spoler: to identiske sinusformede signaler, med en faseforskydning på 90 °, passerer gennem de to par spoler. Det påførte magnetfelt og det magnetiske moment af cellen er ikke justeret, hvilket skaber et drejningsmoment, som driver cellens rotation. c) Rotationshastighed periode på en fikseret celle i DMEM. Det indsatte repræsenterer det rå signal fra fotodetektoren, der viser periodicitet over en given tidsperiode. Behandlingen af ​​signalet giver derefter den roterende periode (Se metoderne sektion på den optiske setup for signalet behandling beskrivelse). d) Billedtekst af opsætningen. Tilpasset Helmoltz Coils med NUNC levende celler Array Plate på objektbordet.

Cellen sig at udvise magnetisk rotationsadfærd meget lig den for en magnetisk mikropartikel (Supplerende fig. S1). Som vist ved McNaughton et al. [26], og udvidet til tilfældet med superparamagnetiske partikler [27], findes der en kritisk frekvens på det eksterne magnetiske felt over hvilken partiklen ikke roterer synkront med feltet, dvs. partiklen ikke kan holde længere med drivfrekvensen. I denne asynkron regime, er middelværdien af ​​rotationshastigheden af ​​den enkelt celle givet ved, hvor er den magnetiske moment og er træk skyldes viskositets- kræfter. Her

κ

er dens Einsteins formfaktor,

V

volumen og

η

koefficienten af ​​viskositet. Vi bemærker, at er proportional med størrelsen af ​​det magnetiske felt, det magnetiske moment af cellen og mængden af ​​de magnetiske

indhold

af cellen; dog er alle disse parametre holdes konstant i forsøgene. Derfor, i den asynkrone regime, enhver ændring i cellens form eller volumen, dvs. i dens effektive volumen, inducerer en ændring i rotationshastigheden, givet ved den ovennævnte formel. Denne model er blevet yderligere forfinet for tilfældet med paramagnetiske partikler [28], [29], hvor den roterende periode, er fundet at være proportional med den effektive volumen, (dette gælder i det asynkrone roterende styre; for en komplet afledning , se ref. 27 og ligninger i Supplerende oplysninger S1). Som det kan ses af denne afhængighed, hvis volumen øges, rotation periode stiger proportionalt. Det samme gælder for formfaktoren, og som en konsekvens, kan man opdage morfologi ændringer.

Magnetic karakterisering af cellerne

For at karakterisere endvidere magnetisering af cellerne, vi kiggede på lokalisering af nanopartiklerne efter inkubation for at bestemme, om de opholdt bundet til overfladen, blev internaliseret, og, hvis de gjorde, hvis nanopartiklerne frit kunne bevæge sig i cytoplasmaet eller fanget i vesikler (endosomer). For at gøre dette, vi er knyttet HPTS fluorescerende dyemolecules (8 – hydroxypyren – 1,3,6 – trisulfonsyre, trinatrium salt) til vores nanopartikler, ved hjælp af de elektrostatiske tiltrækningskræfter mellem partiklerne og farvestoffer. HPTS er en membran impermeabel farvestof, og dermed det behov en vektor at blive internaliseret af cellerne. Efter standardprotokollen inkubation vaskede vi cellerne tre gange i PBS, og cellerne blev observeret under excitation ved 450 nm med fluorescens, der kontrolleres ved 510 nm. Resultaterne er vist figur 2a. Som vi kan se, er de magnetiske nanopartikler internaliseret af cellen via endocytose. Desuden hverken kernen eller cytoplasmaet viser fluorescens, hvilket indikerer, at nanopartiklerne forblive i vesiklerne. Desuden har vi vurderet jernindholdet i cellerne ved induktivt koblet plasma (ICP) måling (se Methods afsnit). Som forventet, at indholdet jern stiger med koncentrationen MNP i dyrkningsmedier, og tendensen ser ud være lineær i koncentrationen vindue, vi brugte (figur 2b). For vores rotation eksperimenter, vi vurderet, at jernindholdet er omkring 14 pg /celle. Sammenlignet med massen af ​​et nanopartikel, betyder dette, at i gennemsnit har mindre end 20.000 nanopartikler kommet ind i cellen. Andre størrelser af magnetiske nanopartikler blev også testet (10 nm, 100 nm og 200 nm), men internalisering blev maksimeret for partikler med en diameter på 30 nm (data ikke vist) Salg

