PLoS ONE: Resveratrol Hæmmer Cisplatin-induceret epithelial-til-Mesenchymale Transition i æggestokkene Cancer Cell Lines

Abstrakt

Baggrund

Mange patienter diagnosticeret med kræft i æggestokkene erfaring tilbagefald og metastase, to aspekter, som ofte vil forårsage deres død. Epiteliale-til-mesenkymale overgang (EMT) er en vigtig proces, der er involveret i kræft progression. Med stigende beviser, der forbinder cisplatin og EMT, vi ønskede at identificere en forbindelse i stand til at imødegå EMT progression når kræftceller behandles med cisplatin.

Metodologi /vigtigste resultater

Cell død blev evalueret ved cytometri med annexin V /PI-farvning i A2780 og A2780CP celler. Ovariecancer cellelinier blev behandlet med cisplatin (24 timer, 10 um) og forskellige koncentrationer af resveratrol til at vurdere dens virkning på cisplatin-induceret EMT anvendelse af Western Blot og RT-PCR-analyse. Morfologiske undersøgelser og sårheling assay til at evaluere cellemotilitet blev udført ved anvendelse 72 timer Cisplatin behandling med A2780 og A2780CP celler. Densitometri blev udført på Western Blot og PCR-resultater, og statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af One-Way ANOVA efterfulgt af Tukey post-hoc test. Vores resultater viser, at Cisplatin inducerede EMT-associerede morfologiske ændringer i A2780 ovariecancer cellelinje og i mindre grad i sin Cisplatin-resistent modstykke A2780CP. Resveratrol forårsagede celledød i A2780 og A2780CP cellelinjer i en apoptotisk-uafhængig måde. Resveratrol inhiberede Cisplatin-induceret Snail ekspression ved at reducere baneaktivering Erk, reverterede morfologiske ændringer induceret af cisplatin og nedsat cellevandring.

Konklusioner Salg

Disse resultater indikerer, at resveratrol har interessant potentiale til at forhindre cisplatin induceret EMT i æggestokkene cancerceller. Ved at øge celledød, den repræsenterer også en indbydende tilgang som supplerende behandling til anvendelse sammen med kemoterapi. Brug Erk pathway hæmmere kunne også vise sig nyttigt i æggestokkræft behandling for at reducere risikoen for metastaser

Henvisning:. Baribeau S, Chaudhry P, Parent S, Asselin É (2014) Resveratrol hæmmer Cisplatin-induceret epithelial-til- mesenchymale Overgang i æggestokkene kræftceller. PLoS ONE 9 (1): e86987. doi: 10,1371 /journal.pone.0086987

Redaktør: Goli Samimi, Kinghorn Cancer Center, Garvan Institute of Medical Research, Australien

Modtaget: Oktober 4, 2013; Accepteret: December 19, 2013; Udgivet: 22 Jan 2014

Copyright: © 2014 Baribeau et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er blevet støttet af en bevilling fra den canadiske Institutes for Health Research (MOP-66.987). EA har en canadisk forskning Stol i Molekylær-Gyneco-Oncology. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den syvende mest almindelige kræftform og den tredje mest almindelige blandt gynækologisk cancer i canadiske kvinder. Kræft i æggestokkene er også gynækologisk kræft med den højeste dødelighed og en 5-års overlevelse estimeret til kun 15-25% [1]. Dette kan forklares ved det faktum, at patienter med ovariecancer ofte allerede har en høj-stage sygdom på tidspunktet for diagnose [2], [3]. Den sædvanlige behandling for kræft i æggestokkene består af kirurgisk cytoreduktion efterfulgt af platinbaseret kemoterapi [4]. Trods indledende reaktion på behandlingen, vil mange patienter tilbagefald og i sidste ende blive påvirket af metastaser og i sidste ende mødes deres død.

