PLoS ONE: Virkningen af ​​p120-catenin Isoformer 1A og 3A på Epithelial Mesenchymale Overgang for lungekræft celler, der udtrykker E-cadherin i forskellige Subcellulær Locations

Abstrakt

epitelial mesenkymale overgang (EMT) er en vigtig proces i tumor udvikling. Trods tidligere undersøgelser, er det fortsat uklart, hvordan p120-catenin (p120ctn) isoformer 1A og 3A påvirke EMT af tumorceller. Her undersøgte vi udtryk for p120ctn, E-cadherin og vimentin i 78 human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) prøver ved immunhistokemi og fandt, at p120ctn membran udtryk positivt korreleret med E-cadherinekspression (

P

0,001) og negativt korreleret med vimentin udtryk og lymfeknude metastaser (

P

0,05). I mellemtiden, p120ctn cytoplasmatisk udtryk negativt korreleret med E-cadherinekspression (

P

0,001) og positivt korreleret med vimentin udtryk og lymfeknude metastaser (

P

0,05). Celler, der udtrykker høje (H460 og SPC) og lav (H1299 og LK2) niveauer af p120ctn var skærmen for at undersøge dens indvirkning på EMT. E-cadherin var begrænset til cellemembranen i H460 og H1299 celler, mens det blev udtrykt i cytoplasmaet i SPC og LK2 celler. Ablation af endogen p120ctn isoform 1A i celler, der udtrykker høje niveauer af proteinet resulterede i nedsat E-cadherin ekspression, forøgede N-cadherin, vimentin og snegl ekspression og øget invasionsevne i H460 celler. I mellemtiden helt modsatte resultater blev observeret i SPC-celler. Desuden transfektion af i H1299 celler, der udtrykker lave p120ctn niveauer med p120ctn isoform 1A plasmid resulterede i øget E-cadherin udtryk, nedsat N-cadherin, vimentin og snail udtryk og svækket invasiv, mens LK2 celler viste helt modsatte resultater. Begge cellelinier, som udtrykker lave niveauer p120ctn og transficeret med p120ctn isoform 3A plasmid syntes at have forøget E-cadherin ekspression, nedsat N-cadherin, vimentin og snegl ekspression og svækket invasionsevne. Afslutningsvis i celler med membran E-cadherin, både p120ctn isoformer 1A og 3A hæmmede EMT og nedsat celle invasiv. I celler med cytoplasmatisk E-cadherin, p120ctn isoform 1A fremmet EMT og øget celle invasiv, mens p120ctn isoform 3A hæmmede EMT og nedsat celle invasionsevne

Henvisning:. Zhang Y, Zhao Y, Jiang G, Zhang X, Zhao H, Wu, J., et al. (2014) Virkningerne af p120-catenin Isoformer 1A og 3A på Epithelial Mesenchymale Overgang af Lung Cancer Cells udtrykker E-cadherin i forskellige Subcellulære Locations. PLoS ONE 9 (2): e88064. doi: 10,1371 /journal.pone.0088064

Redaktør: Frédéric André, Aix-Marseille Universitet, Frankrig

Modtaget: November 21, 2013; Accepteret: 6 jan 2014; Publiceret: 4 februar 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (tilskud 81071905 og 81272606 til E.-HW, giver 81.101.780 til YZ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitelial mesenkymale overgang (EMT) er en hurtig og ofte reversibel ændring af celle fænotype og spiller en særlig vigtig rolle i tumor udvikling. I processen med EMT, epitelceller underkastes en fænotypisk switch til dannelse mesenkymale celler, der er ligner fibroblaster [1], [2]. Sådanne fænotypiske ændringer forårsager epitelceller til at miste deres karakteristiske celle-celle adhæsion strukturer, ændre deres polaritet, modulere tilrettelæggelsen af ​​deres cytoskeletale systemer, skifte udtryk fra keratin- til vimentin-typen intermediære filamenter, samt blive isoleret, motile og modstandsdygtig over for anoikis [3], [4]. Typisk celler undergår EMT show faldt E-cadherin udtryk [5], [6] og nedsat udtryk for mesenkymale biomarkører, såsom N-cadherin, vimentin, snegl, slug og twist [7], [8].

