PLoS ONE: caveolae Bidrage til Apoptose Resistance induceret af den a1a-adrenoceptor i Androgen-Uafhængig Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Under vækst og overlevelse androgen ablation prostata kræftceller ‘blive uafhængige af normale reguleringsmekanismer. Disse androgen-uafhængige celler erhverver den bemærkelsesværdige evne til at tilpasse sig det omgivende mikromiljø hvis faktorer, såsom neurotransmittere, påvirke deres overlevelse. Selvom resultaterne bliver tydeligt om ekspressionen af ​​a

1A-adrenoceptorer i prostatakræft epitelceller, er endnu ikke etableret deres nøjagtige funktionelle rolle i androgen-uafhængige celler. Tidligere arbejde har vist, at membranen lipidklumper forbundet med centrale signalering proteiner mægle vækst og overlevelse signalveje i prostata kræftceller.

Metode /vigtigste resultater

For at analysere membran topologi af α

1A-adrenoceptor vi undersøgt sin tilstedeværelse ved en biokemisk fremgangsmåde i oprenset detergent resistente membranfraktioner af androgen-uafhængig prostatacancer-cellelinie DU145. Elektronmikroskopi observationer demonstrerede colocalisation af α

1A-adrenoceptor med caveolin-1, den væsentlige proteinkomponent i caveolae. Desuden viste vi, at agonist stimulering af α

1A-adrenoceptor induceret resistens mod thapsigargin-induceret apoptose og at caveolin-1 var nødvendig for denne proces. Endvidere immunohistofluorescence afslørede forholdet mellem høje niveauer af α

1A-adrenoceptoren og caveolin-1-ekspression med fremskreden prostatacancer. Vi viser også ved immunoblotting, at TG-induceret apoptose modstand beskrevet i DU145 celler medieres af ekstracellulære signal-regulerede kinaser (ERK).

Konklusioner /Betydning

Som konklusion, vi foreslår, at α

1A-adrenoceptor stimulation i androgen-uafhængige prostatacancerceller

via

caveolae udgør en af ​​de mekanismer, der bidrager til deres beskyttelse mod TG-induceret apoptose

Henvisning:. Katsogiannou M, Boustany CE , Gackiere F, Delcourt P, Athias A, Mariot P, et al. (2009) caveolae Bidrage til Apoptose Resistance induceret af α

1A-adrenoceptor i Androgen-Uafhængig Prostata Cancer Cells. PLoS ONE 4 (9): e7068. doi: 10,1371 /journal.pone.0007068

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Juni 2, 2009; Accepteret: August 25, 2009; Udgivet: 18 September, 2009

Copyright: © 2009 Katsogiannou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den franske Forskningsministeriet Universitet Lille 1, INSERM og Région Nord-Pas de Calais samt Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité du Nord) og foreningen pour la Recherche sur le Cancer (ARC) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er en af ​​de mest almindelige former for kræft hos mænd og den anden årsag til kræft dødsfald i industrialiserede lande [1]. Forskellige faktorer, såsom androgener og vækstfaktorer regulerer epitelcelleproliferation og apoptose i det normale prostata og tidlig-fase prostatacancer (PSA). Androgen ablation er i øjeblikket den førende terapi anvendes til at blokere væksten af ​​androgenafhængige cancerceller. Men PCA cellernes proliferation og overlevelse ofte blive uafhængige af reguleringsmekanismer, der fører til et hormon-refraktær sygdom [2], som der er i øjeblikket ingen vellykket terapi. Androgen-uafhængige PCA celler har den bemærkelsesværdige evne til at tilpasse sig det omgivende mikromiljø hvis indflydelse på intracellulære overlevelse veje er fortsat genstand for debat [3]. Faktisk PCA cellerne er i kontakt med forskellige faktorer, såsom hormoner, vækstfaktorer og neurotransmittere, som menes at påvirke fysiologien af ​​disse celler. Blandt andet har interessen været vist for endogene catecholaminer noradrenalin og adrenalin. Faktisk subepiteliale stroma af prostata er særlig rig på autonome nerver og α

1-adrenoceptorer (α

1-AR). Den α

1A-AR-undertypen, især findes i glatte muskelceller, men dets ekspression er også blevet beskrevet i epitelceller [4], [5]. Den α

1A-AR er et medlem af superfamilien af ​​G-protein-koblede receptorer (GPCR) mediere handlinger af ovennævnte catecholaminer i en række celler [6].