Epithelial-til-mesenkymale overgang (EMT) er en fysiologisk proces, der opstår under fosterudviklingen og lejlighedsvis i voksne, for eksempel under sårheling [5]. EMT er et fænomen, i hvilken celler vil undergå en overgang fra en epithelial fænotype til en mere motile og invasive mesenchymale fænotype, hvilket gør dem i stand til at invadere væv og danne metastaser. Det vigtigste kendetegn for EMT er tabet af E-cadherin, en junction-protein udtrykkes typisk i epitelceller. I de fleste tilfælde er E-cadherin tab medieret af transskriptionelle repressorer, og mutationer af genet eller proteinet er ikke almindelige hændelser [6]. De hyppigst involveret repressorer omfatter Snail, Slug, og ZEB1 der direkte binder til E-cadherin promotor til at undertrykke sin transskription [7], [8]. Mange faktorer vides at inducere EMT, herunder cytokiner, såsom TGF-β [9] eller MAPK-Erk-vejen [10]. En nylig undersøgelse om kræft i æggestokkene rapporterede Cisplatin som en inducer af EMT [11].

Sneglen og Slug er transkriptionsfaktorer hovedsageligt kendt for deres engagement i EMT, hvor de undertrykker udtryk for epitel markører, såsom E-cadherin og Claudin-1, og øge ekspressionen af ​​mesenchymale markører, såsom ZEB1 og MMP-9 [12] – [16]. De kan også undertrykke ekspressionen og funktionen af ​​tumor suppressor p53 og fremme kemoresistens [17], [18]. Under EMT progression, antages det, at sneglen vil være den første faktor til at blive aktive at indlede overgangen henviser Slug ville blive udtrykt i senere faser for at tillade cellerne at bevare deres mesenchymale egenskaber [19]. ZEB1 er en anden vigtig fortaler for EMT ved at undertrykke ZO-1 og E-cadherin [20], men kan også være involveret i at øge udbredelsen på celler [21].

Resveratrol (trans-3,4 ‘ , 5-trihydroxystilbene) er en naturlig forbindelse, der produceres i mange planter, herunder røde druer [22], og efterfølgende til stede i vinen, er kendt for sin antioxidant og dens beskyttende virkninger på det kardiovaskulære system og mod kræft, hvor det kan hæmme flere stadier af sygdom [23]. I de seneste år, disse mange virkninger placeret Resveratrol i søgelyset for forskning.

I denne undersøgelse undersøgte vi virkningen af ​​resveratrol på cisplatin-induceret EMT i kræft i æggestokkene. Vi fandt, at celler co-behandlet med resveratrol og Cisplatin ikke viser de karakteristiske træk ved EMT, som Resveratrol behandling ophævet Cisplatin-induceret sneglen protein og mRNA udtryk på en dosis-afhængig måde. Dette involverede Erk-vejen, som blev hæmmet af Resveratrol og dets inddragelse blev bekræftet via specifik MEK1 /2-hæmning med U0126. Resveratrol blokerede også morfologiske ændringer i A2780 og A2780CP celler og reducerede migration evne A2780 og A2780CP celler under et sårhelende assay. Lignende hæmning af migration blev observeret i OVCAR-3 og SKOV-3 celler. Vi foreslår også β-catenin som en markør af resistens over for cisplatin-induceret apoptose, da det kun blev kløvet i Cisplatin-følsomme cellelinjer.

Metoder

Reagenser

Dulbeccos modificerede Eagle medium-F12 (DMEM-F12), og bovint vækst serum (BGS) blev købt fra HyClone (South Logan, Utah). Gentamycin, Cisplatin, og Resveratrol blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Den MEK1 /2-inhibitoren og Ældning β-galactosidase-farvning kit blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Dead celle apoptose kit med annexin-V /PI, Trizol-reagens og Moloney leukæmivirus (M-MLV) revers transkriptase blev indkøbt fra Invitrogen (Carlsbad, CA).

Cellekultur og behandling

Humane æggestokkene kræft cellelinjer A2780 og A2780CP (resistente over for cisplatin) celler var en slags gave fra Dr. G. Peter Raaphorst (Ottawa Regional cancer center, Ottawa, Canada) og blev oprindeligt beskrevet i [24]. OVCAR-3 og SKOV-3 cellelinier blev indkøbt fra ATCC. A2780 og A2780CP celler blev dyrket i DMEM-F12-medium suppleret med 2% BGS. OVCAR-3 celler blev dyrket i RPMI-1640 medium og SKOV-3-celler blev dyrket i McCoys medium både suppleret med 10% FBS. Gentamycin (50 ug /ml) blev sat til alle dyrkningsmedier.