Tidligere undersøgelser om forholdet mellem p120-catenin (p120ctn) og EMT har været begrænset til overgangen fra korte til lange p120ctn isoformer under EMT induceret ved ekspression af SIP1 /ZEB2 [9], twist [10] eller Zeppo1 [11 ]. Men den mekanisme, hvorved p120-catenin isoformer 1A og 3A påvirker EMT af tumorceller forbliver ukendt. Den p120ctn protein har fire isoformer (1 til 4) som følge af fire transkriptionelle startsteder, og hver isoform har en fuld central bæltedyr repeat domæne, kan vekselvirke med juxtamembrandomænet af E-cadherin for at deltage i dannelsen af ​​en adhæsion kompleks på cellemembranen [12]. Disse observationer antyder, at den subcellulære lokalisering og funktion af p120ctn kan påvirkes af lokaliseringen af ​​E-cadherin. Tidligere undersøgelser har vist, at p120ctn kan spille modsatrettede roller afhængigt af om det er placeret på membranen eller i cellers cytoplasma [13], [14]. Andre har også fundet, at p120ctn isoformer 1A og 3A har forskellige regulerende funktioner på tumorcelleproliferation, invasion og metastase [15], [16],. Disse undersøgelser viser, at hvis p120ctn har en indvirkning på EMT, er det sandsynligt, at være anderledes mellem p120ctn isoformer 1A og 3A.

Nogle undersøgelser har vist, at p120ctn kan fremme eller hæmme tumorvækst og invasivitet afhængigt af om E -cadherin udtrykt eller ikke [18], [19]. Yu og kolleger fandt også forskellige effekter af p120ctn isoformer 1A og 3A på spredning og invasion i tumorceller udviser forskellige lokaliseringer af E-cadherin [20]. Således, uanset om p120ctn isoformer 1A og 3A spiller også forskellige roller i reguleringen EMT i tumorceller med E-cadherin på forskellige steder er fortsat ukendt.

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme de potentielle virkninger og reguleringsmekanismer af p120ctn isoformer 1A og 3A på EMT i lunge kræftceller. Vi først afsløret, at membranen eller cytoplasmiske ekspression af p120ctn korrelerede med ekspression af E-cadherin og vimentin eller lymfeknudemetastaser ved immunhistokemi. Vi har registreret yderligere ekspressionsniveauerne af p120ctn, E-cadherin og vimentin i lungecancerceller ved Western blot og screenet cellelinjer, der udtrykker både lave og høje niveauer af p120ctn og med E-cadherin i membranen eller cytoplasmaet. Ændringer i ekspressionen af ​​EMT-relaterede molekyler og celleinvasion blev også undersøgt ved knockdown af endogen p120ctn-1A eller overekspression af transfektion af p120ctn-1A og 3A plasmider ind i celler.

Materialer og metoder

Materialer

Denne undersøgelse blev foretaget med godkendelse af den institutionelle gennemgang bord på Kina Medical University. Skriftligt samtykke blev givet af deltagerne for deres oplysninger, der skal lagres på hospitalet databasen og deres prøver, der skal anvendes i denne undersøgelse. Alle kliniske undersøgelser blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Prøverne blev indsamlet fra 78 tilfælde af planocellulært lungekræft og lungeadenokarcinom diagnosticeret på First Affiliated Hospital i Kina Medical University (Sheny-ang, Kina). Prøverne var fra 46 mandlige og 32 kvindelige patienter med en gennemsnitsalder på 57 år. Prøverne blev klassificeret i henhold til lunge tumor histologiske kriterier (2004) fra Verdenssundhedsorganisationen (WHO) [21] som planocellulært lunge karcinom (32 tilfælde) eller lunge adeno-carcinom (46 tilfælde). Tredive sager blev meget differentieret, og otteogfyrre var moderat eller dårligt differentieret. Lymfeknudemetastaser var til stede i 43 tilfælde, men ikke i det andet 35. Vi valgte tilfælde med lymfeknudemetastaser at sammenligne de metastatiske knuder med den primære tumor. Tumor iscenesættelse blev udført i overensstemmelse med tumor-node-metastaser (TNM) iscenesættelse system Den Internationale Union mod Kræft (UICC) [22]. Der var 39 sager på stadium I-II, og 39 sager på stadium IIIa-IIIb. Ingen af ​​patienterne havde modtaget strålebehandling eller kemoterapi før operationen og fik standard behandling efter operationen. Alle prøver blev fikseret i formalin, indlejret i paraffin og farvet med hematoxylin og eosin for patologisk analyse og diagnose.

