PLoS ONE: Tab-of-Function PTPRD Mutationer føre til øget STAT3 Aktivering og følsomhed til STAT3 Hæmning i hoved og hals Cancer

Abstrakt

Baggrund

proteintyrosinphosphatase receptor type D (PTPRD ) er en formodet tumorsuppressor i flere kræftformer, herunder hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC). STAT3 er et hyppigt hyperaktiveret onkogen i HNSCC. Som STAT3 er en direkte substrat af PTPRD, vi søgte at bestemme genetiske eller epigenetiske ændringer af

PTPRD

der bidrager til overaktiv STAT3 i HNSCC.

Metoder

Vi analyserede data fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) og vores tidligere hel-exome sekventering undersøgelse og sammenfattet mutationen, methylering og kopiere antal status

PTPRD

i HNSCC og andre kræftformer.

In vitro

undersøgelser involverede standard transfektion og MTT-protokoller, samt methylering-specifik PCR.

Resultater

Vores resultater viser, at

PTPRD

mutation, snarere end methylering eller kopital ændring, er den primære mekanisme, ved hvilken PTPRD funktion er tabt i HNSCC. Vi viser, at overekspression af vildtype PTPRD i HNSCC celler signifikant inhiberer vækst og STAT3-aktivering, mens PTPRD mutanter ikke, hvilket antyder, at mutationen kan føre til tab af funktion og efterfølgende hyper-phosphorylering af PTPRD substrater, især STAT3. Vigtigt er det, vi fastslået, at HNSCC celler, der huser et endogent

PTPRD

mutation er mere følsomme over STAT3 blokade end

PTPRD

vildtypeceller. Vi har desuden fundet, at

PTPRD

mRNA-ekspression ikke korrelerer med pSTAT3 udtryk, hvilket tyder på, at ændringer, der manifesterer gennem ændret mRNA-ekspression, herunder hypermethyleringsassocierede og gen kopi nummer ændringer, ikke bidrage væsentligt til STAT3 overaktivering i HNSCC.

Konklusion

PTPRD

mutation, men ikke methylering eller kopiere nummer tab, kan tjene som en prædiktiv biomarkør for følsomhed over for STAT3-hæmmere i HNSCC

Henvisning.: Peyser ND, Du Y, Li H, Lui V, Xiao X, Chan TA et al. (2015) Tab-of-Function

PTPRD

Mutationer medføre øgede STAT3 Aktivering og følsomhed til STAT3 Hæmning i hoved- og halscancer. PLoS ONE 10 (8): e0135750. doi: 10,1371 /journal.pone.0135750

Redaktør: Qian Tao, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Marts 26, 2015; Accepteret: 25 Juli 2015; Udgivet: 12. august 2015

Copyright: © 2015 Peyser et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Genomisk og proteomisk data er tilgængelige fra The Cancer Genome Atlas (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm) og The Cancer Proteome Atlas (https://app1.bioinformatics.mdanderson.org/tcpa/_design /basic/index.html)

finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (www.nih.gov) finansiering P50CA097190 og R01CA77308 til JRG, og F31DE024007 til NDP, American Cancer Society (www .cancer.org) til JRG, Kina Scholarship Rådet (https://en.csc.edu.cn) til YD, og ​​General Fund Research fra Research Grant Råd Hongkong (http: //www.ugc. edu.hk/) 17114814 og startkapital for Basic Research til VL

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

proteintyrosinphosphatase receptor type D (PTPRD) er et medlem af receptoren-typen proteintyrosinphosphatase (PTPR) familie. PTPRs er membranbundne integrerende enzymer, som katalyserer fjernelsen af ​​phosphatgrupper fra specifikke proteiner, derved påvirker cellesignalering. Dysregulering af PTPR signalering ved genetiske og /eller epigenetiske mekanismer kan derfor i sidste ende føre til kræft fænotyper. [1] Flere PTPR familiemedlemmer, herunder PTPRD, er blevet rapporteret til at fungere som tumorsuppressorer hvor tab af funktion ændringer kan drive tumorvækst. [2,3] Genetiske arrangementer, herunder mutation, gendeletion eller epigenetisk inaktivering kan føre til nedsat phosphataseaktivitet af PTPRs og øget onkogene signalering. [1]

Vi har for nylig rapporteret den kumulative mutation profil af

PTPR

gen familie i kræft med fokus på

PTPRT

mutation fører til STAT3 aktivering i hoved og hals skællede cellecarcinom (HNSCC). [4] Vores analyse viste, at 15 solide tumorer husede mutationer af mindst en

PTPR

gen.