For at undersøge virkningen af ​​resveratrol på cisplatin-induceret EMT, A2780 og A2780CP celler blev co-behandlet med Resveratrol og 10 pM Cisplatin i 24 timer. For at undersøge virkningen af ​​Erk-vejen på cisplatin-induceret EMT blev æggestokkene cancercellelinjer forbehandlet med 20 pM U0126 i 1 time, derefter Cisplatin blev tilsat til dyrkningsmediet i 24 timer ved en endelig koncentration på 10 uM. DMSO blev anvendt som kontrol for U0126 og Resveratrol.

Påvisning af celledød ved flowcytometri

A2780 og A2780CP celler blev behandlet med resveratrol og cisplatin i 24 timer. Ved høst blev cellerne centrifugeret ved 500 rpm i 5 minutter, vasket med PBS og derefter centrifugeret 300 rpm i 5 minutter. Celledød blev evalueret med Annexin-V-FITC og propidiumiodid (PI) dobbelt farvning under anvendelse døde celle apoptose kit ifølge producentens protokol. Fluorescens blev læst ved anvendelse af en Cytomics FC 500 MPL flowcytometer (Beckman Coulter). Positive celler for Annexin-V og /eller PI blev betragtet som døde celler.

MTT assay

Proliferation af A2780 og A2780CP celler blev vurderet ved MTT-assayet. Celler blev udpladet i duplikat i 96-brønds plader og efterladt til at klæbe natten over. Den følgende dag blev celler i vækstfasen behandlet med 0-60 uM Resveratrol med eller uden 10 pM Cisplatin i 24 timer i 100 pi kulturmedium. 4 timer før afslutning af behandlingen blev 10 pi MTT-opløsning sat til hver brønd, og pladerne blev anbragt i inkubatoren. 4 timer senere blev 100 pi solubilisering opløsning (10% SDS i 0,01 M HCI) tilsat til hver brønd, og plader blev efterladt i inkubatoren natten over. Den følgende dag blev absorbansen aflæst ved A

595 nm med en Fluostar Optima-pladelæser.

Western Blot

Celler blev høstet efter 24 timers Resveratrol-Cisplatin eller U0126-Cisplatin behandling og vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS). Celler blev derefter lyseret i RIPA-lysepuffer indeholdende komplet proteaseinhibitorcocktail (Roche Applied Science) og underkastet tre fryse /optøningscykler ved -20 ° C. Celler blev derefter centrifugeret, og supernatanten blev opsamlet. Proteinkoncentration blev estimeret ved anvendelse af BioRad DC protein assay. Lige så stor mængde af proteiner (20-40 ug) blev derefter separeret på SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner (BioRad, Hercules, CA). Membraner blev blokeret i 5% fedtfri skummetmælk i PBS-Tween 20 0,05% (PBS-T) i 1 time før inkubation med primært antistof (fortyndet 1:1000 i PBS-T /mælk) natten over ved 4 ° C (alle antistoffer er fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA, undtagen GAPDH fra Abcam (Cambridge, MA)). Primært antistof målretning Snail blev inkuberet 2 timer ved stuetemperatur og HRP-konjugeret-GAPDH blev inkuberet 45 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation blev membranerne vasket fire gange i PBS-T før inkubering med peberrodsperoxidase konjugeret sekundært antistof (BioRad, Hercules, CA) fortyndet 1:3000 i PBS-T /mælk. Membraner blev vasket fire gange i PBS-T, og antistofferne blev afsløret under anvendelse SuperSignal West Femto substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL), som beskrevet af producenten under anvendelse UVP Bio Imaging System. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol.

Cell morfologi

Celler blev dyrket i plader med 6 brønde og derefter behandlet med 2,5 pM cisplatin og /eller 60 pM Resveratrol i 72 timer i A2780 og A2780CP celler at give tilstrækkelig tid til EMT morfologiske ændringer at forekomme. Efter behandling blev cellerne vasket med frisk medium for at fjerne døde celler. Endelig blev cellerne observeret under et Carl Zeiss Axio observerZ1 mikroskop for at bestemme deres morfologi og billede blev taget i fase kontrast mikroskopi hjælp 20X forstørrelse. Celler der præsenterer mesenkymale egenskaber, med en mere fibroblastlignende morfologi og cellulære protusions, blev anset for at have gennemgået EMT.

