PLoS ONE: Tab af udskilt Frizzled-relateret protein 4 korrelerer med en Aggressive fænotype og forudser dårligt resultat i kræft i æggestokkene Patients

Abstrakt

Baggrund

Aktivering af Wnt signalvejen er impliceret i afvigende cellulær proliferation i forskellige cancerformer. I 40% af endometrioide ovariecancere, konstitutiv aktivering af vejen skyldes onkogene mutationer i β-catenin eller andre inaktiverende mutationer i vigtige negative regulatorer. Udskilt frizzlede-relateret protein 4 (SFRP4) er blevet foreslået at have hæmmende aktivitet gennem binding og binding Wnt-ligander.

Metode /vigtigste resultater

Vi udførte RT-qPCR og vestlig blotting i den primære kulturer og æggestokkene cellelinjer til SFRP4 og dens centrale downstream regulatorer aktiveret β-catenin, β-catenin og GSK3p. SFRP4 blev derefter undersøgt ved immunhistokemi i en kohorte af 721 patienter og på grund af den foreslåede sekretoriske funktion i plasma, præsentere den første ELISA for SFRP4. SFRP4 var mest stærkt udtrykt i tubal epitel og faldt med malign transformation, både på RNA og på proteinniveau, hvor det var endnu mere udtalt i membranfraktionen (p 0,0001). SFRP4 blev udtrykt på protein niveau i alle histotypes for kræft i æggestokkene, men blev reduceret fra grænsetilfælde tumorer til kræft og med tab af cellulær differentiering. Tab af membran udtryk var en uafhængig indikator for dårlig overlevelse i æggestokkene kræftpatienter. (P = 0,02 ujusterede; p = 0,089 justeret), hvilket har øget risikoen for en patient til at dø af denne sygdom med faktoren 1,8

konklusioner /betydning

Vores resultater støtter en rolle for

SFRP4

som et tumorsuppressorgen i ovariecancer

via

inhibering af Wnt signalvejen. Dette har ikke kun prædiktive implikationer, men kunne også lette en terapeutisk rolle ved hjælp epigenetiske mål

Henvisning:. Jacob F, Ukegjini K, Nixdorf S, Ford CE, Olivier J, Caduff R, et al. (2012) Tab af udskilt Frizzled-relateret protein 4 korrelerer med en Aggressive fænotype og forudser dårligt resultat i æggestokkene kræftpatienter. PLoS ONE 7 (2): e31885. doi: 10,1371 /journal.pone.0031885

Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Forskningscenter, Saudi-Arabien

Modtaget: August 15, 2011; Accepteret: 14 Januar 2012; Udgivet: 21 februar, 2012 |

Copyright: © 2012 Jacob et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cancer League Canton Zürich (til VHS); Oncosuisse (02115-08-2007 til V.H.S.); Swiss National Foundation (fra 320.000 til 12.543 til V.H.S .; PBZHP3-133289 til F.J.); European Science Foundation (til V.H.S.); Cancer Institute New South Wales (09 /CRF /2-02 til V.H.S.); Royal australske og New Zealand College of Obstetricians og gynækologer (til V.H.S.); William Maxwell Trust (til V.H.S.) og Royal Hospital for Women Foundation (til V.H.S.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) er den femte mest almindelige dødsårsag fra alle kræftformer forekommer hos kvinder, og den hyppigste dødsårsag fra gynækologiske maligniteter. Over 75% af kvinder til stede med lokalt fremskreden eller dissemineret sygdom, typisk kendetegnet ved en gradvis invasion af de omkringliggende organer og i tilfælde høje fase, af bughulen. Overlevelse har ændret sig lidt siden begyndelsen af ​​1980’erne trods nye kemoterapeutiske stoffer. Overlevelsesraten for tre fjerdedele af patienter med udbredt metastatisk sygdom er kun omkring 20% ​​[1].