PTPRD

er en af ​​de mest almindeligt muterede

PTPR

familiemedlemmer i HNSCC og PTPRD er blevet rapporteret til at fungere som en tumorsuppressor i denne malignitet. [5]

PTPRD

også muteret, slettet eller hyper-methyleret i glioblastom (GBM), medens genet er ikke-methyleret og udtrykt i normalt hjernevæv. [6] Endvidere

PTPRD

mutationer blev fundet, at være forbundet med forøget ekspression af phosphoryleret STAT3, en direkte PTPRD substrat, i GBM. Foruden GBM, 13% og 25% af HNSCC tumorer analyseret i den ovennævnte undersøgelse nærede

PTPRD

mutation eller promotor methylering hhv. Homozygot sletning af

PTPRD

har desuden været rapporteret i larynx cancer, hvilket tyder på, at genetiske afvigelser, der påvirker PTPRD funktion kan være en fælles begivenhed på tværs af mange kræftformer. [5]

Disse kumulative fund førte os til hypotesen, at genetiske og /eller epigenetisk ændring af

PTPRD

kan bidrage til øget signalering og vækst i HNSCC hvor centrale elementer i vejen kan tjene som plausibel terapeutiske mål. Her har vi opsummere den genetiske og epigenetiske profil

PTPRD

i HNSCC fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) og vores tidligere HNSCC mutations landskab undersøgelse. [7] Vi derefter testet konsekvenserne af

PTPRD

ændringer fundet i humane HNSCC tumorer i relevante prækliniske modeller til vurdering STAT3 aktivitet og følsomhed over for STAT3 hæmning.

Materialer og metoder

Cell kultur, medicinsk behandling, og transfektion

Alle HNSCC cellelinjer blev genotypisk verificeret som tidligere beskrevet. [4] Cal27 celler blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). PE /CA-PJ34clone12 og PE /CA-PJ49 celler blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). 686LN-celler blev opnået fra Georgia Chen på MD Anderson Cancer Center (Houston, TX). Cal27 celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Mediatech, Inc., Manassas, VA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA). 686LN-celler blev dyrket i DMEM /F12 (Life Technologies, Grand Island, NY) suppleret med 10% FBS. PE /CA-PJ34clone12 og PE /CA-PJ49 blev dyrket i Iscoves Modifikation af DMEM (Mediatech Inc., Manassas, VA) suppleret med 10% FBS og 2 mM L-glutamin (Life Technologies, Grand Island, NY). Alle celler blev holdt i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2. JSI-124 (Calbiochem, Billerica, MA) blev opløst i DMSO. Transfektion blev udført med lipofectamin 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY) eller FuGENE HD (Promega Corporation, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner med 4 ug DNA fortyndet i Opti-MEM (Life Technologies, Grand Island, NY).

site-directed mutagenese

PTPRD

mutationer (K1502M, S384R, T1100M og L1147F) blev genereret fra plasmidet vildtype ved hjælp af Phusion mutagenese kit ( Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ved at følge fabrikantens protokol og bekræftet ved Sanger-sekventering. Plasmid amplifikationer blev udført under anvendelse af QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) eller orkanen Maxi Prep Kit (GerardBIOTECH, Oxford, OH) ifølge producentens instruktioner.

immunblotting

Primært antistoffer til pSTAT3 (Y705) og STAT3 blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). p-tubulin primære antistof blev købt hos Abcam (Cambridge, MA). Sekundære antistoffer blev købt hos BioRad (Hercules, CA). Blots blev kvantificeret ved densitometri under anvendelse ImageJ software.

MTT assay

MTT-assays blev udført ved at inkubere celler i 5 mg /ml 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2 , 5 diphenyl tetrazoliumbromid i PBS ved i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO

2. Efter inkubation blev opløsningen bortsuget og erstattet med DMSO. Absorbansen af ​​denne opløsning blev målt ved 570 nm på et spektrofotometer.