sårheling assay

At evaluere celle motilitet celler blev udsået i 24 brønde plader og dyrket til sammenflydning. En steril tip blev brugt til at skabe en ridse i cellelaget. Cellerne blev derefter behandlet med 2,5 uM Cisplatin og 60 uM Resveratrol og billeder blev taget på passende tidspunkter for at evaluere sårlukning. Sår blev vurderet ved anvendelse ImageJ software til at måle sårområdet på forskellige tidspunkter. Procentdelen af ​​sårlukning blev beregnet som sårområde på et givet tidspunkt i forhold til den oprindelige sårfladen. Viste billeder er repræsentative for tre uafhængige forsøg udført in duplo.

revers transkriptase PCR (RT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra behandlede celler under anvendelse af Trizol Reagent i overensstemmelse med producentens anvisninger. 500 ng RNA revers transkriberet under anvendelse af M-MLV revers transkriptase og oligo (dT) primere. Det omvendte-transkriberede RNA blev derefter amplificeret ved PCR under anvendelse af specifikke primere. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Humant sneglen blev amplificeret under anvendelse af sense-primeren 5′-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3 ‘og antisense-primer 5′-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3′ (fragment længde 140 bp). Human TCF8-ZEB1 blev amplificeret under anvendelse af sense-primeren 5’-TTACACCTTTGCATACAGAACCC-3 ‘og antisense-primer 5′-TTTACGATTACACCCAGACTGC-3′ (fragment længde 100 bp). Humant vimentin blev amplificeret under anvendelse af sense 5’-CGAAAACACCCTGCAATCTT-3 ‘og antisense-primer 5′- CTGGATTTCCTCTTCGTGGA-3′ (fragment længde 133 bp). GAPDH blev amplificeret under anvendelse af sense 5’-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3 ‘og antisense-primer 5′-GACTTGACAAAGTGGTCG-3’ (fragment længde 139 bp). GAPDH blev anvendt som kontrol.

Ældning-associeret β-galactosidase-farvning

Celler blev udpladet i 6-brønds plader og efterladt til at klæbe natten over. Den følgende dag blev celler behandlet med 60 pM Resveratrol og 2,5 uM Cisplatin i 72 timer. Efter behandlingen blev cellerne vasket for at fjerne ikke-adhærerende celler og farvet med Ældning β-galactosidase-farvning kit ifølge producentens instruktioner. Cellerne blev derefter talt under et lysmikroskop at vurdere procentdelen af ​​senescentceller der optrådte som blå celler.

densitometri og Statistisk analyse

Densitometrisk analyse blev udført på Western Blot resultater og PCR billeder med mængde One-software (BioRad) for at bestemme forekomst af proteiner eller amplificeret mRNA studeret. I begge tilfælde blev GAPDH anvendt som kontrol. Ved sårheling analyser, blev viklet område mesured hjælp ImageJ software. Sårlukning blev evalueret ved at sammenligne sårområdet på et givet tidspunkt til den oprindelige sårområde. Sammenligning mellem behandlingerne blev udført ved anvendelse af GraphPad PRISM softwareversion 5,00 (San Diego, CA) under anvendelse af envejs ANOVA-analyse og

post hoc

Tukeys test. Statistisk signifikans blev accepteret når p 0,05. Alle eksperimenter udført i denne undersøgelse blev gentaget tre uafhængige gange.

Resultater

Resveratrol inducerer celledød i æggestokkene cancerceller

Behandling af A2780 og A2780CP ovariecancerceller med Resveratrol øget celledød i en dosisafhængig måde som vist ved andelen af ​​PI-positive celler. Den lave andel af Annexin-V-farvning i Resveratrol-behandlede prøver, men ikke i Cisplatin-behandlede prøver viser, at resveratrol kan inducere celledød via en anden mekanisme eller forekomme hurtigere end cisplatin-induceret celledød (figur 1).