Cellekultur

Normalt humant bronchieepithelceller (HBE) celler og A549, H1299, H460 og H157 cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). SPC-A-1, blev LTEP-A-2 og LK2 cellelinjer købt i Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Science. De menneskelige lunge ADC Anip973 og AGZY83a cellelinjer blev købt fra Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd (https://www.bioleaf.com) og lagres i Patologisk Institut, Harbin Medical University. Celler blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) indeholdende 10% føtalt kalveserum (Invitrogen), 100 IU /ml penicillin (Sigma, St. Louis, MO, USA) og 100 mg /ml streptomycin (Sigma) .

Plasmidkonstruktion og transfektion

Ekspressionsplasmider for p120ctn isoformer 1A og 3A (doneret af Dr. Albert B. Reynolds Institut for Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine, TN, USA) har tidligere blevet beskrevet [16]. Sekvenser af p120ctn-1A-siRNA (Guangzhou Ruibo Co. Ltd, Guangzhou, Kina), der anvendes i forsøgene var som følger: si-h-CTNND1: 5′-CACAAGAUGCCAACCCACU DTDT-3 ‘, 3′-DTDT GUGUUCUACGGUUGGGUGA-5’. Cellerne blev transient transficeret med p120ctn-1A-siRNA og plasmider udtrykker p120ctn isoformer 1A og 3A under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) eller Attractene transfektionsreagens (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner.

Immunhistokemi

paraffin indlejrede prøver blev skåret serielt i 4-um tykke snit. Normal bronkieepitel stede i tumoren slides blev anvendt som en intern positiv kontrol. Immunfarvning blev udført ved streptavidin-peroxidase (S-P) metode. Vævssnittene blev inkuberet med et monoklonalt p120ctn museantistof (1:100, kat 610.134, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA.), E-cadherin kanin-monoklonalt antistof (1:100, kat SC-7870;. Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, Californien, USA) eller vimentin kanin monoklonalt antistof (klar-til-brug, kat. RMA-0547, MaiXin Bio, Fuzhou, Kina) ved 4 ° C natten over. PBS blev anvendt som en negativ kontrol. Biotinyleret gede-anti-muse-serum-IgG eller biotinyleret gede-anti-kanin-serum-IgG (klar-til-brug, kat. KIT-9922, MaiXin Bio) blev anvendt som det sekundære antistof. Efter vask blev sektionerne inkuberet med streptavidin-biotin konjugeret med peberrodsperoxidase (Ultrasensitive, MaiXin Bio), og derefter blev peroxidase reaktionen blev fremkaldt med 3,3-diaminobenzidintetrahydrochlorid (MaiXin Bio). Lys kontrastfarvning udførtes med hematoxylin, og derefter blev snittene dehydreret i alkohol før de monteres.

To undersøgere uafhængigt undersøgt alle de tumor objektglas. Fem tilfældige felter blev undersøgt per dias, og blev observeret 100 celler pr høj forstørrelse felt (400 ×). Procentdelen af ​​positive celler blev scoret som følger: 0 = ingen farvning; 1+ = 0-25%; 2+ = 26-50%; 3+ = 51-75%; og 4+ = 76-100%. Den farvningsintensitet blev scoret som følger: 0 = ingen farvning; 1 = lysegule granulat; 2 = mørk gul eller brun granulat. Den score mærkning defineret ved at gange procentdelen af ​​positive celler ved farvningsintensitet var den endelige score for sektionen. Når den samlede score var ≥3 blev sagen defineret som positiv. Når den samlede score var 3, blev sagen defineret som negativ. For scorer større end 3 point, når mere end 30% af tumorcellerne farves kraftigt og uafbrudt i p120ctn signal på cellemembranen, blev prøven defineret som membran positiv. Hvis færre end 30% af tumorcellerne viste membran ekspression men farvede kraftigt og uafbrudt i p120ctn i cytoplasmaet blev prøven defineret som cytoplasmaet positiv.