Denne dårlige overordnede prognose resultater fra en mangel på tidlige symptomer og tidlig diagnose, ineffektiv behandling for fremskreden sygdom, modstandsdygtighed over for platin-baserede kemoterapi og fra begrænset forståelse af de tidlige-initierende begivenheder og tidlige stadier af æggestokkene udvikling kræft. En stor udfordring forbliver identifikation af onkogene ovariecancer veje til at støtte i diagnosticering, som prognostiske indikatorer og som mål for nye terapeutiske strategier [2]. Mange grupper, herunder vores egen, har udnyttet array-baserede genom-dækkende opdagelse platforme til at identificere afvigende mRNA-ekspression og somatisk erhvervet DNA-sekvens varianter eller mutationer at bestemme de molekylære ændringer der ligger til grund for udviklingen af ​​kræft i æggestokkene, som et første skridt til at identificere molekylære markører med potentielle kliniske anvendelighed [3], [4].

Brug denne teknologi, er medlemmer af Wnt signalvejen har været impliceret i æggestokkene carcinogenese, som har potentiale til diagnostiske, prognostiske og terapeutiske mål [5], [6]. Wnt signalvejen er stærkt bevaret i hele dyr og medierer en række cellulære funktioner, herunder celle polaritet, væv mønsterdannelse, kontrol af cellulær proliferation og udvikling af neoplasi [7], [8]. Wnt proteiner udskilles, cysteinrige signalmolekyler med konserverede strukturer. Nitten Wnt proteiner er blevet identificeret og knyttet til forskellige stadier af menneskets udvikling og carcinogenese, herunder kræft i bryst, lunge, tyktarm, æggestokke og hud [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Wnt proteiner signal

via Salg Frizzled receptorer gennem en række forskellige, men indbyrdes forbundet signalveje, herunder Wnt /Ca

2+, β-catenin og plane-cellepolaritet pathways [15], [16] , [17]. Generelt er den Wnt familien klassificeret baseret på ligand og receptor involvering i den kanoniske /β-catenin pathway og β-catenin uafhængig /ikke-kanoniske pathway. Interessant ikke-kanoniske Wnt signalering kan antagonisere kanoniske Wnt signalering, og kan repræsentere en hidtil ukendt vej til at målrette cancere drevet af kanoniske Wnt signalering [18]. Nedstrøms målgener af Wnt /β-catenin /TCF signalvej er blevet identificeret som værende af afgørende betydning for ovariecancer epitelcelle transformation, og blev opreguleret i alle endometrioide ovariecancere med Wnt pathway defekter [19], [20]. Flere andre undersøgelser støttede denne observation, rapportering overekspression af cyklin D1 i ovariecancer bærer β-catenin mutationer [21], [22], [23], [24].

Udskilte frizzlede-relaterede proteiner (SFRPs) er ekstracellulære inhibitorer af Wnt signalering, som virker ved at binde direkte til Wnt ligander [25] eller til Frizzled receptorer [26]. Frizzled receptorer findes udelukkende på plasmamembranen, placeret ved overfladen af ​​Wnt-responsive celler. I de senere år har der fundet talrige rapporter beskrevet epigenetisk inaktivering af disse kanoniske Wnt signaling antagonister i forskellige humane cancere, hvilket antyder at de kan fungere som tumorsuppressorer [27]. I kræft i æggestokkene,

SFRP1

var det første familiemedlem rapporteret at være hypermethyleret og bragt til tavshed i æggestokkene kræft cellelinjer og patientprøver, men ikke i normale kontroller, hvilket tyder på en potentiel rolle som en tumor suppressor [28]. Promotor hypermethylering af

SFRP2

SFRP5

blev efterfølgende også fundet i ovariecancer [29]. En nylig undersøgelse rapporterede tab af

SFRP5

udtryk at være forbundet med både progression af æggestokkene carcinogenese og kemoterapi modstand [29].

Som vi tidligere havde identificeret

SFRP4

at være udtrykkes afvigende på RNA-niveau i en stor transskriptionsprofilering eksperiment af patienter med ovariecancer (upublicerede data), her undersøger vi for første gang SFRP4 RNA og proteinekspression i 725 patienter, der anvender revers transkription kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR), Western -blot, immunhistokemi (IHC) og capture-enzymimmunanalyse (ELISA) i primære kulturer, æggestokkene cellelinjer, ascites, væv og plasma.