α

1 AR antagonister anvendes allerede til den kliniske behandling af benign prostatahyperplasi (BPH) [7], hvor deres terapeutiske fordele tilskrives en direkte virkning på α

1-AR til stede i prostata glatte muskelceller [8]. Imidlertid har flere undersøgelser fremlagt beviser på yderligere virkninger af α

1-AR-antagonister såsom doxazosin på langsigtet BPH behandling. Disse midler har vist sig at inhibere prostatavækst ved at inducere apoptose i stromale og epiteliale celler og dukker op som potentielle behandlinger til forebyggelse og behandling af androgen-uafhængig PCa [9], [10], [11]. Desuden tidligere undersøgelser fra kolleger på human prostatacancer epitel (hPCE) celler og androgen-afhængige prostatacancer LNCaP viste, at phenylephrin (PHE), en α

1A-AR agonist, stimulerer deres proliferation [12 ], [13]. På trods af disse lovende resultater, er endnu ikke etableret funktionelle rolle af α

1A-AR i androgen-uafhængige PCA celler.

Det er blevet beskrevet, at signal- og handel med adskillige GPCR er reguleret af specialiserede plasmamembran-domæner kendt som lipidklumper [14]. Desuden har de seneste data om cardiomyocytter vist, at α

1-AR samt de involveret i signaltransduktionsvej molekyler akkumuleres i caveolae, en underklasse af membran mikrodomæner [15], [16]. Caveolae er 50-100 nm kolbe-formet plasmamembran invaginationer, kendetegnet dels ved et højt indhold af kolesterol og glycosphingolipider og på den anden side ved tilstedeværelsen af ​​caveolin-1 (CAV-1), de store konstitutive protein på 20-25 kD [17]. Interessant nok har CAV-1 blevet forbundet med mange sygdomme, såsom atherosklerose og Alzheimers sygdom [18], [19]. Vedrørende sin rolle i kræft, er det blevet fastslået, at PCa er forbundet med øget CAV-1-ekspression [20]. Faktisk har dette protein blevet identificeret som en markør forbundet med PCa progression og hormon-refraktær sygdom, spiller en afgørende rolle i androgen-uafhængige PCA-celler [21]. Med sit samarbejde med specifikke receptorer og enzymer på plasmamembranen, kan CAV-1 være en direkte mediator af overlevelse, vækst og metastase signaler i PCA celler [22].

Til dato, ikke meget er kendt om mekanismerne bag neurotransmittere involveret i overlevelse PCA celler, lad-alone rolle α

1A-AR i androgen-uafhængige epitelceller og PCa progression. I denne forbindelse er det fristende at knytte tilstedeværelsen af ​​α

1A-AR og CAV-1 og at hypotesen, at den α

1A-AR kunne mægle

via

caveolae dets funktionelle virkninger på vækst eller overlevelse af avancerede fase PCA celler.

Formålet med vores arbejde var derfor at undersøge den rolle, α

1A-AR i androgen-uafhængige PCA celler. Her undersøger vi tilstedeværelsen af ​​α

1A-AR i caveolae af DU145 celler, en androgen-uafhængig PCa cellelinie afledt fra hjerne metastaser. Vi analyserer konsekvensen af ​​α

1A-AR stimulering med PHE på receptoren og CAV-1 membran distribution samt dens virkning på lipidsammensætningen af ​​membranbærer fraktioner oprenset fra DU145 celler. Endvidere beskriver vi effekten af ​​PHE i apoptose modstand af disse celler ved aktivering af ERK og vores resultater kraftigt antyde involveringen af ​​caveolae i denne signalvej. Endelig ved immunohistofluorescence og RT-PCR, vi observere en positiv korrelation mellem α

1A-AR og CAV-1-ekspression og avancerede trin PCa. Tilstedeværelsen af ​​α

1A-AR-rige caveolae kunne derfor bidrage til den generelle apoptose modstand kendetegner androgen-uafhængig prostatavæv.