a) fluorescensafbildning (40 ×. ) af en HeLa-celler efter inkubering med farvede magnetiske nanopartikler ved en ekstracellulær jernkoncentration af [Fe] = 12,5 ug /ml (0,22 mM). b) Cellular jernindhold i picogram per celle. Koncentrationerne af partikler i medierne er givet i jern koncentration (fejl barer værdier repræsenterer middelværdien +/- 0,5 * sd, n = 3).

cytotoksicitet assay og narkotika følsomhed

i denne undersøgelse blev cancerceller lastet med nanopartikler magnetisk separeret og resuspenderet i forskellige medier, såsom dyrkningsmedium (DMEM), DMEM med 5% ethanol, DMEM med 100 ug /ml cisplatin eller DMEM med 75% deionifzed vand. Hvert medium blev anvendt til at verificere forskellige aspekter af denne metode: DMEM blev anvendt som kontrol, ethanol blev anvendt som et cytotoksisk middel, blev Cisplatin bruges til at modellere et lægemiddel assay; også, at fremme stress gennem celle hævelse, anvendte vi en stor del af DI vand, vende den ioniske balance mellem indersiden og ydersiden af ​​cellen. Bemærk, at en stor koncentration af salt i opløsningen har den modsatte effekt på cellen, nemlig krympes. Cellerne i suspensionen blev derefter pipetteret på en Live Cell Array ™ plade (NUNC ™), hvor arrayet har 100 um brede brønde, som frembyder passende rum til enkelte celler til at rotere og blive analyseret. Optisk scattering signaler (fra de roterende celler) blev registreret, og ændringerne i rotation periode blev målt for de forskellige medier (figur 3). Magneto-rotation blev udført under talrige tilstande med forskellige celleprøver; de følgende resultater viser typiske eksempler på celle adfærd, der er blevet reproduceret flere gange i vores system.

a) i DMEM på en agarose lag b) I en blanding af 75% demineraliseret vand og 25% DMEM c) I en blanding af DMEM med 5% ethanol og d) for en levende celle i DMEM (grønne cirkler) sammenlignet med en HeLa celle (røde firkanter) i DMEM med en 100 ug /ml cisplatin. Y-aksen er den normaliserede periode, og X-aksen er tiden i sekunder. Linjer viser tendens mellem forbundne punkter. For hver graf, i billederne ovenover, de nederste billeder viser snapshots af den roterede celle ved hver angivet tidspunkt, mens de skematiske billeder på toppen af ​​det viser den tilsvarende celle former (fikseret celle ikke vist). Mørke diske repræsenterer cellens cytoplasma og membran, mens grå pletter viser vesiklerne ved overfladen, hvis nogen.