Metoder

klinisk-patologisk patient kohorte

Etisk godkendelse og skriftligt informeret samtykke blev givet på tre forskellige steder i Schweiz, Tyskland og Australien: 1. Institut for Gynækologi, Universitetshospital Zürich og Institut for Gynækologi og Obstetrik, Spital Limmattal, Zürich (SPUK, StV06 /2006, til VHS); 2. Institut for Gynækologi og Obstetrik, University of Schleswig-Holstein (etiske komité på University of Slesvig-Holsten, Campus Lübeck, til D.H.); og 3. Gynækologisk Cancer Centre, Royal Hospital for Women, Sydney (HREC 08/09/17 /3,02, til V.H.S.). Archival væv fra 721 patienter i schweiziske Kohorte med normale, godartede og æggestokkene /æggelederne /peritoneal eller livmoderkræft blev inkluderet i væv microarrays (281 godartede diagnoser, 440 kræftformer), med de fleste kræftformer er af æggestokkene oprindelse (69,8%; Table 1). Hæmatoxylin Eosin (H Microsoft , Seattle, USA). Patienter med en tidligere historie af kræft eller inflammatoriske /autoimmune sygdomme blev udelukket fra denne undersøgelse.

Vores plasma kohorten blev udvidet med 52 patienter (tysk Kohorte) for at lette en større endometriose patientgruppe. Blodprøver blev indsamlet i EDTA-blod rør (BD Vacutainer®, BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA) forud for kirurgi og lagret på is indtil videre behandling. Prøver blev behandlet inden 3 timer ved centrifugering af 3’000 g i 10 minutter ved 4 ° C og plasma opbevares ved -80 ° C.

Cellekultur

Cell line SKOV3 (serøs ovariecancer ) blev dyrket i RPMI 1640 medium indeholdende penicillin /streptomycin (Pen /Strep), 10% føtalt kalveserum (FCS) og L-glutamin (L-Glut). TOV112D (endometrioide ovariecancer) og TOV21G (klar celle kræft i æggestokkene) blev dyrket i DMEM + Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut. Normale humane ovarie overflade epitelceller (HOSE6-3) blev dyrket i Medium 199 /MCDB 105 (01:02) indeholdende Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut. Alle kræft cellelinjer blev afledt fra ATCC (www.atcc.org), HOSE6-3 var en gave fra Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australien.

Primære kulturer

Primære kulturer blev indsamlet under kirurgi eller gentagne gange under paracentese kræves for kemoterapi progressiv sygdom (australsk Kohorte). Ovariecancer kulturer afledt under paracentese blev taget fra cellepelleten genereret efter centrifugering af ascites ved 4 ° C med 3’000 g. Æggelederne celler til kultur blev opsamlet under anvendelse af en cytobrush ved fimbriale ende af røret umiddelbart efter profylaktisk bilateral salpingo-ooforektomi. De to æggelederne cellelinier, der anvendes i denne publikation stammede fra to patienter, der gennemgår risikoreducerende kirurgi for

BRCA1

mutation status (Tube 1) og stærk familie historie af æggestokkene /brystcancer (Tube 2), hvor skriftligt informeret etisk samtykke blev givet (HREC 08/09/17 /3,02, til VHS). Efter indsamling, blev kulturer øjeblikkeligt opbevaret i DMEM og overføres til laboratoriet til dyrkning. Primære kulturer blev enten dyrket i DMEM + Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut (ovariecancer cellelinjer) eller Medium 199 /MCDB 105 (01:02) indeholdende Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut (normal æggelederne cellelinjer) indtil sammenflydende. Den anden passage af hver kultur blev anvendt til forsøgene.