Metoder

Cell kultur

androgenuafhængig human prostatacancer-cellelinie DU145, opnået fra American Type Culture Collection, blev holdt i kultur i RPMI 1640 medium (Life Technologies, Inc) suppleret med 10% (v /v) FCS (Seromed, Poly-Labo, Strasbourg , Frankrig), 5 mM L-glutamin og 2 mM kanamycin (Sigma). Celler blev rutinemæssigt dyrket i 50 ml kolber (Nunc, PolyLabo, Strasbourg, Frankrig) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2-95% luft atmosfære. Disse celler udgør en passende model for hjernens metastatiske cancerceller stede i hormon-refraktær prostatakræft.

Cell transfektioner og generering af CAV-1 knock-down DU145 cellelinje

To klar-til- bruge siRNA’er mod α

1A-AR (siADR1A, Eurogentec) blev kortvarigt transficeret (50 nM) med HiPerfect Transfektion Reagent (Qiagen) i DU145 celler. Kontrol siRNA (siCTL) blev udført ved transfektion siRNA mod Luciferase

siLuciferase (siCTL):. 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3 ‘. siADR1A-1 (blanding af): 5’-CAGGAAAGAUGCAGAGGA-3 ‘og 5′-UUCCUCUGCAUCUUUCCU-3’. siADR1A-2 (blanding af):. 5′-GCGUCUACGUGGUGGCCA-3 ‘og 5′-UUGGCCACCACGUAGACG-3’

Stabile cellelinjer blev opnået ved transfektion DU145-celler med en vektor, der koder pSUPER korte hårnål RNA (shRNA) mod CAV-1 (sekvens: CTGGAATAAGTTCAAATTCTT 2121 3’UTR) (DUshcav-1) (eller tom pSUPER vektor til kontrol cellelinie, DUshCTL) hjælp Nucleofector, som anbefalet af producenten (Amaxa GmbH, Köln, Tyskland). Vi transficerede 2 × 10

6 trypsinbehandlede DU145-celler med 3 ug vektor og derefter anvendt de transficerede celler til podning en plade 24 (Nunc) til meget lav densitet. Kloner underexpressing CAV-1 blev udvalgt på grundlag af deres antibiotikaresistens til puromycine og valideret af Western Blot.

Antistoffer og reagenser

Primære antistoffer anvendt til immunfluorescens (IF) mikroskopi og immunblotting (IB ) var: (1:100) kanin-anti-α

1A adrenoceptor (Santa Cruz Biotechnology), (1:100) kanin-anti-caveolin-1 (Santa Cruz Biotechnology), (1:50) muse anti-caveolin- 1 (BD transduktion Laboratories), (1:400) muse anti-β-actin (Sigma), (1:200) anti-calnexin (Chemicon, Millipore, Paris, Frankrig), (1:1000) muse anti-cytokeratin 18 (Chemicon, Millipore, Paris, Frankrig), (1:1000) kanin anti-PARP (Cell Signaling), (1:100) muse-anti-bax (6A7) (Santa Cruz Biotechnology) anerkendelse en udsat epitop af Bax i den aktiverede kropsbygning, (1:1000) kanin anti-procaspase 3 (UPSTATE), (1:1000) anti-phospho-p44 /42 MAP kinase og (1:1000) anti-P44 /42 MAP kinase (Cell Signaling). Sekundære antistoffer anvendt til IB var: (1:10000) peberrodsperoxidase-koblet anti-muse eller anti-kanin (Chemicon). For IF, vi brugte (1:1000) Alexa Fluor® 488-mærket og (1:2000) 546-mærkede sekundære antistoffer (Molecular Probes).

Cellerne blev behandlet med 10 pM L-phenylephrinhydrochlorid (PHE ), 1 pM prazosin (PRA) og 10 uM PD98059 i tre dage (fornyet hver 24 timer) og 10 uM thapsigargin (TG) i 48 timer i RPMI medium. Kortvarig PHE behandlinger blev realiseret i en opløsning indeholdende (mM): NaCl, 116; KCI, 5,6; CaCl

2, 1,8; MgCl

2, 1,2; NaHCO

3, 5; NaH

2PO

4, 1; HEPES, 20; pH 7,3. Alle kemiske produkter blev leveret af Sigma undtagen TG (Alomone) og PD98059 (Calbiochem).