Methylering-specifik PCR

Tumor og normalt væv blev opnået i regi af en Institutional Review Board-godkendt protokol ved University of Pittsburgh. DNA blev isoleret fra formalinfikseret paraffinindlejret væv under anvendelse af QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, og cellelinje-DNA blev isolering under anvendelse af QIAamp DNA Mini Kit. Omdannelse med bisulfit blev udført under anvendelse af EpiTect bisulfit Kit og methyleringsspecifik polymerasekædereaktion (MSP) blev udført ved anvendelse EpiTect MSP Kit. Alle sæt anvendtes i overensstemmelse med producentens instruktioner (Qiagen, Hilden, Tyskland). MSP primere blev designet ved hjælp MethPrimer software. [8] For methylering, de fremadrettede og reverse primer sekvenser var GTTTTATTTTGGATTTTTGGAATC og TACCTAACGCGACCTAAACG hhv. For unmethylation, de fremadrettede og reverse primer sekvenser var TATTTTGGATTTTTGGAATTGT og AACTACCTAACACAACCTAAACAAA hhv. Primere var specifikke for den tilsigtede status methylering som bestemt ved anvendelse af EpiTect Kontrol DNA Set (Qiagen, Hilden, Tyskland).

Data download og analyse

Mutation, kopiere nummer ændring, og RNA-Seq data blev samlet fra cBio Portal [9,10] og offentliggjorte rapporter. [6,7,9] DNA methylering data blev opnået gennem TCGA data matrix (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm). DNA- og protein-sekvenser og domæne anmærkninger blev opnået fra National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Omvendt fase protein array-data blev indhentet fra The Cancer Proteome Atlas (https://app1.bioinformatics.mdanderson.org/tcpa/_design/basic/index.html). Statistiske tests blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism 5 software (GraphPad, La Jolla, CA).

trypanblåteksklusion

PE /CA-PJ34clone12 celler blev udpladet på 6-brønds plader med 100.000 celler pr godt. Efter 24 timer blev cellerne transficeret med vektor kontrol, vildtype PTPRD eller PTPRD mutanter i tre eksemplarer anvendelse af 4 ug plasmid-DNA, 12 pi FuGENE HD (Promega Corporation, Madison, WI), og 200 pi Opti-MEM (Life Technologies , Grand Island, NY) per brønd tilsat direkte til brønde indeholdende 3 ml komplet medium. Efter 72 timer blev cellerne trypsinbehandlet og resuspenderet i PBS indeholdende 0,2% trypanblåt (MP Biomedicals, LLC, Santa Ana, CA). Hver celle suspension blev talt i fire felter på et hæmacytometer og den gennemsnitlige blev anvendt til at beregne det totale antal celler til stede.

Resultater

PTPRD mutationer forekommer hyppigt i HNSCC og andre kræftformer

somatisk mutation er en almindelig begivenhed, der medfører ændret gen og proteinfunktion i cancer. Atten ikke-synonym

PTPRD

mutationer er blevet identificeret til dato i HNSCC tumorer. [6,7,9,10] Disse mutationer vises spredt over hele genet og protein sekvens. (Fig 1A) De er alle ikke-tilbagevendende, med hver forekommer i et enkelt HNSCC tumor, hvilket tyder på, at disse er sandsynligvis være tab af funktion mutationer. Af disse 18 mutationer, 12 forekommer i det ekstracellulære domæne, er 1 lokaliseret til det katalytiske domæne, og 5 er i den transmembrane region, hvor der ikke konserverede domæne er blevet identificeret. Udover HNSCC,

PTPRD

mutationer er også meget observeret i andre typer kræft. (Fig 1B) In The Cancer Genome Atlas (TCGA) indsamling,

PTPRD

oftest muteret i kutant melanom (59/344 sager, 17,2%), efterfulgt af lunge adenocarcinom (33/230 sager, 14,3% ), og mave-adenocarcinom (30/289 sager, 10,4%). [9,10] Som i HNSCC,

PTPRD

mutationer i disse kræftformer synes ikke at klynge i hotspot regioner eller rester, tyder på, at tabet af PTPRD funktion ved somatisk mutation er en almindelig begivenhed på tværs af flere kræft sites.