celledød niveauer blev bedømt ved flowcytometri med Annexin-V og PI farvning i A2780 og A2780CP celler. Repræsentative flowcytometri resultater er vist for A2780 (A) og A2780CP celler (B) behandlet med 10 pM Cisplatin og 40 uM Resveratrol. I øverste højre hjørne, er procentdelen af ​​celledød vist, svarende til apoptotisk og nekrotisk celledød. Annexin-V og PI negative celler (B3) er ikke-apoptotiske. Annexin-V-positive og PI negative celler (B4) er i de tidlige stadier af apoptose. Annexin-V-positive og PI-positive celler (B2) er i sen apoptose. Annexin-V negative og PI-positive celler (B1) er nekrotiske celler. Celledød procentdel er vist i (C) i begge cellelinier behandlet med stigende doser af resveratrol op til 60 uM med eller uden cisplatin 10 uM. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. I grafer, søjler identificeret med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p 0,05). I grafer, mock: ubehandlede celler, R20: Resveratrol 20 uM, R40: Resveratrol 40 uM, R60: Resveratrol 60 uM, CP: Cisplatin, R20CP: Resv. 20 uM + cisplatin, R40CP: RESV. 40 pM + cisplatin, R60CP: RESV. 60 uM + Cisplatin.

Vi undersøgte apoptose og autophagy som potentielle celledød mekanismer. I A2780 celler, Cisplatin inducerede en stigning i caspase-3 og PARP-spaltning, hvilket indikerer induktion af celledød via apoptose. Derimod har behandling af A2780 eller A2780CP celler med resveratrol ikke påvirker niveauerne af spaltet caspase-3 på trods af tilstedeværelsen af ​​døde celler, styrkelse muligheden for, at en anden end apoptose mekanisme er involveret (figur 2). Derefter besluttede vi at studere autophagy induktion ved at vurdere ekspressionsniveauerne af LC3B-II og Beclin-1, to proteiner er kendt for deres involvering i autofagi progression. Resveratrol forårsagede en stigning i LC3B-II-niveauer i begge cellelinier, støtte resultater fra Opipari

et al

. viser autophagy som en potentiel mekanisme bag Resveratrol-induceret celledød [25]. I vores model, vi ikke observere en stigning i Beclin-1-niveauer, som allerede udtrykt ved relativt høje niveauer i A2780 og A2780CP cellelinjer.

Mekanismen for celledød blev undersøgt i A2780 og A2780CP celler respons på cisplatin og Resveratrol. Fraværet af stigning i spaltede PARP niveauer og caspase-3-spaltning, når der anvendes højere doser af resveratrol antyder Resveratrol ville inducere celledød via en mekanisme uafhængig af apoptose. Den væsentlige stigning i LC3BII antyder Resveratrol kunne inducere celledød via autofagi. Densitometrianalyse vises under Western Blot for hver cellelinie. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. I grafer, søjler identificeret med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p 0,05). I grafer, mock: ubehandlede celler, R40: Resveratrol 40 pM, CP: cisplatin, R20CP: RESV. 20 uM + cisplatin, R40CP: RESV. 40 pM + cisplatin, R60CP: RESV. 60 pM + Cisplatin.

Resveratrol potentierer Cisplatin-induceret fald i celleproliferation

Dernæst søgte at evaluere effekten af ​​Resveratrol på proliferationen af ​​A2780 og A2780CP cellelinier. Som vist i figur 3, lave doser af resveratrol (20-40 uM) lidt øger proliferation af begge cellelinier trods celledøden forbundet til denne behandling. Ved den højeste testede dosis (60 uM) Resveratrol inducerede et mindre fald i proliferation i A2780 celler og næsten ingen ændring i A2780CP celler. I Cisplatin-sensitive A2780 celler, Resveratrol potenserer faldet i celleproliferation observeret, når Cisplatin anvendes som behandling antyder en synergistisk virkning mellem disse to forbindelser. Dette blev ikke observeret i Cisplatin-resistent A2780CP celler, men den højeste Resveratrol dosis øgede ikke proliferation ved anvendelse i kombination med cisplatin.

MTT-assay blev udført for at vurdere A2780 og A2780-cellelinier proliferation som respons på 10 uM Cisplatin og stigende doser op til 60 uM Resveratrol. A2780 celler proliferation blev forøget med Resveratrol 20 uM og faldt ved 60 uM, mens alle doser viser en stigende proliferation i A2780CP celler. Resveratrol potenserer også Cisplatin fald i proliferation i A2780 celler. Graph barer med forskellige bogstaver er statistisk forskellige (p 0,05). I grafer, mock: ubehandlede celler, R20: Resveratrol 20 uM, R40: Resveratrol 40 uM, R60: Resveratrol 60 uM, CP: Cisplatin, R20CP: Resv. 20 uM + cisplatin, R40CP: RESV. 40 pM + cisplatin, R60CP: RESV. 60 uM + Cisplatin.