Cellecyklusanalyse

Celler blev dyrket i tre 60 mm skåle pr tilstand og lægemidler blev påført som beskrevet over. Efter behandlingerne blev celler trypsinbehandlet, høstet og resuspenderet i 0,2 ml sterilt PBS. 1 ml kold 70% ethanol blev tilsat på cellesuspensioner medens der blev hvirvelbehandlet. Prøverne blev centrifugeret, vasket i sterilt PBS og derefter inkuberet med ribonuclease (2 ug /ml) i 15 min. Propidiumiodid (25 ug /ml til slut i PBS-Triton X-100 0,1%) blev derefter tilsat og fik lov at inkubere i yderligere 30 minutter. DNA-indhold blev målt ved at excitere propidiumiodid ved 488 nm og måling af emission ved 520 nm (FL3) under anvendelse af en flowcytometer (Beckman Coulter Epics XL4-MCL med Expo32 konvertering). Forsøg blev gentaget fire gange.

Western Blot

Celledyrkningsmediet blev kasseret, og kolber blev vasket med isafkølet PBS. Cellulære proteiner blev derefter ekstraheret under anvendelse RIPA buffer [1% (volumen /volumen) Triton X-100, 1% (vægt /volumen) Na deoxycholat, 150 mM NaCl og 20 mM natrium- eller kaliumphosphat, pH 7,2] med 5 mM EDTA og anti-proteaser cocktail (P8340, Sigma) i 30 minutter på is. Efter skrabning blev alt uopløseligt materiale fjernet ved centrifugering ved 30000 x

g

i 10 minutter ved 4 ° C, og mængden af ​​protein blev vurderet af BCA-metoden (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA). Lige store mængder proteiner blev underkastet SDS /PAGE (16% geler). Endelig blev proteinerne overført til nitrocellulosemembraner under anvendelse af en halvtør elektro-blotter (Bio-Rad). Efter 1 time mætning i 5% fedtfri mælk (eller 5% BSA (bovint serumalbumin) kun for anti-phospho-p44 /42 MAPK), membraner blev inkuberet natten over med fortyndede primære antistoffer (se “Antistoffer og reagenser”). Membranerne blev derefter vasket (3 x 10 min) med en TNT-buffer (15 mM Tris /HCl, pH 8, 140 mM NaCl og 0,05% Tween 20) og behandlet med de tilsvarende peberrodsperoxidase-koblet sekundære antistoffer (anti-mus eller anti-kanin, Pierce), (1:10000) fortyndet i TNT /mælk (eller TNT /BSA) i 1 time ved stuetemperatur. Efter flere vaske i TNT-buffer, blev membranerne behandlet til kemiluminescerende påvisning under anvendelse Super Signal West Dura kemiluminescerende substrat (Pierce) ifølge producentens instruktioner. Membranerne blev endeligt eksponeret for X-Omat AR-film (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA). Intensiteten af ​​signalerne blev evalueret ved densitometri og semi-kvantitativt ved brug af forholdet for hver prøve mellem intensiteten af ​​proteinet af interesse divideret med actin eller calnexin intensitet. Hvert eksperiment blev gentaget mindst to gange.

Isolering af Vaskemiddel Resistant Membraner (DRM) og Dot blot

Celler blev skyllet, kasseres, centrifugeret, og supernatanten blev fjernet. Pelleten blev resuspenderet med isolation buffer B (ifølge Axis-Shield S33 Application Sheet) og homogeniseres med en Dounce homogenisator (Kontes) på 15 pm pistil clearance derefter centrifugeret i 10 minutter ved 1000 x

g

. Supernatanten svarer til rå lipidklump ekstrakt blev isoleret og 0,2% Triton X-100 blev tilsat. En diskontinuerlig 5-trins Optiprep® (Axis-Shield PoC AS) gradient blev dannet med buffer D (buffer B + 1% Triton X-100) (vægt /volumen) for at opnå 1,66 ml 35%; 2,5 ml 20%; 2,5 ml 15%; 2,5 ml 10%; 0,83 ml 5%. Rå lipidklump ekstrakt blev gjort tætte med saccharose (230 mg i 0,5 ml lysat) og lagt ved grænsefladen mellem gradienter 35% og 20%. Ultracentrifugering ved 165400 ×

g

i 4 timer ved 4 ° C i 50 Ti rotor (Beckman Coulter) blev efterfulgt af samling fra bunden op på 1,1 ml fraktioner. 1,1 ml 20% (v /v) TCA (trichloreddikesyre) tilsat til hver fraktion med henblik på at udfælde proteiner. Rør holdt på is i 20 minutter blev centrifugeret ved 10000 x