(A) Lokalisering af PTPRD protein mutationer rapporteret i HNSCC tumorer. Rød: TCGA tumorer [9,10]; Grøn: fra [6]; Blå: fra [7]. IG, Immunoglobulin; IG2, Second immunglobulin (Ig) -lignende domæne af receptoren proteintyrosinphosphatase (RPTP) -F; FN3, fibronectin type 3 domæne; PTPc, proteintyrosinphosphatase, katalytiske domæne. (B) Hyppigheden af ​​

PTPRD

mutationer i humane kræftformer som bestemt ved TCGA, med HNSCC vist i rødt.

Den eneste mutation påvist i HNSCC, der tidligere er blevet identificeret i en anden kræft er T1100M, som blev rapporteret i kronisk lymfatisk leukæmi. [11] Interessant flere andre mutationssteder findes i HNSCC har en anden aminosyresubstitution rapporteret i andre kræftformer. For eksempel, mens K204E observeres i HNSCC, K204Q er blevet rapporteret i esophageal cancer. [12] Desuden en gennemgang af COSMIC database (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/) demonstrerer påvisning af L503V i leverkræft (sammenlignet med L503I i HNSCC) og L1036M i tyktarmen adenocarcinom (sammenlignet med L1036P i HNSCC). Ding

et al

desuden rapporteret en mutation på dette site (L1036Q) i lunge adenocarcinom. [13] Det er interessant, mens K1502M er den eneste katalytiske domæne mutation er identificeret til dato i HNSCC, TCGA har identificeret en K1502 * nonsense mutation i lunge adenocarcinom. Sammen disse resultater tyder på, at mens den specifikke

PTPRD

mutationer fundet til dato i HNSCC er unikke, kan aminosyre-steder, hvor de forekommer repræsenterer vigtige rester, der er modtagelige for genetiske ændringer. Faktisk multipel sekvensalignment analyse viser, at disse rester er stærkt konserverede på tværs af arter, hvilket tyder på at de kan have en kritisk rolle i korrekt PTPRD funktion (analyse ikke vist).

HNSCC-afledte PTPRD mutanter føre til øget cellevækst

PTPRD er blevet rapporteret til at tjene som en tumorsuppressor i human cancer. [3,5,6] For at bestemme de funktionelle konsekvenser af

PTPRD

mutation i HNSCC, vi genereret flere repræsentative HNSCC-afledte PTPRD mutanter ved site-directed mutagenese, herunder en mutation i det ekstracellulære domæne (S384R), en i det katalytiske domæne (K1502M), og to i den transmembrane region (T1100M og L1147F). Forbigående overekspression af disse konstruktioner i en HNSCC cellelinje uden endogene

PTPR

familie mutationer (PE /CA-PJ34clone12) afslørede, at alle de testede PTPRD mutanter ført til øget vækst, bestemt ved MTT assay i forhold til PTPRD vilde -typen-transficerede celler. (Fig 2A) MTT assay resultater blev yderligere bekræftet med repræsentative mutanter ved trypan blå-udelukkelse assay i PE /CA-PJ34clone12 celler (Fig 2B). Kollektivt antyder disse resultater, at

PTPRD

mutationer inaktiverer tumor undertrykkende funktion af PTPRD uanset deres lokalisering i hele genet, hvilket fører til øget vækst /proliferation i HNSCC celler.

(A) Cellevækst blev vurderet ved MTT-assay 48 timer efter transfektion og normaliseret til vektor-transficerede kontroller. En-vejs ANOVA P = 0,0007. Afbildet P-værdier repræsenterer resultaterne af parvise tosidede uparret t-tests. Eksperimentet blev udført tre gange med lignende resultater. (B) Celleproliferation blev vurderet ved trypan-blå-udelukkelse assay 72 timer efter transfektion. En-vejs ANOVA P 0,0001. Afbildet P-værdier repræsenterer resultaterne af parvise tosidede uparrede t-tests.

