PLoS ONE: genetiske varianter i microRNA Target lokaliteter af 37 Udvalgte kræftrelaterede gener og risikoen for livmoderhalskræft Cancer

Abstrakt

Målsætninger

Enkelt nukleotid polymorfier (SNPs) i formodede microRNA bindingssteder (miRSNPs) modulere kræft modtagelighed via påvirker miRNA binding. Her har vi forsøgt at undersøge sammenhængen mellem miRSNPs og livmoderhalskræft risiko.

Metoder

Vi først genotypede 41 miRSNPs af 37 cancer-relaterede gener i 338 patienter og 334 kontroller (Studie 1), og gentaget de betydelige foreninger i 502 patienter og 600 kontroller (Study 2). Vi testede effekten af ​​miRSNPs på microRNA-mRNA interaktionen med luciferase reporter assay.

Resultater

Fem SNPs viste bemærkelsesværdige forbindelse med livmoderhalskræft kræftrisiko i Studie 1. Kun

IL-16

rs1131445 opretholdt en signifikant sammenhæng med livmoderhalskræft (CT /CC vs TT, justeret OR = 1,51,

P

= 0,001) i Studie 2. Denne forening var mere tydelig i de kombinerede data fra to undersøgelser ( justeret OR = 1,49,

P

= 0,00007). Vi fandt også, at miR-135b efterligner interageret med

IL-16

3′-UTR at reducere genekspression og at rs1131445 T til C substitution i den formodede bindingssted forringet interaktionen af ​​miR-135b med

IL-16

3′-UTR. Et ELISA viste, at serum IL-16 af patienter med livmoderhalskræft blev forhøjet (vs. kontrol,

P

= 0,001) og korreleret med rs1131445 genotype. Patienter, der gennemførte den rs1131445 C-allelen havde højere serum IL-16 end ikke-bærere (

P

0,001).

Konklusioner

Disse resultater understøtter vores hypotese om, at miRSNPs udgør en modtagelighed faktor for livmoderhalskræft. rs1131445 påvirker

IL-16

udtryk ved at forstyrre den undertrykkende funktion miR135b og denne variant er signifikant associeret med livmoderhalskræft kræftrisiko

Henvisning:. Mi Y, Wang L, Zong L, Pei M Lu Q, Huang P (2014) genetiske varianter i microRNA Target lokaliteter af 37 Udvalgte kræftrelaterede gener og risikoen for livmoderhalskræft. PLoS ONE 9 (1): e86061. doi: 10,1371 /journal.pone.0086061

Redaktør: Qing-Yi Wei, Duke Cancer Institute, USA

Modtaget: November 2, 2013; Accepteret: 9. december 2013; Udgivet: 22 Jan 2014

Copyright: © 2014 Mi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Xian Videnskab og Teknologi Research Program (Tilskud XASTR1125), den Videnskabelige Research Foundation for det returnerede Overseas Chinese Scholars (Statens Uddannelsesstøtte Ministeriet) «. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

livmoderhalskræft, den tredje mest almindelige kræftform hos kvinder [1], er primært forårsaget af human papillomavirus (HPV) infektion [2]. Selvom HPV-infektioner er udbredt i seksuelt aktive kvinder, fortsætter kun et mindretal af infektioner og udvikle sig til livmoderhalskræft intraepithelial neoplasi klasse 2/3 (CIN 2/3) eller endda livmoderhalskræft [3]. Adskillige cofaktorer påvirke overgangen fra første HPV-infektion til livmoderhalskræft, herunder livsstil, vært immunrespons, og genetisk modtagelighed [4], [5]. De vigtige roller genetiske faktorer i livmoderhalskræft patogenese bliver bedt af resultaterne, at livmoderhalskræft udviser en betydelig familiær klyngedannelse og de første grads slægtninge til patienter har dobbelt risiko for at udvikle kræft [6]. Et par risikovægtede modulerende varianter for livmoderhalskræft er blevet identificeret af en kandidat gen forening undersøgelse. De gener, der er forbundet med livmoderhalskræft modtagelighed er involveret i DNA-reparation, cellecyklussen og apoptose, celleproliferation og differentiering, det humane leukocyt antigen-system og immunresponser [7], [8].