g

ved 4 ° C i 10 minutter. Bundfaldet blev vasket med methanol, centrifugeres derefter igen suspenderet i 4% (v /v) SDS. Da prøverne ikke var stærkt koncentreret i proteiner og detektion ved klassiske western blot var vanskeligt at opnå, prøver blev fyldt på nitrocellulosemembran i en 96-brønds Dot-Blot-enhed ifølge producentens instruktioner (Bio-Rad). Kort fortalt blev de ti fraktioner spottet på nitrocellulose membran i serie. Når tør, blev membranen inkuberet i blokeringsopløsning i 1 time (TNT /mælk) hybridiseres derefter med de ønskede antistoffer efter klassisk IB procedure som beskrevet ovenfor (se “Western Blot”). Forholdsregler blev derfor taget i at holde nogle vigtige faktorer konstant for de behandlede og ubehandlede betingelser. Celledensiteten anvendes til eksperimenterne var konstant og når kold ekstraktion detergent blev udført både koncentrationen af ​​detergentet og forholdet mellem koncentrationen celleantal /detergent var de samme. Hver brønd blev fyldt med 25 pi fra hver fraktion. Denne standardiserede metode blev gentaget mindst tre gange og blev brugt til at vurdere ændringer i opdelingen af ​​et målmolekyle i DRM, undgå falske skøn, når baseret på de relative mængder med hensyn til alle andre molekyler til stede.

Kvantificering af phosphatidylcholin (PC) og sphingomyelin (SM)

Lipider blev ekstraheret ifølge fremgangsmåden ifølge Folch et al. [23]. Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC Sigma), dimyristoylphosphatidylserine (DMPS Avanti Polar Lipids), lauroylsphingomyelin (LSM Avanti Polar Lipids) blev anvendt som interne standarder. Phospholipid analyse blev udført på en Hypersil Si 2 x 200 mm søjle (Agilent Technologies, Massy, ​​Frankrig) følgende protokol [24]. Positive ESI-MS blev udført på et MSD 1100 Mass Spectrometer (Agilent Technologies). spænding Åbningen blev fastsat til 120 V, kapillær spænding på 3,5 kV, tørregassen (Nitrogen) flyde ved 8 l /min og scan spænder fra m /z 400 til 950. Integreret peak var som fra Ekstraherede ionchromatogrammer (EIC) for m /z = 700 til 950 ved retentionstiden (RT) af PC blev PS, SM divideret med EIC for m /z = 679 ved RT af DMPC, m /z = 681 ved RT af DMPS eller m /z = 647 ved RT af LSM. Niveauer blev bestemt ved sammenligning af dette forhold med en standardkurve for kendte mængder af phosphatidylcholin og sphingomyelin.

Kvantificering af kolesterol

Ekstraktion og forsæbning blev udført ifølge den tidligere beskrevne procedure [25] med nogle ændringer. Kvantificering af cholesterol udførtes under anvendelse af et HP6890 gaskromatograf udstyret med en HP7683 Injector og en HP5973 Mass Selective Detector (Agilent Technologies). Kromatografi blev udført under anvendelse af en HP-5MS kvartsglas kapillarkolonne (30 m × 0,25 mm indre diameter, 0,25 um filmtykkelse, Agilent Technologies). En udvalgt ion-overvågningsprogram blev anvendt til massespektrometri. Ionerne anvendt til analyse (m /z) var som følger: epicoprostanol, 370; kolesterol, blev 368. Kalibreringskurver opnået ved at analysere standarder udarbejdet fra autentiske standarder (Steraloids) og ekstraheret med den anvendte metode for prøver.

Ovenstående kvantificering protokoller for lipider og kolesterol blev gentaget tre gange for tre individuelle eksperimenter i ikke-behandlede (kontrol) og behandlede DU145 celler med PHE i 10 min. Da mængden af ​​lipider og kolesterol kvantificerede i hver fraktion (ng /ml eller ug /m) varieret lidt blandt eksperimenter blev resultater normaliseret ved at bestemme middelværdier for de tre forsøg, repræsenteret ved procentdelen af ​​lipid og kolesterol i hver fraktion i kontrolbetingelser sammenlignet med PHE-behandlede betingelser.

plasmamembranen “Rip Off”