Figur 3a og 3b viser to tilfælde af celle hævelse. Celle hævelse generelt opstår på grund af det osmotiske tryk, der skabes enten ved en ionisk ubalance, som tidligere nævnt, eller af mangel på næringsstoffer. Uanset hvad, cellen udvider til at klare den ubalance af de kemikalier, den har brug for at opretholde dets metabolisme. For at nå ioniske ulighed, brugte vi DI vand (figur 3b). Vi observerede også, at celler også ville svulme, når de placeres på en agarose lag (2% agarose i DI vand) (figur 3b). Agarosegel er porøs, en egenskab, der anvendes i elektroforese af proteiner, og denne egenskab kan være til grund for ekspandering. Faktisk er de næringsstoffer, der forekommer i vækstmedierne, hovedsageligt glucose, kan diffundere ind agarosegelen mens cellerne roterer ovenover. Cellerne vil derfor svulme at afbalancere den reducerede koncentration af næringsstoffer til rådighed i opløsning, som observeret af Goldberg et al. i corticale celler [29]. Da celle volumen stiger, rotation periode stiger. Alternativt er celledød provokeret når de anbringes i en opløsning med 5% ethanol (figur 3c) eller ved anvendelse af en koncentration på 100 ug /ml cisplatin i opløsning (figur 3d, rød linie, som forbinder kvadrerede prikker). Men mekanismerne i disse former for celledød er forskellige fra de ovennævnte tilfælde, eftersom bleb’er synes på overfladen af ​​cellen. I 5% ethanol, det tager kun omkring 30 minutter (figur 3C) for bleb’er vises, mens der i tilfælde af behandlingen af ​​cisplatin ved 100 ug /ml, det tager flere timer. I modsætning til, hævelse tilfælde er det ændringerne i form af cellemembranen, at forøge den effektive volumen. Blebbing og dannelsen af ​​vesikler ved overfladen af ​​cellen indikere, at celleindholdet bliver nedbrudt og separeret i flere vesikler. Som dødsprocessen fortsætter, vesiklen størrelser stige. Denne form for fænomen ikke kun tilføje til den mængde, men det kritisk påvirker formfaktoren af ​​cellen. Kombinationen af ​​disse to parametre, nemlig

effektiv volumen

, er det, der spores med magnetorotation dermed forstærke blebbing effekt. Til sidst, træk på cellen bliver så høj, sammenlignet med den oprindelige tilstand af cellen, at cellen rotation periode stiger drastisk (med 550%), i en ikke-lineær måde (se figur 3c, rød linje på figur 3d og se fig. 4 for en sammenligning med mikroskop målinger). Således både celledød mekanismer, men meget forskellige, kan observeres og differentieret med Cell Magnetorotation.

a) Sammenligning af følsomheder mellem mikroskop og magneto-rotation i måling celledød (HeLa celle i DMEM, 5% Ethanol) . I rød er den normaliserede overfladeareal målt med mikroskopet, og blå er den normaliserede effektiv periode volumen målt med Magneto-Rotation hjælp Supplerende oplysninger S1. b) Sammenligning af celledød overvågning ved hjælp af magnetisk-rotation og live /Dead celle assay.

Vi har også udført magnetorotation af en sund celle (figur 3d, grøn linje), i vækstmedier. I fravær af en toksisk middel, har rotation periode ikke signifikant (standardafvigelsen for rotation periode var 15%). En fast morfologi kontrolforsøg blev realiseret ved at fiksere cellerne i et formaldehyd hætteglas 4% (1,5 ml) i 10 minutter, under ende-over-ende hætteglas rotation (se supplerende figur S2, rød linje). Da membranen og celleindholdet blev tværbundet, har cellemorfologien ikke ændre, under isotoniske betingelser, og således, som forventet, rotation periode ændrede sig ikke. Sammenlignet med en fikseret celle, hvor den roterende periode er meget flad, for levende celler vi observerer, at rotationen periode, over tid, udviser betydelige korte tid udsving. Dette kan være et resultat af cellemetabolisme, som stadig er aktiv under rotation. Samlet set viser, at når rotationen periode er konstant, det svarer til en celle, der ikke er væsentligt ændrer i sin effektive volumen.