Nyt overbevisende dokumentation angiver, at polymorfismer i microRNA (miRNA) bindingssteder cancerrelaterede gener er en vigtig kilde, som huser de forårsagende genetiske varianter af cancer [9]. miRNA, ofte 19-25 nucleotid-længde kodende RNA, binder inden for 3′-utranslaterede region (UTR) af transskriptioner af målrettede gener til at inhibere og endda afskaffe dens oversættelse til protein. Det skønnes, at ca. 30% af humane gener reguleres af miRNA [10]. Gene deregulering er en af ​​de vigtigste mekanismer, som celler kan udvikle sig til kræft [11]. miRNA kan deltage i carcinogenese via post-transkriptionel regulering af mange cancerrelaterede gener, herunder onkogener og tumorsuppressorgener. Den afvigende ekspression af miRNA bidrager til ætiologien af ​​forskellige cancertyper, herunder livmoderhalskræft [12]. miRNA profil analyse af livmoderhalskræft afslørede, at Mirs-9, 21, 135b, 146a, 199a, 203 og 205 er ofte overudtrykt i cancer væv eller cellelinjer [12]. Desuden MIR-205 virker som et onkogen til at fremme celleproliferation og migrering af humane cervikale cancerceller [13]. I modsætning hertil MIR-214 direkte målretter GALNT7 genet til at undertrykke vækst og invasivitet af cervikale cancerceller ved at fungere som en tumorsuppressor en tumor suppressor [14]. Den basepar ændringer inden for miRNA-målregionen af ​​cancerrelaterede gener kan ødelægge eller skabe et bindingssted eller ændre bindingsaffinitet og post-transkriptionel kontrol af mRNA ved miRNA, og derfor kunne påvirke transformationen fra normale celler til cancerceller [9].

Bioinformatik analyse har identificeret mange SNPs, der er placeret i de formodede miRNA bindingssteder af kræft kandidatgener og der væsentligt påvirker bindingsenergien af ​​formodede miRNA :: mRNA dobbelthuse [15]. En lille del af dem er blevet yderligere vist sig at ændre ekspressionen af ​​målgener ved luciferase reporter assay og vise en signifikant forbindelse med modtagelighed for cancer [16], [17]. Landi et al. frasorteret 57 SNPs inden miRNA-bindingssteder fra 104 kandidatgener for colorectal cancer, fundet otte SNP’er af dem viser forskellige Gibbs frie bindingsenergi mellem de to alleler af hver SNP, og endelig viste en SNP, rs17281995, inden for miRNA-bindende steder af CD86, som den risikofrie modulerende variant for tarmkræft [16]. Anvendelse af en lignende forskningsstrategi, SNPs inden miRNA bindingssteder til andre vigtige cancer kandidatgener, såsom DNA reparation gener [17], integrin gener [18] og caspase-gener [19], er også blevet identificeret og yderligere bedømt som modtagelighed varianter for blærekræft, brystkræft, tarmkræft, og hoved- og halskræft risiko. For nylig, Shi et al. viste, at rs11064 G-allelen i

TNFAIP8

gen svækker bindingsaffiniteten af ​​miR-22 til TNFAIP8 3’UTR og er forbundet med en øget risiko for livmoderhalskræft [20], hvilket tyder på, at miRNA- bindingssteder er også de hot spots, som skjuler livmoderhalskræft modtagelighed varianter.

i den foreliggende undersøgelse, søgte vi at identificere nye risici varianter for livmoderhalskræft blandt miRNA målgruppen steder i cancer-relaterede gener. Ved at gennemgå litteraturen og bioinformatik databaser, fandt vi 37 cancer-relaterede gener med variationer i formodede 3′-UTR miRNA bindingssteder. Foreningen styrken af ​​disse varianter med livmoderhalskræft blev vurderet ved en to-trins case-kontrol undersøgelse. For den tilhørende variant, blev dens funktionelle indflydelse på miRNA-medieret udtryk regulering af målgener undersøgt ved hjælp af luciferase reporter analysen.