Denne metode er baseret på en publiceret protokol [26]. Celler blev dyrket på dækglas. Formvar®-belagt kobbergitre (ifølge [27]) blev coatet med polylysin. Dækglas blev placeret celle nedad på ristene og et let tryk blev udøvet ved hjælp af en gummiprop så dækglas blev vendt, og gitrene blev omhyggeligt aftagne derefter fikseret i 8% (v /v) PFA (paraformaldehyd). Efter vask i PBS og mætning i PBS /2,5 mM, blev glycin /æsel serum immunomærkning udført ifølge standardteknikker ved anvendelse af primære antistoffer, efterfulgt af artsspecifikke anti-IgG guldkonjugater af 6 nm, 12 nm og 18 nm. Endelig blev gitre kontrast og forberedt til observation på et Hitachi H-600 transmission elektron mikroskop (forstørrelse × 20000) på 75 kV.

Ultrastrukturel Microscopy

For transmission elektronmikroskopi, Cellerne blev fikseret i 2,5% glutaraldehyd fremstillet i 0,1 M cacodylatbuffer og post-fikseret i 1% osmiumtetroxid i den samme buffer. Efter acetonitril dehydrering blev pelleten indlejret i Epon. Serielle tynde sektioner (90 nm) blev skåret ved hjælp af en Reichert Ultracut E ultramikrotom og opsamlet på 150 mesh sekskantede spærret kobber net. Efter farvning med 2% uranylacetat udarbejdet i 50% ethanol og inkubation med en ledende citratopløsning blev snit observeret på en Hitachi H-600 transmission elektron mikroskop.

Indirekte Immunofluorescens

Resektion BPH prøver fra human prostata frosset i flydende nitrogen-afkølet isopentan og holdes i “Tissue-Tek®” ved -80 ° C før 10 um snit blev fremstillet ved -20 ° C med en kryostat, monteret på objektglas og fortsatte til IF undersøgelse. Normale og kræft prostata væv blev leveret af væv-array-slides (SuperBioChips Laboratories), deparaffineret ifølge producentens angivelser (Cliniscience) før forberedelse til IF efter [28]. Kort beskrevet blev alle objektglas blokeres under 30 min med PBS /1,2% (v /v) gelatine derefter inkuberet med ønskede primære antistoffer i 1 time ved 37 ° C, derefter sekundære antistoffer (1H, 37 ° C). Billeddannelse blev udført ved anvendelse Zeiss LSM 510 konfokalt hoved (Carl Zeiss) forbundet til et Zeiss Axiovert 200 M mikroskop med en × 40 olieimmersionsobjektiv linse (numerisk åbning 1.45). Objektglas blev scannet under anvendelse af en argonionlaser og en helium /neon-ion-laser. Alle scanning parametre blev holdt konstant gennem de forskellige eksperimenter. AIM 3.2 konfokalt mikroskop software (Carl Zeiss) blev anvendt til indsamling og analyse af data.

RT-PCR

Revers transkription-PCR blev udført som tidligere beskrevet [29]. Den 178 pb α

1A-AR isoform 1 amplikon blev forstærket med 5′-AGACCAATCCTCCTGTACCAC-3 ‘(fremad) og 5′-CTCTGCATCTTTCATGTCCTAG-3′ (tilbage). 220 pb CAV-1 amplikon blev amplificeret med 5’-AGTGCTCCTGTTCTCCCTTC-3 ‘(fremad) og 5′-CTTGTCGATGGCTTCCTTCAC-3′ (revers) (Eurogentec). Den 236 pb GAPDH amplikon intern kontrol blev forstærket med 5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3 ‘(fremad) og 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′ (tilbage). Den 241 pb cytokeratin 18 amplikon blev forstærket med 5’-TGAGTCAGAGCTGGCACAGA-3 ‘(fremad) og 5′-TGGTGTCATTGGTCTCAGACA-3′ (tilbage). Endelig blev 210 pb cytokeratin 14 amplikon forstærket med 5’-TGCGAGATGGAGCAGCAGAA-3 ‘(fremad) og 5′-TGCCATCGTGCACATCCATGA-3’ (tilbage). a

1A-AR, CAV-1, blev cytokeratin 14 og 18 mRNA udtryk valideret af gel density analyse ved hjælp af GAPDH mRNA som intern kontrol.

Menneskelige vævsprøver

menneskelige BPH biopsier blev opnået fra samtykkende patienter efter de lokale etiske overvejelser. Alle forsøg med patientens væv blev udført under godkendelsesnummer ‘CP 01/33 «, udstedt af» Comité Consultatif de Protection des Personnes dans la Recherche Biomédicale de Lille «.