Western blot-analyse Salg

Halvtreds mikrogram proteiner blev separeret ved SDS-PAGE (10%). Efter overførsel til en polyvinylidenfluorid (PVDF) -membran (Millipore, Billerica, MA, USA) blev proteinerne inkuberet natten over ved 4 ° C med antistoffer mod følgende: p120ctn (1:500, kat 610.134.), E-cadherin ( 1:300, kat. 610.181), N-cadherin (1:1000, kat. 610920) (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA), vimentin (1:1000, kat. 5741), snegl (1:500, kat. 3879) (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA) og twist (1:200, kat. sc-15193, Santa Cruz Biotechnology). Efter inkubation med anti-muse (1:2000, E030110-01) eller anti-kanin (1:2000, E030120-01) IgG (EarthOx LLC, San Francisco, CA, USA) ved 37 ° C i 2 timer, proteinet bånd blev visualiseret under anvendelse af forøget kemiluminescens (ECL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og kvantificeres ved hjælp af Bioimaging Systems (UVP, Upland, CA, USA). Relative proteinniveauer blev beregnet i forhold til GAPDH som lastning kontrol.

immunfluorescensfarvning Salg

Celler dyrket på dækglas blev fikseret med iskold 4% paraformaldehyd i 15 minutter, efterfulgt af permeabilisering med 0,2% Triton X-100 og inkubation med normalt gedeserum i 30 minutter ved 37 ° C. Celler blev derefter inkuberet natten over med monoklonale p120ctn museantistof (1:200, kat 610.134;. BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA) og E-cadherin kanin polyklonalt antistof (1:100, SC-7870; Santa Cruz Biotechnology). Primære antistoffer blev anvendt natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubering med en rhodamin /fluorescein-5-isothiocyanat (FITC) -mærket sekundært antistof gede-anti-muse eller TRITC-mærket gede anti-kanin IgG (1:100, kat. E031210 -01 og E031320-01, EarthOx, San Francisco, CA, USA). Kernerne blev modfarvet med propidiumiodid /4, 6 diamidino-2-phenylin-dole. Epifluorescens mikroskopi blev udført ved anvendelse af et omvendt Nikon TE300-mikroskop (Melville, NY, USA), og konfokal mikroskopi blev udført ved anvendelse af en Radiance 2000 laser scanning konfokal mikroskop (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).

Matrigel celle invasion assay

Matrigel celleinvasion assays blev udført ifølge producentens anvisninger (Corning, Acton, MA, USA). En 100-pi cellesuspension (5 x 10

5 celler) blev tilsat til det øvre kammer, medens det nedre kammer blev fyldt med RPMI 1640 medium indeholdende 10% føtalt kalveserum. Hver øvre og nedre kammer var adskilt af en 8-um porøs polycarbonatmembran. Cellerne blev inkuberet i 24 timer ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Efter mediet blev kasseret, blev cellerne fikseret med methanol i 30 minutter og farvet med hematoxylin (Sigma). For hvert filter blev antallet af celler, der invaderede til den nedre overflade af den porøse membran i fem forskellige områder af 400 ganges forstørrelse tælles tilfældigt anvendelse af et Nikon E200 mikroskop. Den gennemsnitlige blev beregnet ud fra data fra hvert forsøg gentaget tre gange.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) til Windows-software . Chi-square test blev anvendt til at analysere immunhistokemiske data. Den uafhængige prøver T-test blev anvendt til at undersøge Transwell eksperimentelle data.