Materialer og metoder

1 studiepopulation

Vi rekrutterede 840 patienter med livmoderhalskræft fra de patienter, der modtog døgnbehandling i tre hospitaler mellem maj 2008 og april 2012. Blandt dem, 338 fag fra Liaocheng Folkets Hospital (LCPH) blev brugt i første etape undersøgelse (studie 1), som undersøgte alle af de udvalgte SNP’er og 502 fag fra The First Affiliated Hospital i Xian Jiaotong Universitet (TFAHXJTU) og mødres og børns sundhed Hospital i Shaanxi-provinsen (MCHHSP) blev anvendt i andet trin undersøgelse (studie 2), som var at kopiere bemærkelsesværdige fund (

P

0,05) fra Studie 1. Alle patienterne blev diagnosticeret ved histologisk undersøgelse af biopsi under colposcope og /eller resektion væv. Den kliniske fase og histologisk type livmoderhalskræft af patienterne blev indsamlet fra journaler og er vist i tabel 1. I alt 934 raske kontrolpersoner blev rekrutteret fra de kvinder, der rutinemæssigt deltog fysisk undersøgelse i disse tre hospitaler, 334 fag fra LCPH i Study 1 og 600 emner fra TFAHXJTU og MCHHSP i Studie 2. Alle kontrollerne havde ikke tidligere neoplastisk eller cancer-associeret sygdom, og de havde normal cervikal cytologi i mindst to på hinanden følgende årlige undersøgelser. Alle forsøgspersonerne var genetisk uafhængige, og deres alder, race, rygning status, socioøkonomisk status, og ægteskabelig status blev også undersøgt ved at læse journaler eller ved interviews. Denne undersøgelse blev godkendt af Medical etiske komitéer af LCPH, TFAHXJTU, og MCHHSP og alle deltagerne gav skriftlige godkendelse.

2 Polymorfi udvælgelse og genotype

Tidligere undersøgelser har systematisk gennemgået de SNP’er i miRNA bindingssteder mange cancerrelaterede gener. Kort fortalt de først screenet cancer-relaterede gener ved database og litteratursøgning, og derefter, de identificerede de formodede miRNA target sites i disse gener af specialiserede algoritmer (såsom miRBase, Miranda, PicTar og Targetscan) og valgt de SNPs der er placeret på den miRNA-bindingssteder ved dbSNP søgning og BLAST endelig identificere SNPs hvis alleler gør målsekvensen har betydeligt differential bindende energi til miRNA i en computer prædiktiv model [16], [18]. Fordi mange kræftrelaterede gener deles af flere kræftformer [21], valgte vi SNPs fra den tidligere litteratur, der dækker emner om miRNA-bindingssted /miRNA target sites, polymorfier og kræft /tumor. MEDLINE /PubMed-databasen blev søgt at finde litteratur, der blev offentliggjort fra 2000 januar til 2013 af januar. Vi endelig udvalgt 41 SNPs i forudsagte miRNA-bindingssites inden for 37 cancerrelaterede gener med mindre allelfrekvenserne mere end 0,1 i den kinesiske Han-populationen (tabel 2). Genomisk DNA blev ekstraheret fra perifere blodleukocytter vha Blood DNA Midi Kit (Omega Biotech, Norcross, USA), ifølge fabrikantens protokol. De valgte SNP’er blev genotype hos patienter og kontroller ved hjælp af MALDI-TOF i MassARRAY systemet (Sequenom Inc., San Diego, CA, USA) [22].