Statistisk analyse

resultaterne blev udtrykt som middelværdien ± SEM. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af uparret

t

test (til sammenligning to grupper) eller analyse af varians test efterfulgt af Dunnett (for flere kontrol

versus

test sammenligninger). Forskelle blev betragtet som signifikante, når

s

0,05 (*),

s

0,01 (**) og

s

0,001 (***).

Resultater

α

1A-AR er forbundet med CAV-1 ved DU145 celleoverfladen

Tidligere undersøgelser har beskrevet en direkte interaktion med α

1A AR med CAV-1 [15]. Desuden α

1A-AR signalering er kendt for at lokaliseres i caveolae [14], [30]. At udforske membranen topologi af α

1A-AR, brugte vi “rip-off” teknik udviklet i vedhæftende celler tillader isolation og observation ved elektronmikroskopi af store områder af plasmamembranen [26]. α

1A-AR immunguld-farvning (6 nm prikker, sort pilespids) colocalizes med CAV-1 (18 nm prikker, hvid pilespids) i plasma membran mikrodomæner på ca. 50-100 nm (figur 1).

Plasmamembraner var “flået ud” som beskrevet i afsnittet “Metoder” og inkuberet med anti-CAV-1 og anti-α

1A-AR antistoffer. Sekundære antistoffer koblet med 6 nm og 18 nm guldpartikler blev anvendt mod anti-α

1A-AR (sort pilespids) og anti-CAV-1 (hvid pilespids) hhv. Gitre blev derefter bearbejdet til elektronmikroskopi observation. Colokalisering af begge proteiner er vist med cirkler. Bar, 200 nm.

Plasma membran protein omfordeling og lipid sammensætning ændringer i DRM fraktioner induceret af phenylephrin

Analyse af plasma membran mikrodomæner, caveolae eller lipid raft sammensætning begynder typisk med rengøringsmiddel opløseliggørelse af hele celler efterfulgt af densitetsgradientcentrifugering og genvinding af DRM fra lette fraktioner af gradienten. Vi undersøgte sammenslutningen af ​​α

1A-AR med renset DRM fra DU145 hel cellemembran uddrag på en OptiPrep® densitetsgradient. Til karakterisering af DRM fraktioner blev tilstedeværelsen af ​​en specifik plasmamembran markør pan cadherin først vurderes som en positiv kontrol (figur 2A, a). Dens tilstedeværelse i alle 10 oprensede fraktioner viser, at de isolerede DRM fraktioner svarer til plasmamembran regioner. Desuden blev den kerneprotein PCNA (proliferation cellekerneantigen) og det mitokondriske protein bax anvendt som negative kontroller som de er kendt for ikke at associere med plasmamembranen. Deres fravær i DRM fraktioner validerer fraværet af forurening med intracellulære membraner (figur 2A, a).

(A) DRM fraktioner af stigende tæthed (fra fraktion 1 til 10) opnået som angivet i “Metoder” sektionen og analyseret ved Dot blot. (A) Pan cadherin blev anvendt som en positiv kontrol, der bekræfter, at de opnåede fraktioner svarer til plasmamembranen. PCNA (proliferation cellekerneantigen) og Bax blev anvendt som negative kontroller, deres fravær bekræfter ikke-forurening af DRM fraktioner ved intracellulære proteiner vides ikke at være associeret med klumper. (B) Dot-blot af DRM fraktionsopsamling i kontrol tilstand (CTL) og 10 minutters behandling med 10 pM phenylephrin (PHE). Purinergisk receptor P2Y2 blev anvendt som en negativ kontrol for specificiteten af ​​virkningen af ​​phenylephrin på protein omfordeling i fraktioner. Sort rektangel markerer skiftet i α

1A-AR, CAV-1 og Ga

Q11 protein til lettere density fraktioner. (B) lipidsammensætning af de 10 fraktioner blev kvantificeret som beskrevet i afsnittet “Metoder” i kontrol (sort søjle) og PHE behandlede celler (grå søjler) for (a) lysophosphatidylcholin (LPC), (b) phosphatidylcholin (PC), (c) sphingomyelin (SM), (d) kolesterol. Fejlbjælkerne viser SEM beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse bruges

t

test; *,

s

0,05, **,

s

0,01 og ***,

s

. 0,001

for at afgøre, om tidligere definerede mikrodomæner er involveret i α

1A-AR signalvejen i DU145 celler undersøgte vi α

1A-AR stimulering af dets specifikke agonist phenylephrin (PHE). Dot blot-analyse af DRM fraktioner afslørede distribution af CAV-1 i lav densitet gradient (5% -20%) fraktionerne 1-6 og α