For at vurdere nøjagtigheden af ​​metoden vedrørende effektive volumen ændringer, vi sammenlignet udviklingen i effektive volumen (proportional med rotation periode) med dem af overfladearealet, som anslået fra mikroskopi billeder (overfladearealet bliver en standard indikator for cellemorfologien /formfaktoren). Med en billedbehandlingssoftware (Adobe Photoshop), vi anslået overfladearealerne af cellerne ved regelmæssigt fordelte intervaller. Som det kan ses på figur 4a, magneto-rotation er så effektiv som en optisk mikroskopi setup for at observere små ændringer. Men for større ændringer, magneto-rotation forstærker responset, sammenlignet med den optiske mikroskop setup. Enhver væsentlig tab af magnetisk indhold tager flere dage, ifølge Arbab et al. [30]. Således dens indvirkning på fortolkningen af ​​resultaterne, efter flere timer, kan ignoreres. Også den konstante rotationshastighed af en magnetiseret kontrolcelle synes at bekræfte, at tabet af magnetisk del er ikke signifikant over tidsrum af målingen. Ellers ville det magnetiske moment af cellen kritisk falde, og cellen ville falde væsentligt, hvilket ikke er tilfældet (figur 3d). Derfor kan vi roligt antage, at cellens effektive volumen er faktisk proportional med roterende periode. Magneto-rotation kan også sammenlignes til Live /Dead celle assays. Celler blev fremstillet ifølge protokollen beskrevet tidligere. Inden pipettering mikrobrøndsplade, vi tilføjet 2,0 ul af calcein og 5,0 ul af propidiumiodid (PI) til en 1 ml prøve indeholdende celler. Celler blev efterladt sidder i inkubatoren i 10 min, og derefter resuspenderet i DMEM med 5% ethanol og den samme mængde farvestoffer, hvorefter de blev pipetteret og roteres. Som det kan ses på figur 4b, cellen undergår morfologi ændringer i god før PI-fluorescens kan ses, og med den tid celledød (PI defineret), indtræder, har rotationsperioden bremset med en faktor på ca. 2. Dette viser ikke kun at magneto-rotation metode «sammenligner godt med fluorescerende assays, men også viser det at være mere følsomme. Det er ikke overraskende at se rotationshastigheden bremse

godt før Salg One er at kunne detektere fluorescens fra PI farvestoffer. Faktisk er de PI farvestoffer kun gøre deres vej ind i cytoplasmaet efter cellevæggene er blevet ødelagt. Men godt før, andre processer foregår, en af ​​dem er dannelsen af ​​bleb’er ved overfladen af ​​cellen, et fænomen, celle magneto-rotation nøjagtigt kan overvåge, hvilket ikke er tilfældet for MTT-assayet for eksempel.

Virkninger af magneto-rotation på cellernes levedygtighed og division

for at undersøge muligheden af ​​opsætningen til at overvåge celledød, uden at forårsage celledød, vi gennemførte flere levedygtighed tests (laser eksponering, kort sigt og lang langsigtede virkninger af rotation på levedygtighed, celledeling og clonogenicity).

Vi først testet effekten af ​​optagelsen af ​​magnetiske nanopartikler [gul (RHS) og rød (midten) barer i figur 5a], og af tilstedeværelsen af et magnetfelt, på cellelevedygtighed [rød (midten) og blå (LHS) barer i figur 5a]. Vi udførte levedygtighed test på tre forskellige HeLa cellepopulationer. Efter en time ved 37 ° C, med fugtighed og CO

2 kontrol blev en celletælling fremstillet ved anvendelse af Trypan blå. Der var ingen signifikant forskel i levedygtighed mellem de tre cellegrupper (figur 5a). Dette viser, at hverken inkorporeringen af ​​partiklerne eller rotationen under et magnetfelt påvirkede levedygtigheden celler over tidsskalaen for en time. Faktisk er den samme form for magnetisk jernoxid nanopartikler ganske almindeligt anvendt [16], [30] for at magnetophoretically særskilte visse cellepopulationer fra heterogene populationer, samt under MR-scanninger på patienter (for kontrastforbedring), uden at skade celler . I de ovenstående levedygtighed tests blev feltintensiteten og koncentrationerne magnetisk partikel med vilje sat til højere værdier (0,5 mT og 40 ug /ml) end dem der er beskrevet i dette papir til magnetorotation (0,1 mT og 25 ug /ml), for at holde en sikkerhedsmargen i protokollen.