PTPRD mutation er forbundet med forøget pSTAT3 ekspression

STAT3 er hyper-aktiveres ved konstitutiv phosphorylering af tyrosin 705 ( Y705) i mange cancertyper, herunder HNSCC. [14,15] Vigtigere, pSTAT3 (Y705) er en kendt direkte substrat af PTPRD. [6] For at bestemme virkningen af ​​

PTPRD

mutation på STAT3 fosforylering i HNSCC, vi først undersøgt 200 HNSCC tumorer med både hele exome sekventering og RPPA analyser udført af TCGA og The Cancer Proteome Atlas (TCPA). HNSCC tumorer med ikke-synonym

PTPRD

mutationer udtrykker signifikant højere niveauer af pSTAT3 (Y705) i forhold til tumorer med vildtype

PTPRD

(Fig 3A). Især

PTPRD

er den eneste

PTPR

familiemedlem, som der observeres denne sammenhæng. For at teste sammenhængen mellem

PTPRD

mutation og pSTAT3 udtryk direkte, vi transficeret en HNSCC cellelinje med kendt endogene

PTPRD

mutation (Cal27 huser mutation S387L) med vildtype

PTPRD

eller vektorkontrol og fundet, at overekspression af vildtype PTPRD fører til signifikant nedsat pSTAT3 ekspression (P ≤ 0,05). (Fig 3B og 3C) Endvidere overekspression af mutant PTPRD i HNSCC celler uden endogene

PTPR

familie mutationer (PE /CA-PJ34clone12) fører til forøget pSTAT3 (Y705) ekspression i forhold til PTPRD vildtype-overudtrykkende celler for næsten alle mutationer testet. (Fig 3D og 3E) Tilsammen udgør disse resultater viser, at

PTPRD

mutation fører til øget STAT3 signalering i HNSCC celler og tumorer.

(A) HNSCC tumorer huser

PTPRD

mutationer udtrykkelig øget pSTAT3 (Y705) i forhold til

PTPRD

vildtype-tumorer som bestemt ved hele exome sekventering og omvendt fase protein array (RPPA). To-halet uparret t-test. (B) Overekspression af vildtype PTPRD i en

PTPRD

-mutant cellelinie (Cal27) fører til nedsat pSTAT3 (Y705) ekspression (C) Kvantificering af tre gentagne forsøg, som vist i B. tosidet uparrede t-test. (D)

PTPRD

-Wild-typen HNSCC celler (PE /CA-PJ34clone12) forbigående overekspression mutant PTPRD udviser øget pSTAT3 (Y705) udtryk i forhold til vildtype-udtrykkende celler. (E) Kvantificering af tre gentagne forsøg, som vist i D. To-halet uparret t-test.

HNSCC celler med endogen PTPRD mutation er mere følsomme over STAT3 pathway inhibering

Siden

PTPRD

mutationer øger STAT3 aktivering i HNSCC, vi næste forsøgt at afgøre, om

PTPRD

mutation fører til øget følsomhed over for STAT3 pathway hæmning. For at teste vores hypotese, vi ansat HNSCC celler, der huser en endogen

PTPRD

mutation (PE /CA-PJ49). Behandling med JAK /STAT-inhibitor JSI-124 svælger at disse

PTPRD

mutant celler udviser forøget følsomhed i forhold til

PTPR

familie vildtypeceller (PE /CA-PJ34clone12), tyder på, at

PTPRD

mutation kan tjene som en prædiktiv biomarkør for effekt af STAT3 pathway hæmmere (fig 4).

Celler blev behandlet med stigende koncentrationer af JSI-124 i 24 timer efterfulgt af MTT-assayet. Eksperimentet blev udført tre gange med lignende resultater.

PTPRD mRNA-ekspression ikke korrelerer med pSTAT3 udtryk

Promotor hypermethylering og genkopitallet tab repræsenterer to yderligere mekanismer, der kan føre til tab af funktion af

PTPRD

via nedregulering af mRNA-ekspression. Vigtigere er det,

PTPRD

mRNA-ekspression ikke korrelerer med pSTAT3 udtryk i TCGA HNSCC prøver, hvilket antyder, at methylering og eksemplarnummer tab ikke bidrage væsentligt til STAT3 overaktivering i HNSCC (S1A Fig). Faktisk en mere detaljeret analyse afslører, at mens

PTPRD

methylering ikke korrelerer med mRNA udtryk som ville forventes for enhver gen (S1B Fig), vi observerer ingen sammenhæng mellem methylering og pSTAT3 udtryk (S1c Fig), heller ikke vi observere eventuelle tilfælde af afvigende promotor hypermethylering (her defineret som en methylering niveau på mere end tre standardafvigelser over middelværdien methylering af det samme genetiske locus i organ-matchede normale prøver). For at validere disse resultater, vi udførte methylering-specifik PCR på en uafhængig kohorte af HNSCC tumorer og fandt beviser for

PTPRD

promotor methylering i 75% af tumorer analyseret (30/40) (repræsentativ analyse S2 Fig ). Vigtigt er det, vi også observeret

PTPRD

promotor methylering i fem parrede normale mundslimhinden prøver fra disse HNSCC patienter (S3 Fig), hvilket yderligere tyder på, at

PTPRD

methylering observeret i HNSCC ikke tumor-specifikke .