3 HPV genotype

Menneskelig HPV fra livmoderhalsen skrabning smear og /eller resektion væv blev genotypebestemmes hjælp HPV GenoArray testkit (HybriBio Ltd, Guangdong, Kina). Først blev HPV-DNA forstærkes med L1 konsensus HPV primere MY09 /MY11 og HMB01. Derefter PCR produktet forarbejdet gennemstrømning hybridisering på samme måde som en macroarray format med en nylonmembran hvorpå HPV genotypespecifikke oligonukleotidprober blev immobiliseret. Denne teknik kan identificere 21 HPV genotyper, herunder 5 lavrisiko-typer (6, 11, 42, 43 og 44), 14 højrisiko typer (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52 , 56, 58, 59, 66, og 68), og 2 mellemliggende-risiko typer (CP8304 og 53).

4 Serum IL-16 niveauer

patienternes og kontroller blod prøver blev opsamlet mellem 8 og 10 am seraene blev centrifugeret ved 3000 rpm i 10 min og nedfrosset ved -80 ° C. Serum IL-16-niveauer blev målt ved hjælp af kommercielt tilgængelige enzymbundne immunosorbent assay (ELISA) kits (PIERCE Endogen) ifølge producentens anvisninger. Det minimum af påvisning for IL-16 var 0,10 pg /ml. Ingen cross-detektion af andre cytokiner blev observeret. Den intra-assay variation var. 10%

5 Celledyrkning

Humane livmoderhalskræft cellelinjer, HeLa [23] og SiHa [24], blev købt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Disse celler blev dyrket i Dulbecco modificeret Eagle-medium suppleret med 100 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum og blev dyrket ved 37 ° C i en befugtet 5% carbondioxid-inkubator.

6 Transiente transfektioner og luciferaseassays

3′-UTR af IL-6-mRNA, herunder C-allel eller T allel af rs1131445, blev amplificeret under anvendelse af primerne 5′-TGGCCTGGGCCTCCTCACAA-3 ‘(fremad) og 5’CTCCACCACCCTTCCCTA -3 «(tilbage). De amplificerede fragmenter blev derefter klonet ind i nedstrøms for ildflue-luciferase-genet i pGL3-Basic Vector (Promega, Madison, USA). Disse rekombination plasmider blev sekventeret for at bekræfte deres nøjagtighed. For luciferase reporter assays, blev HeLa og SiHa udpladet i skåle med 24 brønde skal co-transficeret med 100 ng pGL3-C eller pGL3-T-konstruktioner, 50 pmol /pi kemisk syntetiseret miRNA MIR-135b (GenePharma, Shanghai, Kina) eller negative kontrolprøver miRNA under anvendelse af lipofectamin 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, USA). I hver transfektion blev 20 ng pRL-TK-plasmidet (Promega, Madison, USA) anvendes til at korrigere for transfektionseffektivitet. Hver transfektion blev udført tre gange. Celler blev opsamlet 48 timer efter transfektion, og luciferaseaktiviteten blev målt med en dual-Luciferase reporter assaysystem (Promega, Madison, USA) og normaliseret mod aktiviteten af ​​Renilla luciferase genet.

7. Statistisk analyse

Vi beregnede statistiske styrke som tidligere beskrevet [25]. En χ

2 test blev udført for at foretage en sammenligning af de kategoriske variabler, herunder genotype frekvens og nogle demografiske karakteristika. T-test, Mann-Whitney U-test eller variansanalyse blev udført for at sammenligne de kontinuerlige variabler, såsom alder, serum IL-16-niveau og reporterekspression niveau, når det er hensigtsmæssigt. Foreningerne mellem