a) HeLa celler levedygtighed efter inkubation med nanopartikler og rotation under en roterende magnetfelt. Alle cellerne kom fra samme cellelinie, og blev dyrket på samme tid, hver i 4 dage. HeLa-celler blev dyrket, indtil den når 70% sammenflydning, og den første prøve udgjorde kontrolgruppen (RHS). De to andre grupper, inkuberet med magnetiske nanopartikler, stammede fra den samme celle batch, celler dyrket i nærvær af 40 ug /ml i DMEM, indtil den når 70% konfluens. Hver gruppe bestod af to prøver, der indeholder 50.000 celler hver. Mens den anden prøve ikke blev roteret, blev den tredje (kontrol) sat under et felt på 0,5 mT og roteret med en drivende frekvens på 100 Hz (LHS). Under eksperimentet blev cellerne holdt ved 37 ° C, med 5% CO

2 og fugtighedskontrol. For hver gruppe, n = 3. Værdier repræsenterer middelværdien +/- standardafvigelse. b) Magnetisk HeLa celler levedygtighed før og efter laser eksponering. HeLa-celler blev inkuberet med magnetiske nanopartikler, i 48 timer, efter protokollen beskrevet før. I en 96-brønds plade blev 150 ul af hvert sæt celler afpipetteret. Kontrolmåling (blå) blev realiseret efter cellerne blev vasket, fritliggende og resuspenderet i frisk medium ved 37 ° C. Ikke-eksponerede (rød) og eksponerede celler (grøn) blev holdt på mikroskopbordet i 120 minutter ved stuetemperatur. Hver brønd indeholdt 25.000 celler. Værdier repræsenterer middelværdi +/- 0,5 * s.d. n = 3. c) HeLa-celler levedygtighed under magneto-rotation ved 37 ° C, med fugtighed og 5% CO2-kontrol. HeLa-celler blev pipetteret på en Live Cell Array (NUNC ™). Cellerne fanget i 100 um brønde blev talt under anvendelse Calcein. For både kontrol og de roteret celler grupper, n = 4. Celledød blev overvåget ved hjælp af propidiumiodid. Standard afvigelser ligger inden for de prikker.

En anden mulig bekymring, vi rettet er effekten af ​​laser eksponering på cellens levedygtighed (figur 5b). Levedygtigheden test viser ingen signifikant celledød og ingen signifikant forskel efter to timer, mellem kontrolceller og magnetiske celler, der blev udsat for laseren. Både interaktionen af ​​cellerne med lys og den mulige interaktion mellem de magnetiske nanopartikler med laseren påvirker ikke cellernes levedygtighed.

Endelig har vi undersøgt den mulige virkning af den fysiske rotation af cellerne på deres levedygtighed. Faktisk for nøjagtigt at overvåge toksiske virkninger, celle rotation skal være harmløse. Figur 5c henvender dette sidste punkt. Sammenligning af dødeligheden af ​​roterende celler og dødsraten af ​​umagnetisk celler, fandt vi ingen statistisk forskel i de to tendenser (n = 4, p = 0,245 0,05, F = 1,65 5,98 = F

crit ). Derudover, som vi observeret (data ikke vist) og som beskrevet i andre publikationer [30], kan celler indeholdende magnetiske nanopartikler subkultiveres. Endvidere at beregne cellernes clonogenicity, udførte vi en klongenicitetsassayet hvor celler blev først magnetisk roteret i 24 timer i en inkubator, og derefter lade at vokse på agarose i tre uger. Vi fandt ingen signifikant forskel mellem de kontrolprøver og roterede prøver (n = 3, t = 1,37 2,77 = t

crit, p = 0,24 0,05 = p

Crit, se supplerende figur S3).

Endelig har vi også testet effekten af ​​magneto-rotation på celledeling. Spørgsmålet var: betyder magneto-rotation hindre øjeblikkelig celledeling? For at undersøge de kortsigtede virkninger, vi roteret celler på agarose i 72 timer, og sammenlignet cellevækst med to andre kontroller (ikke mærket og magnetisk mærkede celler i fravær af magnetfeltet). Vi fandt ingen forskel mellem de to forskellige grupper af magnetisk mærkede celler (se supplerende figur S4). Dette udelukker også enhver potentiel magnetisk hypertermi sker under rotation.