P

værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Membran udtryk for p120ctn positivt korrelerer med E-cadherin udtryk og negativt korrelerer med vimentin udtryk og lymfeknude metastaser

Normale bronchieepithelceller væv viste p120ctn i membranen (figur 1A), mens andelen af ​​lungekræft væv udtrykker p120ctn i membranen var signifikant lavere (35%, 27/78) end med p120ctn cytoplasmatisk ekspression (65 %, 51/78). E-cadherin blev udtrykt i membranen i normale bronkieepitel væv (Figur 1A), mens antallet af positivt udtryk faldt (28%, 22/78), og at negative udtryk blev signifikant forøget (72%, 56/78) for E-cadherin i lungekræft væv. Vimentin var negativt udtrykt i normal bronchieepithelceller væv (Figur 1A), mens antallet af positive udtryk blev øget til 32% (25/78) i lungekræft væv. Det ser lungekræft væv med cytoplasmatisk /nukleare lokalisering af p120ctn tendens til at udtrykke vimentin i forhold til dem med membranøs lokalisering (41,2% [21/51] versus 14,8 [4/27]) .. Cytoplasmisk /nukleare lokalisering af p120ctn viste øget lymfeknudemetastase (29/51) i sammenligning med membranøs lokalisering (8/27). Statistisk analyse viste, at lokaliseringen af ​​p120ctn var tæt forbundet med E-cadherin ekspression, vimentin udtryk og lymfeknudemetastaser (

P

0,05) (tabel 1). Med andre ord blev p120ctn membranekspression positivt korreleret med E-cadherin-ekspression og negativt korreleret med vimentin ekspression og lymfeknudemetastaser (figur 1B); i mellemtiden, blev p120ctn cytoplasmatisk udtryk negativt korreleret med E-cadherin udtryk og positivt korreleret med vimentin udtryk og lymfeknude metastaser (figur 1C).

(A) E-cadherin og p120ctn blev membran positiv, og vimentin var negativ i normale bronchiale epitelceller. (B) E-cadherin var membran positiv, og vimentin var negativ i p120ctn membran-positive lungecancerceller. (C) E-cadherin var negativ, og vimentin var positiv i p120ctn cytoplasmatiske-positive lunge kræftceller.

Lokalisering af p120ctn er i overensstemmelse med E-cadherin i lungekræft celler

Vi undersøgte protein ekspressionsniveauerne af p120ctn og E-cadherin i normale HBE-celler og ni lung cancer cellelinjer ved Western blot og fandt, at de alle udtrykte hovedsagelig isoformer 1A (120 kDa) og 3A (100 kDa) af p120ctn ( Figur 2A). Selvom protein ekspressionsniveauerne af p120ctn ikke var relateret til E-cadherin, lokaliseringen (membran eller cytoplasma) af p120ctn var altid i overensstemmelse med den af ​​E-cadherin. Vi derefter screenet celler, der udtrykker høje niveauer af p120ctn og E-cadherin i membranen (H460 celler) eller cytoplasma (SPC-celler), samt dem, der udtrykker lave niveauer af p120ctn og E-cadherin i membranen (H4299 celler) eller cytoplasmaet ( LK2 celler) til yderligere undersøgelse (figur 2B).

(A) Western blot-analyser viste udtryk for p120ctn og E-cadherin i ni lunge cancer cellelinjer og HBE. (B) Ved immunfluorescensanalyse, ekspressionen af ​​E-cadherin og p120ctn blev observeret begrænset til cellemembranen ved celle-celle adherensovergange i H460 og H1299-celler, hvorimod de begge var begrænset til cytoplasmaet i SPC og LK2 celler.

Forskellige funktioner p120ctn isoform 1A i EMT er afhængige af E-cadherin subcellulære lokalisering

Knockdown af endogen p120ctn isoform 1A ved siRNA-p120ctn-1A resulterede i nedsat E-cadherin udtryk og øget N-cadherin, snegl og vimentin ekspression i H460 celler (figur 3A). Imidlertid knockdown af endogen p120ctn-1A ved siRNA-p120ctn-1A viste modstående resultater i SPC-celler, hvor vi fandt øget E-cadherin ekspression og reducerede N-cadherin, snegl og vimentin ekspression (figur 3B). I sammenligning med kontrolgruppen, ablation af p120ctn isoform 1A også øget H460 celler invasiv (17,33 ± 1,25 vs. 36,33 ± 1,70,

P

0,01) (Figur 3C), hvorimod reducerede SPC celler invasiv (23,0 ± 0,82 vs. 13,0 ± 0,82,

P

0,01) (Figur 3D). Disse resultater viste, at p120ctn isoform 1A spiller en anden rolle i EMT og celle invasiv i forskellige E-cadherin subcellulære lokationer.