IL-16

varianter og livmoderhalskræft risiko blev anslået ved at beregne disse regioner og deres 95% kreditinstitutter fra multivariat logistisk regressionsanalyser med en justering for alder, BMI, rygning status og familie historie af kræft. For at undgå en falsk forening forårsaget af flere forsøg, blev det falske positive rapport sandsynlighed (FPRP), beregnet efter den af ​​Wacholder et al. [26]. Vi sætter 0,2 som en FPRP tærskel og tildelt en forudgående sandsynlighed på 0,01 for at detektere en OR på 1,50 (for de risikofaktorer effekter) eller 0,67 (for de beskyttende virkninger) for en forening med SNPs eller klinisk-demografiske træk. Den Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) af SNPs blandt kontrollerne blev evalueret af χ

2 test. Alle de statistiske analyser blev udført af SPSS (version 13.0, Chicago, IL, USA). En værdi på

P

. 0,05 blev anset for at være signifikant (to-halet)

Resultater

1 befolkningskarakteristika

Vi analyserede i alt 840 patienter med livmoderhalskræft og 934 kontroller i studie 1 og 2. de demografiske og kliniske karakteristika for patienter og kontroller er vist i tabel 1. Der var ingen signifikant forskel i fordelingen af ​​alder, race, rygning status, uddannelsesniveau, og ægteskabelig status mellem kontrollerne og sagerne i Studie 1, Studie 2 og alle de emner tilsammen. Men tilfældene var mere tilbøjelige til at være yngre i en alder ved første levering (

P

= 0,038) og med HPV-infektion (

P

0,001) end kontrollerne. HPV-infektion stadig forblev signifikant associeret med livmoderhalskræft efter overvejelse af den FPRP der var mindre end 0,2. Disse to variabler blev yderligere justeret for eventuel residual confounding effekt i senere multivariat logistisk regressionsanalyse.

2 Foreningen af ​​SNPs inden miRNA-bindingssteder af cancer-relaterede gener med livmoderhalskræft risiko

Mere end 99% af prøverne blev genotype succes for hver SNP, og replikat eksperiment for tilfældigt udvalgte 300 prøver erhvervet helt konsistente genotypedata med den oprindelige analyse. Tabel 2 viser en liste over udvalgte SNPs inden for miRNA-bindende sites i 3′-UTR af 37 kræftrelaterede gener, det bindende miRNA, at de potentielt påvirke, og deres genotypefrekvenser og foreninger med livmoderhalskræft i Studie 1. Alle de observerede genotype distributioner blandt kontrol af Studie 1 var på linje med HWE. Blandt de 41 SNPs, der var inkluderet i Studie 1, fem SNPs (rs465646 i

REV3L

gen, rs2239680 i

BIRC5

gen, rs1476215 i

FGF2

gen, rs3213180 i

E2F1

gen, rs1131445 i

IL-16

gen) udviste en markant anderledes genotype fordeling mellem de sager med livmoderhalskræft og kontroller (

P

= 0.003~0.030). For at bestemme, om der forelå sande signifikante sammenhænge, ​​eller om der var falske resultater, vi udførte en gengivelse for at analysere disse SNPs i en anden befolkning, der bor i Shaan Xi-provinsen i det nordlige Kina. I undersøgelse 2, deres observerede genotypefrekvenser var også i overensstemmelse med HWE (tabel 3). Desuden fandt vi, at kun

IL-16

rs1131445 viste fortsat en signifikant sammenhæng med livmoderhalskræft. De forsøgspersoner med sin TC eller CC-allelen havde en øget risiko for livmoderhalskræft (justeret OR = 1,51, 95% CI 1,18-1,93,

P

= 0,001) med en justering for alder, rygning status, uddannelsesniveau, alder ved primiparity, civilstand, og HPV-infektion status. Sammenhængen mellem rs1131445 og livmoderhalskræft var mere markant i data, der kombineret Undersøgelse 1 og 2 (justeret OR = 1,49, 95% CI 1,22-1,81,