RT-qPCR

RT-qPCR blev udført ifølge MIQE retningslinjer Celler blev dyrket i 6-brønds plader (NUNC, Thermo Fisher Scientific , Roskilde, Danmark) til en sammenflydning på 60%, vasket med 1 × DPBS (Gibco, Invitrogen Australia Pty Ltd, Mulgrave) og total RNA udvundet (NucleoSpin RNAII kit, Macherey Nagel, Düren, Tyskland). RNA-koncentrationen blev målt ved anvendelse af NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Danmark), integriteten bekræftet ved agarosegelelektroforese (1,7% agarosegel) og et forhold mellem optisk densitet på 260/230 nm≈2.1 (2,0 til 2.2) og 260 /280≈2.0 (1,8 til 2,2), valgt som inklusionskriterier. QPCR blev udført på tre referencepunkter gener samt målgenet,

SFRP4

anvendelse af 500 ng revers transkriberet RNA i et samlet volumen på 20 pi (iScript Reverse Transcription Supermix, Bio-Rad Laboratories Pty Ltd, Gladesville, Australien ). Primere til reference- gener blev udvalgt på grund af deres stabile ekspression: TATA-boks-bindende protein [30] fremadrettet 5′-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3 ‘og revers 5′-CACATCACAGCTCCCCACCA-3′; beta-glucuronidase [31] fremadrettet 5’-AGCCAGTTCCTCATCAATGG-3 ‘og revers 5′-GGTAGTGGCTGGTACGGAAA-3′; succinatdehydrogenase kompleks, underenhed A [32] fremadrettet 5’-TGGGAACAAGAGGGCATCTG-3 ‘og revers 5′-CCACCACTGCATCAAATTCATG-3’; og

SFRP4

frem 5′-ACACCCTCTTAAGCAGCACCAG-3 ‘og omvendt 5′-AGGGTGGATGTCCTGGGAAGTAAG-3’ [33] (Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, Australien). QPCR udføres på Stratagene Mx3005® (Integrated Sciences Pty Ltd, Sydney, Australien) ved anvendelse af 96-brønds mikrotiterplader (Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Australien) og SensiFAST ™ SYBR lo-ROX Kit (Bioline ( Aust) Pty Ltd, Alexandria, Australien) med lav ROX som fluorescens henvisningen farvestof. Optimale reaktionsbetingelser blev opnået ved 2 × SensiFAST ™ SYBR mix, 400 nM specifik sense-primer, 400 nM specifik antisense-primer, RNase /DNase-frit vand og 25 ng cDNA skabelon til et endeligt volumen på 20 pi. Amplifikationer blev udført startende med 30 sek enzymaktivering ved 95 ° C efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 5 sek og annealing /forlængelse ved 60 ° C i 30 sek. En smeltende kurve blev efterfølgende produceret på 65-95 ° C. Alle prøver og negative kontroller blev amplificeret i tre eksemplarer, og gennemsnittet af baseline-korrigeret normaliserede fluorescenssignaler (DRN) opnået for yderligere beregninger. Kvantificering cyklus (CQ) værdier af vores reference gener blev kombineret i et geometrisk gennemsnit for hver prøve [32] og trækkes fra

SFRP4

udtryk: ΔCq = Cq

SFRP4

-Cq

ref. For relativt kvantificere

SFRP4

udtryk (R) i alle undersøgte cellelinjer, blev HOSE6-3 valgt som vores kontrol og udtryk for andre linjer blev beregnet som et forhold i forhold til HOSE6-3 som følger: R = 2

-. [ΔCqSFRP4- ΔCqHOSE6-3]

Western-blot-analyse

Ascites blev indsamlet under paracentese fra to æggestokkene kræftpatienter på to på hinanden følgende tidspunkter, tre måneders mellemrum. Tubulin blev anvendt som en loading kontrol for cellelinjer og anti-beta-2-mikroglobulin for patienten ascites proteinekstrakter. Prøver på 30 ug blev kombineret med NuPAGE® LDS prøve og reducere buffere (Invitrogen Australia Pty Ltd, Mulgrave) og kogt før de anbringes på natriumdodecylsulfat (SDS) -polyacrylamidgeler. Alle geler blev elektrisk overført til PVDF-membraner, inden de blev blokeret i 1 time ved stuetemperatur i 0,01% TBS /Tween indeholdende 3% fedtfri mælkepulver (TBS /Tween med fedtfri mælk). Membraner blev inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C i TBS /Tween med fedtfri mælk og derefter vasket tre gange i 5 minutter i TBS /Tween. Visualisering af proteiner blev udført