PTPRD

kopital ændringer forekommer i væsentlig grad i HNSCC og andre cancere (fig 5A), hvor genkopier tab, især heterozygote tab, forekommer hyppigere end gevinst i HNSCC og alle cancere analyseret med undtagelse af colorektal og livmoderhalskræft. Vigtigere er det, vi ikke oplever en betydelig korrelation mellem kopital ombygninger og mRNA-ekspression i HNSCC (Fig 5B). Sammen disse resultater tyder på, at promotor hypermethylering og genkopitallet tab ikke bidrage væsentligt til STAT3 overaktivering i HNSCC.

(A) Kopi nummer ændring af

PTPRD

i humane kræftformer bestemt af TCGA . (B)

PTPRD c

Kopier nummer ændringer ikke korrelerer med ændret

PTPRD

mRNA-ekspression i HNSCC. En Jonckheere-Terpstra-test blev udført under anvendelse StatXact software (Cytel, Cambridge, MA).

Discussion

STAT3 er et onkogen, som er hyper-aktiveret i mange cancertyper, herunder HNSCC, hvor STAT3 hyper-aktivering er forbundet med nedsat overlevelse og emergent modstand mod EGFR-målrettet terapi. [9,16,17] Potentielle mekanismer, der kan resultere i øget STAT3 aktivering i kræft omfatter øget signalering gennem upstream receptor eller ikke-receptortyrosinkinaser såsom EGFR og JAK, og /eller inaktivering af negative regulatorer af STAT3, herunder protein tyrosinphosphataser . [18,19] Vi har for nylig rapporteret, at receptoren-typen proteintyrosinphosphatase (PTPR) familie ofte er muteret i HNSCC og andre kræftformer og viste, at HNSCC-afledte mutationer af PTPRT inducerer STAT3 phosphorylering og drev HNSCC celleoverlevelse. [4] Som PTPRD udgør en yderligere receptor-lignende fosfatase, der direkte retter sig mod STAT3, vi søgte at afgøre, om genetisk eller epigenetisk tab af PTPRD funktion kan bidrage til STAT3 overaktivering i HNSCC.

I den foreliggende undersøgelse, vi først identificeret 18 tidligere karakteriserede

PTPRD

mutationer i HNSCC tumorer. Disse mutationer er ikke-tilbagevendende og er placeret i hele gen, et mønster, der er i overensstemmelse med generelt observeret for tumorsuppressorgener. Vi har vist, at overekspression af vildtype PTPRD fører til væksthæmning i HNSCC celler, medens overekspression af repræsentative mutanter ikke, således at der skabes en funktionel konsekvens af

PTPRD

mutation i HNSCC modeller. Disse resultater er i overensstemmelse med de tidligere

in vitro

undersøgelser på tværs af flere kræftformer, herunder glioblastom, melanom, kolorektal cancer, og neuroblastom, hvor vildtype PTPRD er blevet observeret at undertrykke koloni dannelse og cellevækst samt som øge apoptose, mens kræft-afledt PTPRD mutanter ikke. [3,6,20] Disse kumulative fund tyder på, at

PTPRD

mutationer i kræft fører til tab af sin tumor undertrykkende funktion.