P

= 0,00007) med justering for de førnævnte variabler. Vi derefter beregnede FPRP værdier for alle de observerede signifikante sammenhænge. Når antagelsen om forudgående sandsynlighed var 0,01, foreningen med

IL-16

rs1131445 (TC /CC vs.TT) stadig var bemærkelsesværdigt i begge Studie 1 fag (FPRP = 0,171) og alle fag (FPRP = 0,011). Givet en OR på 1,5 ved en nominel

P

= 0,05 for genotypefrekvenser spænder 0,20 til 0,40, den statistiske styrke af vores undersøgelse at opdage en sammenslutning af hver SNP med livmoderhalskræft i Studie 2 og kombineret Studie 1 og 2 blev anslået til 81,0 til 91,5% og 95,0 til 98,9%, hhv. Den lagdeling analyse viste ikke en signifikant interaktion af de demografiske og kliniske karakteristika og rs1131445 genotypen på livmoderhalsen kræftrisiko (data ikke vist). Derudover er der ikke var signifikante sammenhænge mellem genotyper af rs1131445 og den kliniske fase og histologiske type livmoderhalskræft (data ikke vist).

3 Serum IL-16-niveau og dens sammenhæng med

IL-16

rs1131445 genotype

i betragtning af den observerede bemærkelsesværdig sammenhæng mellem rs1131445 og livmoderhalskræft risiko, vi yderligere undersøge serum IL-16 niveauer i kontroller og patienter med livmoderhalskræft samt den potentielle lovgivningsmæssige virkninger af rs1131445 genotypen på serum IL-16. Vi valgte 100 patienter med livmoderhalskræft og 80 kontroller fra fagene Studie 2 og undersøgt deres serum IL-16 niveauer ved ELISA. Serum IL-16 af patienter med livmoderhalskræft betydeligt øget sammenlignet med kontroller (

P

= 0,001, figur 1A). Desuden patienter med livmoderhalskræft, var der en markant korrelation mellem serum IL-16 og rs1131445 genotype (

P

= 0,001). De rs1131445 C allel-transporterer patienter havde en højere serum IL-16 end ikke-bærere (

P

0,05, figur 1B). Desuden har vi ikke konstatere nogen statistisk signifikant sammenhæng af serum IL-16 med det kliniske fase og histologisk type livmoderhalskræft (data ikke vist).

A. Serum IL-16-niveauer i kontroller og patienter med cervixcancer, som målt ved ELISA. B. Korrelationer af serum IL-16 niveauer med genotype i kontroller og patienter. Data blev udtrykt som middelværdien ± SEM. *

P

0,05 vs. kontrol gruppe. +

P

0,05 vs. patienter med TT genotypen

4 Effekten af ​​rs1131445 på samspillet mellem miR-135b og

IL-16

3. ‘-UTR

En formodet bindingssted i 3′-UTR af

IL-16

for miR-135b er blevet identificeret ved hjælp miRBase, Miranda, og PicTar software. Det blev også forudsagt, at substitutionen fra T til C-allelen i rs1131445 kunne mindske Gibbs frie bindingsenergi af miRNA-mRNA med 3,93 KJ /mol [16], hvilket tyder på, at denne SNP kunne påvirke

IL-16

genekspression ved ændring af miRNA-mRNA bindingsaffinitet (figur 2A). For at teste denne hypotese blev en luciferaseanalyse udført i HeLa- og SiHa livmoderhalskræft cellelinjer, der er transficeret med pGL3-C-allel eller pGL3-T-allel konstruktioner ledsaget af kemisk syntetiseret miRNA MIR-135b eller en negativ kontrol miRNA ( Figur 2A). For begge konstruktioner, i nærvær af MIR-135B efterligner, ekspressionen af ​​luciferase blev reduceret signifikant (figur 2B-C), hvilket bekræfter den funktionelle potentiale miRNA-mRNA interaktion. I modsætning hertil den negative kontrol miRNA uden forudsige bindingssted i

IL-16

3′-UTR har ingen effekt på den luciferase udtryk (figur 2B-C). Endvidere fandt vi, at C-allel resulterede i en beskeden, men statistisk signifikant stigning af luciferaseekspression sammenlignet med den af ​​T-allelen (figur 2B-C).