via

tilsætning af et sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP), som blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i TBS /Tween med fedtfri mælk. Membraner blev vasket tre gange i 10 minutter i TBS-Tween, inkuberet i ECL og udviklet med Hyperfilm. Scanning og kvantificering af signalintensiteter blev udført under anvendelse af en Bio-Rad GS-800 densitometer med Mængde One software (Hercules, CA, USA). Antistoffer blev anvendt ved de følgende fortyndinger: SFRP4 (Abnova, # 6424-A01): 1:1’000, aktiveret β-catenin (Millipore, # 05-665) 1:1’000, β-catenin (Santa Cruz Biotechnology, # SC-7963), GSK3p (Sigma, # G7914) 1:1’000, anti-beta-2-mikroglobulin (Sigma, # WH0000567M1, 1:1’000). Alle sekundære antistoffer var fra DAKO (Dako Australia Pty Ltd, Botany, Australien) og blev anvendt ved de følgende fortyndinger: gede-anti-kanin, 1:5’000 og ged anti-mus, 1:5’000

Immunhistokemi

til påvisning af SFRP4 ekspression i forskellige væv blev vævet microarray objektglas analyseret ved anvendelse af Ventana Benchmark automatisk farvning systemet (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, USA). For antigen hentning blev objektglassene opvarmes med celle conditioning opløsning i 1 time (CC1; Tris-baseret buffer med svagt alkalisk pH) under anvendelse af en standardprotokol. Objektglas blev inkuberet i 1 time med primær muse polyklonalt anti-humant SFRP4 antistof (1:30; Abnova, Taipeh, Taiwan). Påvisning blev udført under anvendelse af UView HRP-systemet (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, USA). Negative kontroller udeladt det primære antistof, og en positiv og negativ kontrol væv til hvert antistof blev identificeret fra elektronisk Northern blot data eller den publicerede litteratur. Modfarvning blev udført med hæmatoxylin og 1% syre alkohol. Immunfarvning blev scoret i procent og intensiteten af ​​SFRP4 udtryk i forskellige cellulære rum (membran, cytoplasma, nucleus). Scoring blev uafhængigt vurderet to forskere og uoverensstemmelser løses ved konsensus. SFRP4 udtryk fra alle kerner fra en patient blev gennemsnit.

ELISA

Serum SFRP4 koncentrationer blev bestemt ved en in-house udviklede Sandwich ELISA. Immunoplader (96 brønde NUNC MaxiSorp, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Danmark) blev belagt med en fange mus polyklonalt antistof rejst mod en delvis rekombinant humant SFRP4 protein (# H00006424-A01, Abnova, Taipei City, Taiwan) og fortyndet 1:250 i 0,1 M phosphatpuffer pH 7,2. Coating og inkubation blev udført natten over ved 4 ° C. Rekombinant protein, primære og sekundære antistoffer blev fortyndet i PBS og pladerne vasket tre gange med 0,05% (v /v) Tween 20 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Schweiz). Plader blev blokeret med PBS indeholdende 5% (w /v) standard kommerciel tilgængelig mælkepulver i 40 minutter ved 37 ° C og vasket tre gange. Efter blokering af uspecifikke bindingssteder en standardkurve blev udviklet af anvendelse af rekombinant SFRP4 protein (# H00006424-Q01, Abnova, Taipei City, Taiwan) i området fra 3’200 ng /ml til 12,5 ng /ml. Ufortyndede plasmaprøver blev inkuberet in duplo i 1 time ved stuetemperatur. Bundet SFRP4 blev påvist under anvendelse af kanin polyklonalt primære antistof til human SFRP4 ved stuetemperatur i 60 minutter (Dr. R. Friis, University of Bern, Schweiz). Pladerne blev vasket tre gange efterfulgt af inkubation med sekundært polyklonalt anti-muse-antistof konjugeret til kanin-peberrodsperoxidase (1:1’000, Abcam, Cambridge, UK) i 60 minutter ved stuetemperatur. Efter fem vasketrin blev chromogen TMB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Schweiz) påføres som et substrat og peroxidase reaktionen stoppet ved 30 min med et lige volumen af ​​2 M svovlsyre. Optisk densitet blev målt ved anvendelse af en 450 nm ELISA-læser (Tecan Spectrafluor Plus, Tecan, Mannedorf, Schweiz).