(A) Ablation af p120ctn isoform 1A faldt E-cadherin udtryk og øget N-cadherin, snegl og vimentin ekspression i H460 celler. (B) SPC-celler blev behandlet som i (A) og de modsatte resultater blev opnået. (C) Ablation af p120ctn isoform 1A forbedret invasiviteten af ​​H460-celler (**

P

0,01). (D) Ablation af p120ctn isoform 1A faldt invasiviteten af ​​SPC-celler (**

P

0,01).

Hæmmende funktion af p120ctn isoform 3A på EMT påvirkes ikke af forskelle i E-cadherin subcellulære lokalisering

for at kontrollere, om p120ctn isoformer 1A og 3A spiller forskellige roller i reguleringen EMT, deres ekspressionsplasmider blev forbigående transficeret ind lungekræft celler med lav udtryk for p120ctn (H1299 med membran E-cadherin ekspression og LK2 med cytoplasmatisk E-cadherin ekspression). Den vestlige-blot-analysen viste, at overekspression af p120ctn isoform 1A førte til øget E-cadherin udtryk og faldt N-cadherin, vimentin og snail udtryk (figur 4A); tværtimod den nedsatte E-cadherin ekspression og forøget N-cadherin, vimentin og snegl ekspression blev observeret i LK2 celler (figur 4B). Overekspression af p120ctn isoform 1A reducerede også H1299 celle invasiv (52,0 ± 2,65 vs. 33,33 ± 2,64,

P

0,01) (Figur 4C), mens forbedret LK2 celle invasiv (18,0 ± 0,82 vs. 39.66 ± 2.05,

P

0,01) (figur 4D) .. Overekspression af p120ctn isoform 3A medført øget E-cadherin ekspression, nedsat N-cadherin, vimentin og snegl ekspression (figur 4A, 4B) og reduceret celle invasionsevne (52,0 ± 2,65 vs. 29,66 ± 1,53,

P

0,01; 18,0 ± 0,82 vs. 8,33 ± udtryk 0,47,

P

0,01) (Figur 4C, 4D ) i begge disse cellelinier. Disse resultater bekræftede endvidere, at p120ctn isoform 1A havde en anden effekt på EMT afhængig subcellulære lokalisering af E-cadherin. De viste også, at p120ctn isoform 3A opretholdt en inhiberende rolle i EMT af lungecancerceller hvorvidt E-cadherin blev lokaliseret til membranen eller cytoplasmaet.

(A, B) Både H1299 (E-cadherin membran lokalisering) og LK2 celler (E-cadherin cytoplasmatisk lokalisering) forbigående transficeret med p120ctn isoform 3A plasmid viste øget E-cadherin udtryk og faldt N-cadherin, vimentin og sneglen udtryk. (C, D) Forbigående transfektion af p120ctn isoform 3A plasmider ind H1299 og LK2 celler resulterede i nedsat celle invasiv (**

P

0,01). (E) E-cadherin forblev lokaliseret på membranen i H1299 celler og i cytoplasmaet i LK2 celler efter transfektion af p120ctn isoformen 3A plasmid.

Diskussion

Fænomenet EMT i tumorceller ofte fører til nedsat celleadhæsion og øget mobilitet, og denne overgang er ledsaget af nedsat E-cadherin ekspression og forøget ekspression af N-cadherin, vimentin og andre mesenkyme biomarkører [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. Som en vigtig faktor til stabilisering E-cadherin, p120ctn spiller en rolle ved inhibering eller fremme tumorcelleproliferation og invasion, der afhænger af, om E-cadherin udtrykkes eller ej [16], [17]. Endvidere p120ctn isoformer, 1A og 3A har vist forskellige effekter på E-cadherin ekspression og tumorcelleinvasivitet der er baseret på forskelle i lokaliseringen af ​​E-cadherin [18]. Disse resultater antyder kraftigt, at p120ctn sandsynligvis regulerer EMT af tumorceller ved at påvirke E-cadherin udtryk og at p120ctn isoformer 1A og 3A play forskellige roller i EMT udtrykker E-cadherin i forskellige subcellulære steder.