For at afgøre, om

PTPRD

mutation påvirker aktiviteten af ​​STAT3, et PTPRD substrat, analyserede vi TCGA og TCPA data og fandt, at HNSCC tumorer med

PTPRD

mutationer udtrykker signifikant forhøjede pSTAT3 (Y705) i forhold til

PTPRD

-Wild-typen tumorer. Vi har tidligere rapporteret en lignende sammenhæng mellem pSTAT3 (Y705) udtryk og mutation af en gruppe af formodet

PTPR

tumorsuppressorgener, herunder

PTPRD

. [4] Når hver gen betragtes individuelt i stedet for som en gruppe,

PTPRD

er den eneste

PTPR

familiemedlem, for hvilken mutation signifikant associeret med pSTAT3 (Y705) udtryk (S4 Fig) . Dette resultat antyder, at mens antallet af tumorer huser en mutation i et enkelt

PTPR

familiemedlem kan være utilstrækkelig til at påvise en signifikant forskel i pSTAT3 (Y705) ekspression,

PTPRD

mutation i særdeleshed er entydigt forbundet med en stigning i pSTAT3 (Y705) udtryk, der er tilstrækkelig stor til at detektere statistisk signifikans. Desuden diskuteres overekspression af vildtype PTPRD i HNSCC cellelinjer huser endogene

PTPRD

mutationer fører til nedregulering af pSTAT3 (Y705), hvilket bekræfter, at PTPRD regulerer STAT3 aktivering i HNSCC modeller. Mens vildtype PTPRD fører til nedregulering af pSTAT3 (Y705) i HNSCC celler, går overekspression af de fleste HNSCC-afledte mutanter ikke ændre pSTAT3 (Y705) ekspression i forhold til vektor kontrol, hvilket antyder, at disse mutationer fører til tab af funktion, men ikke i en dominant negativ måde. I tilfælde af den testede heri L1147F mutation, overekspression i HNSCC celler fører til øget vækst, men ikke øget pSTAT3 (Y705) ekspression (se fig 2A og 3D), hvilket indikerer, at visse mutationer kan føre til kræft fænotyper i et STAT3-uafhængig måde . Disse mutationer kan manifestere gennem alternative mekanismer, der kan omfatte ekstracellulære interaktioner eller ændring af relative affinitet for alternative enzymatiske substrater.

Som

PTPRD

mutation fører til øget STAT3 aktivering i HNSCC, vi næste testede, om celler huser en

PTPRD

mutation kan være mere følsomme over for STAT3 pathway inhibering. Her demonstrerer vi, at HNSCC celler med et endogent

PTPRD

mutation er mere følsomme over for JAK /STAT-inhibitor JSI-124 end HNSCC celler huser ingen

PTPR

familie mutationer, tyder på, at HNSCC tumorer med

PTPRD

mutationer kan være udsøgt følsomme over for STAT3 inhibitorer, som i øjeblikket er i præklinisk og klinisk udvikling. For at udtænke en optimal behandlingsstrategi for HNSCC patienter med

PTPRD

mutationer, yderligere undersøgelse af yderligere PTPRD-interagerende proteiner, der kan tjene som terapeutiske mål kan være berettiget. Især

PTPRD

mutation kan desuden give følsomhed over for aurora kinase A hæmmere i klinisk udvikling, hvor aurora kinase A phosphorylering og stabilitet normalt reguleret af PTPRD. [3]

En yderligere mekanisme, som

PTPRD

funktion kan gå tabt, er gennem mRNA nedregulering, herunder ved promotor hypermethylering eller genkopital tab. Først, vi bestemt, at

PTPRD

mRNA-ekspression ikke korrelerer med pSTAT3 udtryk i HNSCC, hvilket tyder på, at disse mekanismer er ikke sandsynligt, at bidrage væsentligt til STAT3 overaktivering i HNSCC. Det skal bemærkes, at denne analyse kan kompliceres af de mange sager, hvor lidt eller ingen

PTPRD

mRNA blev detekteret. Faktisk vores overekspression studier i HNSCC celler antyder, at det kunne forventes ekspression af PTPRD at påvirke pSTAT3 (Y705) ekspression. Ikke desto mindre har denne sammenhæng ikke opstod i HNSCC tumorer analyseret til dato.