Statistisk analyse

Mens SFRP4 proteinekspression i væv oprindeligt blev kvantificeret som cytoplasmisk, membran og nuklear farvning, tal var ofte for lav til yderligere statistiske analyser af individuelle histologiske undergrupper. Derfor blev SFRP4 ekspression kombineret, uafhængig af placeringen af ​​farvning, og blev kaldt samlet “SFRP4 expression” (vilkårlige enheder). SFRP4 ekspression i både væv og plasma blev beskrevet første gang under anvendelse boxplots til forskellige diagnose grupperinger. En normal fraktil plot for SFRP4 udtryk i plasma var tegn på positiv skævhed foretager efterfølgende analyser, der kræver en normalfordeling antagelse tvivlsom. Men variansen stabiliserende logaritmisk transformation lindres problemet. Forskelle i SFRP4 ekspression blandt diagnosegrupper blev vurderet ved anvendelse af en række generelle lineære modeller sammen med en Bonferroni korrektion for parvise sammenligninger. Mulige sammenhænge mellem SFRP4 udtryk og kliniske parametre blev vurderet ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficient. Sygdom specifik overlevelse og tilbagefald overlevelse for ekspressionen af ​​SFRP4 blev beskrevet ved hjælp af Kaplan-Meier kurver og statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af Cox regression ved at beregne ujusterede og justerede hazard ratio. Justerede Cox modeller omfattede aldersgrupper (≤60, 60), tumor bedømmelse (1-2, 3), kræft FIGO stadie (I-II, III-IV) og resterende sygdom ( 10 mm, ≥10 mm) . P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Data analyser blev genereret ved hjælp af SAS-software (v9.2, Cary, NC, USA).

Resultater

Tab af SFRP4 udtryk korrelerer med aggressiv fænotype

SFRP4

blev højt udtrykt i primære æggelederne kulturer sammenlignet med den normale æggestokkene overflade epitelcellelinie HOSE6-3 og var særlig høj i patienten med BRCA-mutationen (Tube 1) sammenlignet med patienten med positiv familiehistorie med bryst /ovariecancer (rør 2, figur 1 A). Mens en klar celle og endometrioide kræft i æggestokkene cellelinje (TOV21D, TOV 112D, henholdsvis), udtrykt

SFRP4 dele på samme niveau til en af ​​de æggelederne kontroller, den udifferentierede serøs ovariecancer cellelinje (SKOV3) vises meget lave niveauer af

SFRP4

(Figur 1 A). SFRP4 ekspression blev derefter målt på proteinniveauet i forskellige sunde og æggestokkræft cellelinjer ved Western-blot. SFRP4 udtryk blev sammenlignet med sin nede-stream regulatorer aktiveret og total β-catenin. HOSE6-3 blev sammenlignet med forskellige ovariekræft cellelinjer af forskellige histotypes og cellulær differentiering. SFRP4 ekspression blev tabt i alle cancercellelinjer sammenlignet med HOSE6-3 (figur 1 B). Interessant TOV112D, den endometrioide ovariecancer cellelinie, udtrykt højeste niveauer af både aktiveret og total β-catenin, konsekvent den kendte Wnt signalering afbrydelse i endometrioide cancere (figur 1 B) [19]. Ascitesvæske indsamlet under progressiv kemoterapi modstand blev derefter analyseret for dets ekspression af SFRP4 og nedstrøms mål som et mål for progression over tid. Brug ascites ved to på hinanden følgende tidspunkter fra to kræftpatienter med angiveligt forskellige aggressivitet (Pt 1 blandet ovariecancer G1, Pt 2 serøs peritoneal cancer G3), viste disse eksperimenter en reduktion på SFRP4 proteinekspression under progressiv kemoresistent sygdom (Figur 1 C, D ). Parallelt med SFRP4 fald blev niveauer af den nedstrøms Wnt signalering regulator GSK3p også reduceret, hvorimod aktiverede β-catenin forøget, hvilket antyder, at Wnt signalering faktisk blev aktiveret i disse patienter.