Vi først fundet at p120ctn membran-ekspression blev positivt korreleret med E-cadherin-ekspression og negativt korreleret med vimentin ekspression og lymfeknudemetastaser, mens den cytoplasmatiske ekspression af p120ctn var negativt korreleret med E-cadherin ekspression og positivt korreleret med vimentin ekspression og lymfeknudemetastase ved immunhistokemi . Selv om disse resultater var konsistente med tidligere undersøgelser [13], [14], de yderligere foreslået, at p120ctn sandsynligvis påvirker EMT ved at påvirke ekspressionen af ​​E-cadherin og vimentin og dermed celleinvasion og metastase i ikke-småcellet lungekræft ( NSCLC).

for at bekræfte de forskellige virkninger af p120ctn isoformer 1A og 3A på EMT i celler, der udtrykker E-cadherin forskellige steder, valgte vi H460 og H1299 celler med E-cadherin membran udtryk og SPC og LK2 celler med E-cadherin cytoplasmisk ekspression til yderligere analyse. Plasmider der udtrykker p120ctn isoformer 1A og 3A blev konstrueret, og fuldlængde p120ctn siRNA blev syntetiseret til disse eksperimenter. Da sekvensen ud over aminosyrerne 1-101 af p120ctn isoform 1A er svarende til den i p120ctn isoform 3A [24], [25], kunne vi ikke designe et indgreb sekvens specifikt til p120ctn isoform 3A. Derfor måtte vi yderligere undersøge virkningen af ​​de to isoformer på EMT og celle invasiv i lungekræft celler med forskellige E-cadherin steder specifikt ved at banke ned p120ctn isoform 1A i H460 og SPC celler med høj p120ctn udtryk og transfektion cDNA plasmider for eksogen p120ctn isoformer 1A og 3A i H1299 og LK2 celler med lav udtryk p120ctn.

Knockdown af p120ctn isoform 1A i H460 celler ødelagt epitel celle vedhæftning komplekser. E-cadherin-ekspression blev også nedreguleret som følge af tab af dets vigtige stabiliserende faktor, p120ctn isoform 1A, hvilket var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [20], [26]. Nedsat E-cadherin ekspression og sprængt celle-celle-adhæsion kan inducere EMT [27], [28], [43], [44], hvilket resulterer i øget N-cadherin, vimentin og snegl ekspression og forøget celle invasionsevne. På den anden side, overudtrykt p120ctn isoformer 1A og 3A viste sig at binde E-cadherin placeret på membranen proaktivt i tumorceller [29] og derefter inhibere nedbrydningen af ​​E-cadherin og stabilisere dets ekspression, der bidrager til dannelsen af ​​en effektiv epitelial celle vedhæftning komplekser [30], [31], [32]. Som disse serier af processer opretholdes den normale celle-celle-adhæsion forbindelse hæmmede EMT, blev der øget E-cadherin ekspression og reducerede N-cadherin, vimentin og snegl udtryk, samt inhiberede celle invasionsevne i H1299-celler.