1A-AR i fraktionerne 1 og 3-6 i kontrol (CTL) betingelser. Efter 10 minutter behandling med 10 pM PHE CAV-1 fordeling blev observeret i lav densitet-gradient (5% -10%) fraktionerne 1-5 og α

1A-AR blev nu påvist i alle fraktionerne 1-6 (inklusive lav densitet fraktion 2) (figur 2A, b, øvre panel CTL; nedre panel PHE). Vigtigt er det, viste Ga

Q11 (en α

1A-AR effektor) indhold et skift fra fraktionerne 4-5 til fraktionerne 1 til 5 efter PHE behandling og være til stede i højere fraktioner densitet, hvilket antyder, at receptor-aktivering ikke involverer alle Ga

Q11 proteiner til stede på membranen niveau. Vi vurderede også purinergiske receptor P2Y2 anvendt som en negativ kontrol for specificiteten af ​​ændringen i protein fordeling induceret af PHE. α

1A-AR og P2Y2 er begge GPCR deler lignende signalveje. P2Y2 ligger i de samme fraktioner hvorvidt DU145 celler blev behandlet eller ej (figur 2A, b, CTL og PHE), derfor viser specificiteten af ​​den tidligere observerede PHE-induceret modificeret protein fordeling.

Desuden var vi interesseret i lipidsammensætningen af ​​oprensede DRM fraktioner. Lipider, der vides at være beriget i biologiske lipidklumper, såsom lysophosphatidylcholin (LPC), sphingomyelin (SM), phosphatidylcholin (PC) og cholesterol [31], [32], blev analyseret. Igen, undersøgte vi mulige ændringer af lipidsammensætningen af ​​DRM fraktioner efter PHE stimulering. Vores observationer viser en betydelig stigning i mængderne af disse lipider hovedsagelig i lav densitet-gradient (5% -10%) fraktionerne 1-5 som et resultat af PHE stimulering (figur 2B, a, b, c, d). Disse resultater er i overensstemmelse med den veletablerede faktum, at det høje fedtindhold forårsager flyder af lipid mikrodomæner i fraktioner med lav densitet under centrifugering. Tidligere offentliggjorte data om lipid modelsystemer viser, at størrelsen af ​​lipidklumper afhænger lipidmembranen sammensætning [33], [34]. De observerede ændringer i lipid kompositioner grund membran reorganisering kan tegne sig for lettere tæthed mikrodomæner resulterer i en omfordeling af α

1A-AR, CAV-1 og Gαq

11 observeret inden DRM fraktioner.

Protein og lipid reorganisering induceret af phenylephrin er associeret med CAV-1-rige membran clustering

det menes, at ved ekstracellulær stimulus, er plasmamembranen forberedt til dannelsen af ​​mere stabiliserede domæner og molekylære klynger med forøget størrelse og levetid såsom caveolae [35], [36]. For at forstå inddragelse af caveolae i α

1A-AR signalering, vi undersøgt virkningen af ​​PHE stimulation på DU145 celleoverfladen morfologi (figur 3A). Celler behandlet i 10 min med 10 pM PHE stede talrige overflade invaginationer svarende til caveolae (figur 3A, B) sammenlignet med ikke-behandlede celler (figur 3A, a). Caveolae er tydelige som cirkulære profiler med ensartet form og 50-80 nm diameter. I denne repræsentative elektronmikrografi caveolae er til stede som enkelte gruber (figur 3A, b, sorte pilespidser) og nogle gange i mere komplekse arrangementer sammenkoblet med cytoplasmatiske caveolar profiler (figur 3A, B, hvide pilespidser).

(A) repræsentative elektronmikrografi af DU145 celler i (a) ubehandlede tilstand (b) efter 10 minutters behandling med 10 pM PHE. Caveolae og caveolin indeholdende vesikler af 50-80 nm diameter er tæt i elektroner er angivet med sorte pile. Hvide pilespidser angiver kompleks formede caveolae.