Tab af

SFRP4

ekspression fra primære æggelederne epiteliale cellelinjer over æggestokkene cancercellelinier er vist i forskellige eksperimentelle indstillinger. (A) Vi har anvendt fluorescens RT-qPCR at undersøge

SFRP4

genekspression i primære æggelederne (raske patienter) og udødeliggjort cellelinjer. HOSE6-3 blev valgt som kontrol og udtryk for andre cellelinjer blev beregnet som et forhold i forhold til HOSE6-3: R = 2

– [ΔCq

SFRP4

– ΔCqHOSE6-3]. (B) SFRP4 og dens downstream mål aktiveret β-catenin (ABC), blev β-catenin og GSK3 β målt ved Western-blot i forskellige cellelinier (HOSE6-3, TOV21G (klar celle, type I ovariecancer), TOV112D ( endometrioide) og SKOV3 (serøs) Type II ovariecancere) såvel som i (C) ascites prøver fra høj kvalitet serøse ovariecancerpatienter med kemoresistens, indsamlet på to på hinanden følgende tidspunkter under sygdomsprogression (TP, tidspunkt vist som Western-blot ; B2M, beta-2-mikroglobulin blev anvendt som ladningskontrol). (D) Resultater for SFRP4, aktiveret β-catenin (ABC), β-catenin, GSK3 β præsenteres kvantitativt ved hjælp af densitometrisk analyse fra et eksperiment på patientens ascites prøver.

Korrelation af SFRP4 væv udtryk med forskellige klinisk-patologiske parametre

SFRP4 lokalisering blev derefter målt på proteinniveauet grundet dens foreslåede funktion i membranen, cytoplasma og undertiden også i kernen af ​​celler (figur 2) ved anvendelse IHC i en stor gruppe af 721 patienter på væv microarrays knyttet til omfattende opfølgende data (tabel 1). Membranøs farvning kunne identificeres ved celle-celle-grænse og på den apikale membran, hvilket er i overensstemmelse med dets foreslåede sekretoriske funktion. Vores kohorte indarbejdet 281 kontrolpatienter, der var raske eller havde godartede tilstande som endometriose eller cystadenomas /-fibromas. Kræften bestod også af 440 patienter med borderline tumorer eller invasive kræft i det meste i æggestokkene (69,8%), men også endometrie (11,3%) og andre oprindelser (18,9%). Den gennemsnitlige alder ved diagnose var 57,1 år (19-88 år) for hele kohorten, med middelværdien for kontrolgruppen var fem år yngre end kræft kohorte (53,7

vs.

58,9 år). Vores omfattende database indarbejdet opfølgende data fra en periode på 29 år maksimum (betyder for begge kohorter 48,4 måneder (1-348 måneder)).

IHC demonstrerer repræsentativ SFRP4 proteinekspression på to forstørrelser (× 10 venstre kolonne , × 40 højre spalte) i normale væv (ovarie overflade epitel (A) og tubal epitel (B)) og forskellige typer af ovariecancere (endometrioide (C), serøs (D) og klar celle (E)).

SFRP4 var positivt udtrykt i væv i 296 af 721 patient væv (41,1%) og i 128 af 142 plasmaprøver (90,1%). Inden for cancer kohorten, 279 patienter (86,4%) havde høje kvalitet tumorer (grad 3) og 221 patienter (55,3%) præsenteret med avanceret (FIGO III /IV) stadie sygdommen. Den femårige dødelighed i hele cancer /Type I /Type II kohorte var 29,5 /20,6 /41,3%, hhv. Den femårige tilbagefald i de samme kohorte undergrupper var 20,5 /15,3 /27,5%, henholdsvis, hvilket afspejler et repræsentativt kræft kohorte.