A. Skemaet for

IL-16

3′-UTR huser en formodet MIR-135b-bindingssted, stilling rs1131445, og konstruktionen af ​​pGL3-IL-16-3′-UTR-T /C. B og C. Relativ luciferaseaktivitet i nærvær af MIR-135b eller den negative kontrol miRNA er vist for

IL-16

3′-UTR med T-allel og C-allel i HeLa (B) og SiHa (C) cancerceller; data er vist som procentdelen i forhold til luciferaseaktiviteten af ​​celler transficeret med NC og T-allel; fejlen søjle repræsenterer s.e. fra tre uafhængige forsøg; *

P

0,05, **

P

0,05, ***

P

0,01. NC repræsenterer den negative kontrol.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi screenet en livmoderhalskræft modtagelighed variant fra miRNA-bindingssted SNPs inden for 37 cancer-relaterede gener ved en to-trins undersøgelse. Vi fandt, at SNP rs1131445 C allel i 3′-UTR af

IL-16

var forbundet med en øget risiko for cervikal cancer. Ved hjælp af en luciferase assay fandt vi, at miRNA-135b markant nedsat luciferase ekspression af pGL3-IL-16-3′-UTR-konstruktioner i Hela og SiHa cervical cancer cellelinjer. Endnu vigtigere, blev disse inhiberende virkninger af miRNA-135b svækket ved substitution fra T til C allel i rs1131445. Disse resultater understøtter den hypotese, at variationerne i de formodede miRNA målsteder kan udgøre en modtagelighed faktor for livmoderhalskræft.

IL-16 syntetiseres ved forskellige immun og parenchymale celler, herunder CD4 og CD8 T-celler, eosinofiler, makrofag /dendritiske celler, mastceller, bronkieepitel, og fibroblaster [27]. Proteinet direkte oversat fra

IL-16

mRNA er en precursor molekyle og skal spaltes til to fragmenter af caspase-3. Den spaltede bioaktive IL-16 er frigivet efter stimulering med histamin eller serotonin og virker som en kemoattraktant faktor til at regulere inflammatoriske respons [27]. For nylig har IL-16 blevet anerkendt som en vigtig fremme faktor for tumorer [28], [29], [30], [31]. Produktionen af ​​IL-16 korrelerer med indtræden og progression af forskellige hæmatopoietiske cancere og faste cancere [28]. Den konstitutive IL-16-ekspression har også vist sig at opregulere i gliomer [29] og prostatacancer [31]. Desuden blev dets ekspression i prostatakræft væv korreleret til tumor aggressivitet og biokemisk tilbagefald af sygdommen [31]. Serum IL-16-niveau elevation er blevet observeret i flere cancertyper [32], [33]. Serum IL-16 er et prædiktor for udvikling af fjerne metastaser af brystcancer [32]. Desuden i brystkræft, opregulering af udskilt IL-16 øger infiltration af monocytter i tumorvæv [30].

roller IL-16 i livmoderhalskræft patofysiologi stort set uklar. Vores resultater af serum IL-16 elevation efter cervikal carcinogenese og bemærkelsesværdige sammenslutning af

IL-16

med livmoderhalskræft kræftrisiko tyder på, at IL-16 kunne regulere cervikal carcinogenese. Denne hypotese understøttes af de kræftfremkaldende virkninger af vedvarende betændelse på livmoderhalsen. Immuncelle infiltration i tumorer er en kritisk determinant for cervikal carcinogenese [30], [34]. Den makrofag infiltrerer i livmoderhalsen stiger lineært med cervikal sygdomsprogression, fra normal cervix, lav kvalitet til høj kvalitet planocellulære intraepithelial læsioner, til invasiv cancer [35]. Tumorassocierede makrofager bidrager til tumorudvikling ved at udøve deres mange funktioner i tumorcelleproliferation, tumorcelleinvasion, og tumor angiogenese [36]. Udover makrofager, CD4