Diskussion

Uskadelighed af metoden

Anvendelse af magnetiske nanopartikler og skiftende magnetfelter er ofte forbundet med hypertermi , en proces, hvor de vibrerende nanopartikler inde i cellerne producerer varme, efterhånden dræbe de mærkede celler gennem en temperaturstigning. Som følge heraf har evnen til at rotere celler gennem internalisering af tilsvarende magnetiske nanopartikler og anvendelsen af ​​en roterende magnetfelt, dvs. skiftevis i to retninger på samme tid, uden at forårsage skade på cellen været en bekymring, selv om vi er bruger meget lavere felter ved en størrelsesorden, og frekvenser i intervaller af et par dusin Hz i stedet for et par 100 kHz [31], [32].

Vores første bekymring var derefter at sikre, at rotationen i sig selv dræbte ikke cellerne. Vores resultater viser, at levedygtigheden af ​​cellerne bevares, mens de roteres. Også engagementet med en (svag) laser (for at fange en spredning signal fra den roterende celle) ikke har nogen virkning på kort sigt cellelevedygtighed, som vist i figur 5b. Imidlertid er tilstedeværelsen af ​​en laser er ikke nødvendig, og signalet kan også analyseres ved hjælp af et kamera, fjerne eventuelle lang tid risiko for, at en langvarig eksponering for en laserstråle kan forårsage.

Vores resultater viser også, at internalisering af magnetiske nanopartikler ikke forårsager nogen virkning på cellelevedygtighed, og den påvirker kun celledeling ved at reducere væksten i kort tid, i løbet af et begrænset antal – højst 3 – af cellecyklus, før de når normale satser. Faktisk har vores magnetisk mærkede celler blevet subkultiveret i petriskåle, og vi observeret nogen forskel i levedygtighed (se supplerende information S1) eller i proliferationshastigheder efter tre division cyklusser (data ikke vist). I overensstemmelse med tidligere publicerede data [33], vi også fundet, at magnetisk mærkede celler voksede i et langsommere tempo end ikke-mærkede celler, indtil tre division cykler, fra hvilket tidspunkt og fremefter vækstraterne var tilbage til normal (se Supplerende oplysninger S1 ). Også, som nævnt, ifølge Arbab et al. [30] tilstedeværelsen af ​​celle- internaliseret magnetiske nanopartikler ikke forårsager skadelige langtidsvirkninger på cellernes levedygtighed (over en periode på 5 til 7 division cyklusser, dvs. over flere uger).

Tilstedeværelsen af ​​en roterende magnetfelt, og de inducerede sub-hertz frekvens rotationer, der blev induceret i de magnetisk mærkede celler havde ikke en langsigtet virkning på celledeling, som det fremgår af vores klonogene assay og ved celletælling efter roterende celler for 24 til 72 timer.

Derfor har vi vist, at for magnetorotation enhver celledød observeret var en følge af en bevidst fremkaldt giftige miljø. Derudover forventer vi, at da cellerne ikke dør som følge af rotation, cellevækst, og selv kritiske hviletilstand undersøgelser kunne udføres (arbejde i gang). Det er værd at bemærke, at celledeling er blevet observeret under rotation (se supplerende video S3), og roterende celler synes ikke at have en anden division sats sammenlignet med magnetisk mærkede ikke-roterende celler (se Supplerende oplysninger S1) Alt i alt er forskel i væksthastighed observeret under rotation definitivt kan forbundet med mærkning af cellerne med nanopartikler, og ikke virkningen af ​​selve rotation.

Denne undersøgelse viser en væsentlig forskel i cellelevedygtigheden sammenlignet for eksempel til

celle elektro-rotation

metode, som bruger cytolplasm uensartethed at fremkalde en elektrisk dipol.