Mulige sammenhænge mellem SFRP4 udtryk bestemt både i væv og plasma, med klinisk-patologiske parametre afledt vores interne klinisk-patologisk database (PEROHU database adgang (Microsoft, Seattle USA)) blev vurderet ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficient, r. Klinisk-patologisk parametre, der var tilgængelige inden vores kohorte inkluderet aborter, alder ved diagnose, BMI, CA125 niveauer, CA72-4 niveauer, HE4 niveauer, kvalitet og fase af kræft, residual sygdom, ascites ved diagnose, størrelse og bilaterality af ovarietumorer, performance status på diagnose, længden af ​​opfølgning, sygdomsspecifikke og tilbagefald overlevelse, platin kemoterapi, orale svangerskabsforebyggende eller hormonerstatningsterapier, graviditeter /leverancer, alder ved menarche og menopause, tilstedeværelsen af ​​acne, polycystiske ovarier, overskydende hår, barnløshed , infektioner, diabetes, forhøjet blodtryk, alkohol /narkotika indtag, rygning, indtagelse af ikke-steroide lægemidler, tidligere historie af hospitalsindlæggelser, brystkræft, endometriose, fibromer, ovariecyster og tidligere historie af kræft eller familiære kræftformer.

den eneste moderat stærk korrelation fundet til SFRP4 ekspression både i væv og plasma blev detekteret i tilfælde af ascites er til stede ved første diagnose (SFRP4 IHC: r = 0,55, p = 0,01; SFRP4 ELISA: r = -0,60, p = 0,03 ). En anden moderat stærk sammenhæng var til stede til amning når korreleret til SFRP4 plasma udtryk (r = -0,79, p = 0,06). Men det er af borderline betydning som prøvens størrelse for amning var temmelig lille. Svage korrelationer blev fundet for BMI (SFRP4 IHC: r = 0,19, p = 0,003) og den nye tumormarkør HE4 (SFRP4 ELISA: r = -0,25, p = 0,02) [34]. Et marginalt signifikant sammenhæng kunne påvises for tidligere historie af gynækologiske operationer (IHC: p = 0,038, ELISA: p = 0,099), hormonbehandling (ELISA: p = 0,097) og alkohol indtag. (IHC: p = 0,098)

SFRP4 udtryk i stigende grad tabt under malign transformation

som ville have været forudset fra dens formodede funktion, SFRP4 udtryk præsenteres især som membran og cytoplasmatisk farvning. Fra alle undersøgte væv, kun den fimbriale ende af æggelederen udtrykt nuklear SFRP4 farvning, som var en temmelig uventet fund (fig 2 B). Ovarie overfladeepitelet, som var indtil for nylig foreslået at være den ensartede oprindelsessted for de fleste æggestokkene kræftformer, vises kun minimal cytoplasmatisk og ingen membran farvning, som det var tilfældet for integration cyster, placering af metaplastiske ændringer i æggestokkene. Den højeste SFRP4 udtryk inden for alle undersøgte væv blev fundet i æggelederne epitel, hvilket er i overensstemmelse med vores resultater på RNA-niveau i primære æggelederne kulturer (Figur 1 A). De nyligt foreslåede type II kræftformer er i stigende grad menes at have deres oprindelse i fimbrial ende af æggelederen, som skal da hellere være den normale kontrol for de fleste kræftformer (38). Faktisk fandt vi et fald i kumulativ SFRP4 udtryk fra tubal epitel, godartede væv (herunder æggestokkene overflade epitel og integration cyster), endometriose at borderline tumorer og kræft (Figur 3.1 A, B), igen i overensstemmelse med den tendens, vi fandt ved RT -qPCR i cellelinjer (figur 1 A). Tab af SFRP4 udtryk fra godartet til kræft var statistisk signifikant, både målt som membran udtryk alene (p 0,0001 samlet, Figur 3.2, Benign

vs

Kræft, p = 0,07;. Borderline

vs.

Kræft, p 0,0001), og når membranen, cytoplasma og nuklear udtryk blev målt i kombination (p = 0,0004 samlet, Figur 3.1 A; Benign

vs

Kræft, p = 0,039;. Borderline

vs.

Cancer, p = 0,002). Mens en underafdeling af membranfarvning var vanskeligt at måle på grund af små prøvestørrelser i membran-udtrykkende væv, den højeste ekspression i den godartede gruppe for den samlede SFRP4 ekspression var i tubal epitel, efterfulgt af endometriose og lavest i æggestokkene overflade epitel og inklusion cyster (Figur 3.1 B; Tube vs. OSE, s 0,0001; Tube vs. endometriose, p = 0,014).

Boxplots repræsenterer kumulativ SFRP4 udtryk (arbitrære enheder) i cytoplasma, membran og kernen (SFRP4 Expression i