+ regulatoriske T-celler kan bidrage til carcinogenese ved at begrænse effekten af ​​T-celle-immunresponser mod cancere [37]. I livmoderhalskræft, HPV-specifikke CD4

+ T-celler undertrykker cytokin (IFN-γ, IL-2) produktionen at interferere med immunresponset antitumorvirkning [38]. IL-16 kan udtrykkes ved epitelceller under inflammatoriske tilstande [39], og tjener til at chemoattract monocyptes /makrofager og CD4

+ T-celler til infektion site [40]. Endvidere secerneres IL-16 stimulerer monocyptes /makrofager til at producere forskellige proinflammatoriske cytokiner [41]. Det er derfor plausibelt, at opregulering af IL-16 i HPV-induceret inflammation kan fremme carcinogenese ved hyperfunction af makrofager, HPV-specifikke CD4

+ T-celler eller andre inflammatoriske celler.

Her vi giver den første bevis på, at rs1131445 i miR-135b bindingssted af

IL-16

3′-UTR, som kan påvirke IL-16 protein-ekspression ved at forstyrre miR135b undertrykkende funktion, var signifikant forbundet med risiko af livmoderhalskræft. Et funktionelt assay in vitro viste, at transfektion af HeLa og SiHa-celler der bærer

IL-16

3′-UTR med MIR-135b efterligne reducerer ekspressionen af ​​luciferase, hvilket antyder, at IL-16 kunne målrettes betydeligt af mIR-135b. Den rs1131445 T til C ændring hæmmer interaktionen af ​​miR-135b med

IL-16

3′-UTR og opregulerer sit udtryk. I overensstemmelse med denne spekulation, afslørede in vivo analyse, at patienter, der bærer rs1131445 C-allelen havde en højere serum IL-16 end ikke-bærere, hvilket førte til en forhøjet serum IL-16 patienter sammenlignet med raske kontrolpersoner. Opregulering af MIR-135b er blevet fundet i livmoderhalskræft [42], som kan inhibere ekspressionen af ​​

IL-16

ved at målrette dens 3′-UTR. Den rs1131445 C allel svækker bindingen af ​​miR-135b til målet og fører til højere konstitutiv ekspression af

IL-16

efterfølgende frigivelse til serum. I betragtning af de vigtige regulatoriske roller IL-16-frigivelse i immunresponset og den deraf følgende grad af den lokale inflammatoriske mikromiljø, vil personer, der bærer rs3134615 C allel forventes at have forhøjet risiko for cervikal cancer. Som konklusion foreslog vores data, at rs1131445, som en funktionel variant, kunne modulere den individuelle risiko for livmoderhalskræft sandsynligvis ved at deregulere den post-transkriptionel regulering af miRNA-135b på

IL-16

udtryk. Selvom vores undersøgelse brugte rimelige antal patienter og kontroller og strenge statistiske metoder, kunne vi ikke helt udelukke muligheden for, at falske resultater at vores case-kontrol forening studiedesign skyldes tilfældigheder eller befolkning lagdeling. Derfor er yderligere skala replikering stor undersøgelse ved hjælp af forskellige etniske befolkningsgrupper, eller familie-baseret analyse, eller prospektive kohorte design kræves for at producere meget afgørende resultater. Yderligere funktionelle analyser er også forpligtet til at afklare de præcise roller IL-16 i livmoderhalskræft tilblivelse og progression i fremtiden.

Tak

Vi er dybt værdsætte alle de patienter og frivillige til at deltage i denne undersøgelse.