En mere detaljeret analyse af disse mekanismer næste afslørede, at

PTPRD

promotor ikke hypermethyleret i HNSCC forhold til orgel-matchede normalt væv, en konstatering vi valideret i en uafhængig kohorte af HNSCC tumor og matchede normale par ved methylering-specifik PCR. Forskellen mellem vores nuværende resultater og tidligere rapporter om

PTPRD

promotor methylering i HNSCC skyldes sandsynligvis forudgående manglende sammenligning mellem tumor og normalt væv. [6] Det lave

PTPRD

promotor methylering observeret i HNSCC er desuden ikke forbundet med ændret pSTAT3 (Y705) udtryk, hvilket yderligere tyder på, at denne begivenhed ikke bidrage væsentligt til kræft fænotype i HNSCC. En lignende mangel på afvigende

PTPRD

promotor hypermethylering er også blevet rapporteret i kutant planocellulært karcinom, hvilket tyder på dette kan være en usædvanlig begivenhed i flere epitelial maligniteter. [21]

Vores analyse af TCGA data tyder på, at næsten halvdelen af ​​HNSCC tumorer huser en kopi nummer ændring af

PTPRD

denne kopi nummer tab er hyppigere end kopiantals gevinst i HNSCC og tværs næsten alle cancerformer analyseret.

PTPRD

homozygot eller heterozygot sletning er også blevet rapporteret i kutant planocellulært karcinom [21,22], GBM [6,20,23,24], lungekræft [25,26], neuroblastom [27], metastatisk melanom [28,29], pladecellecarcinom i vulva [30], hepatocellulært carcinom [31], og larynx pladecellecarcinom [5]. Vigtigt er det, var ikke signifikant sammenhæng påvist mellem

PTPRD

kopi nummer ændring og

PTPRD

mRNA-ekspression i HNSCC, tyder på, at kopi nummer tab er ikke den primære mekanisme for tab af PTPRD funktion i HNSCC.

som konklusion har vi vist heri, at somatisk mutation af

PTPRD

er den primære mekanisme, hvorved PTPRD tab af funktion sker i HNSCC. Vi foreslår, at næsten alle disse mutationer føre til tab af katalytisk aktivitet og dermed reduceret dephosphorylering af substratet pSTAT3 (Y705). Mens promotor methylering og eksemplarnummer tab kan påvises på

PTPRD

locus, er disse begivenheder, som ikke er forbundet med opregulering af pSTAT3 (Y705) udtryk. I modsætning hertil somatisk mutation af

PTPRD

fører til øget STAT3 aktivering i HNSCC tumorer og cellelinjer, samtidig med øget cellevækst og følsomhed over for STAT3 pathway hæmning. Disse resultater tyder på, at

PTPRD

mutation kan repræsentere en prædiktiv biomarkør for udsøgt respons på STAT3 målrettet terapi i HNSCC.

Støtte Information

S1 Fig.

PTPRD

promotor methylering korrelerer med

PTPRD

mRNA-ekspression, men ikke korrelerer med pSTAT3 (Y705) udtryk i HNSCC.

(A)

PTPRD

mRNA udtryk er ikke signifikant associeret med pSTAT3 (Y705) udtryk. n = 172, Pearson r = 0,05157, P = 0,5017, R

2 = 0,002659. (B)

PTPRD

promotor methylering korrelerer med

PTPRD

mRNA-ekspression. n = 172, Pearson r = -0,5242, P 0,0001, R

2 = 0,2747. (C)

PTPRD

promotor methylering er ikke signifikant associeret med pSTAT3 (Y705) udtryk. n = 211, Pearson r = 0,0008795, P = 0,9899, ​​R

2 = 7.735e-007

doi:. 10,1371 /journal.pone.0135750.s001

(TIF)

S2 Fig. MSP-analyse af repræsentative HNSCC tumorprøver.

Methylering blev observeret i 30/40 (75%) HNSCC tumorer analyseres. M betegner primere amplificerer methylerede sekvenser, mens U betegner primere forstærke umethylerede sekvenser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0135750.s002

(TIF)

S3 Fig.

PTPRD

promotor er ikke hyper-methylerede i HNSCC tumorer sammenlignet med tilstødende normal slimhinde.

Fem HNSCC tumorer og matchet normal slimhinde fra de samme patienter blev indsamlet og analyseret af MSP. M betegner primere amplificerer methylerede sekvenser, mens U betegner primere forstærke umethylerede sekvenser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0135750.s003

(TIF)

S4 Fig.

PTPRD

er det eneste familiemedlem, for hvilken mutation er forbundet med pSTAT3 (Y705) udtryk i HNSCC.

Hele exome sekventering og omvendt-fase protein array-data viser, at ingen andre

PTPR