Tidligere undersøgelser har vist, at selv om p120ctn isoform 1A kunne binde E-cadherin i cytoplasmaet, kunne de ikke danne effektive adhæsionskomplekser på membranen mellem epitelceller [33]. Endvidere den cytoplasmatiske E-cadherin er sandsynligt ikke at være i fuld længde E-cadherin, men i stedet spaltede E-cadherin fragmenter, såsom E-cad /sE-cad (80 kDa) og E-cad /ctf2 (33 kDa) [34]. E-cad /ctf2 fragment kan binde til p120 i cytoplasmaet og derefter translokerer ind i kernen og binde den transskriptionelle repressor af Kaiso at aktivere Wnt /b-catenin pathway [35], [36], endelig fremme EMT af tumor celler og forøgelse celleinvasion og metastase [37]. Desuden har andre vist, at p120ctn-1A er relateret til abnorm ekspression af E-cadherin og dårlig prognose [38]. Disse undersøgelser viste, at det cytoplasmatiske p120ctn isoform 1A kan spille en rolle ved at fremme tumorceller EMT, invasion og metastase. På grundlag af ovenstående, vi observerede på den ene side, at virkningen af ​​p120ctn isoform 1A til fremme tumorcelle EMT, invasion og metastase, vil løftes af sit ablation, hvilket resulterer i forøget E-cadherin ekspression, nedsat N-cadherin, vimentin og snegl udtryk og hæmmede invasionsevne i SPC celler. På den anden side, transfektion af p120ctn isoform 1A plasmidet i LK2 celler, der udtrykker cytoplasmatisk E-cadherin resulterede i nedsat E-cadherin ekspression, forøgede N-cadherin, vimentin og snegl ekspression og forøget celle invasionsevne. Selv er stadig uafklaret den præcise rolle p120ctn under EMT induktion, tidligere undersøgelser antydet, at knockdown af alle isoformer af p120ctn kunne fremkalde EMT indirekte [27], [28], [43], [44]. Alle induktioner var baseret på nedsat E-cadherin udtryk og intercellulær vedhæftning i tidligere undersøgelser, som også blev bekræftet af vores undersøgelse i H460 celler med E-cadherin membran lokalisering. I modsætning til de H460-celler, kunne knockdown af p120ctn isoform 1A i SPC-celler med E-cadherin cytoplasmatisk ekspression ikke mindskes E-cadherin ekspression og intercellulær adhæsion. I stedet fandt vi øget E-cadherinekspression og nedsat celle invasiv, hvilket indikerer, at EMT ikke kunne fremkaldes ved denne vej i SPC celler.

Det var værd at bemærke, at det samme resultat blev observeret i LK2 og H1299 celler transficeret med p120ctn isoform 3A plasmid, både viser øget E-cadherin udtryk, nedsat N-cadherin, vimentin og snail udtryk og hæmmede celle invasiv. Disse resultater antydede, at p120ctn isoform 3A har den funktion at inhibere EMT af lungecancerceller, og denne funktion er uafhængig af den cellulære E-cadherin lokalisering. Tidligere forskning har også bekræftet et skift fra p120ctn isoform 3A til p120ctn isoform 1A udtryk efter induktion af EMT [9], [10], [11], der indirekte indikerer, at p120ctn isoform 3A kan hæmme EMT mens p120ctn isoform 1A fremmer EMT. Derudover har vi også bemærket, at p120ctn og E-cadherin protein udtryk niveauer blev øget væsentligt efter transfektion af p120ctn-3A plasmidet i LK2 og H1299 celler, men p120ctn og E-cadherin stadig hovedsageligt begrænset til cellemembranen ved celle-celle adherensovergange i H1299-celler. Derimod blev E-cadherin og p120ctn næsten udelukkende placeret i cytoplasmaet i LK2 celler (Figur 4E). Som celleadhæsionsmolekyle, er E-cadherin vides at være kun placeret på cellemembranen med potentiale til at inhibere EMT, mens i cytoplasmaet, er det ofte spaltes til fragmenter og derfor fungerer forskelligt fra molekylerne placeret på cellemembranen [ ,,,0],34]. Således ville den cytoplasmatiske E-cadherin teoretisk ikke spiller en rolle ved inhibering EMT. På baggrund af ovenstående analyse, vi spekuleret på, at der kan være en vis interaktion mellem p120ctn isoform 3A og sneglen, som spiller en rolle i at undertrykke EMT i lungekræft celler, der udtrykker cytoplasmatisk E-cadherin, men denne hypotese kræver yderligere undersøgelse.

Vigtigt er det, vi fandt også, at knockdown af p120ctn-1A i SPC-celler med cytoplasmatisk E-cadherin resulterede i nedsat twist ekspression (figur 3B). I mellemtiden, transfektion af LK2 celler, som også viste cytoplasmatisk lokalisering af E-cadherin, med p120ctn isoform 1A plasmid resulterede i øget twist ekspression (figur 4B). Der blev imidlertid ikke observeret nogen ændringer i twist ekspression i resten af ​​forsøgene (fig 3A, 4A). Som en transskription faktor og master gen regulator af EMT [39], [40], kan twist nedregulerer E-cadherin udtryk [41] og opregulere N-cadherin og andre mesenkymale biomarkører [42].