Resveratrol hæmmer Cisplatin-medieret EMT induktion i ovariecancer cellelinjer

For at vurdere virkningen af ​​resveratrol på Cisplatin-induceret EMT, A2780 og A2780CP celler var co -behandlede med Resveratrol og Cisplatin. Som forventet, behandling af cellerne med cisplatin øget protein niveauer af Snail, vimentin og ZEB1, tre af de vigtigste markører for EMT. Behandling af cellerne med cisplatin og Resveratrol faldt ekspressionsniveauerne af Snail, men viste ikke denne effekt på Vimentin og ZEB1 udtryk. Derimod blev disse to proteiner let forøget, når celler blev udsat for Resveratrol alene (figur 4A). Faldet i Snail niveauer i A2780 behandlet med Resveratrol og Cisplatin korrelerer med et fald i Snail mRNA levels.However, var dette ikke tilfældet i A2780CP celler, hvor ingen signifikant ændring blev observeret i Snail mRNA niveauer mellem prøver behandlet med cisplatin og dem behandlet med både Cisplatin og Resveratrol, hvilket tyder på de post-translationelle mekanismer kan også være involveret i Snail nedregulering i disse celler (figur 4B). ZEB1 og vimentin mRNA niveauer forblev hovedsagelig uændret i celler behandlet med enten Resveratrol, Cisplatin eller begge midler. I vores celle model, kunne vi ikke vurdere EMT progression baseret på nedregulering af E-cadherin fordi A2780 og A2780CP celler ikke udtrykker dette protein.

Western Blot-analyse af EMT markører Snail, vimentin og ZEB1 i A2780 og A2780CP (A) celler som respons på 10 um Cisplatin med eller uden stigende doser af resveratrol. Densitometrisk analyse er vist under hver cellelinie Western blotting. Resveratrol hæmmer Cisplatin-induceret Snail ekspression i en dosisafhængig måde, men lidt øger ZEB1 og vimentin niveauer. Den Resveratrol dosisafhængig fald i P-ERK2 niveauer antyder inddragelsen af ​​Erk-vejen i Resveratrol-induceret sneglen nedregulering. EMT markører Sneglen, vimentin og ZEB1 ekspression blev analyseret ved RT-PCR i A2780 og A2780CP (B) celler behandlet med 10 um cisplatin med eller uden stigende doser af resveratrol. Resveratrol eller Cisplatin behandling havde nogen effekt på ZEB1 og vimentin mRNA-niveauer. Vimentin og ZEB1 densitometri vises under hver cellelinie. Snail mRNA ekspression blev kun faldt i A2780 celler, hvilket tyder på en anden mekanisme kan inddrages i A2780CP celler. Billeder viste er repræsentative for tre uafhængige forsøg. I grafer, søjler identificeret med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p 0,05). I grafer, mock: ubehandlede celler, R40: Resveratrol 40 pM, CP: cisplatin, R20CP: RESV. 20 uM + cisplatin, R40CP: RESV. 40 pM + cisplatin, R60CP: RESV. 60 pM + cisplatin.

Aktivering af MAPK Erk er forbundet med cisplatin-induceret EMT

Derefter undersøgte vi den mekanisme, hvormed Resveratrol tællere Cisplatin-induceret Snail ekspression. MAPK /Erk-vejen er en af ​​de mulige mekanismer, der kan være involveret i EMT-induktion i celler. I A2780 og A2780CP celler blev Erk2 fosforylering steg som reaktion på Cisplatin. Aktiveringen af ​​denne vej blev signifikant inhiberet af Resveratrol, svarende til et fald i Snail niveauer i A2780 og A2780CP cellelinier (figur 4). For yderligere at bekræfte involveringen af ​​Erk i stigningen af ​​snail niveauer som respons på cisplatin, vi anvendte U0126, en MEK1 /2 specifik inhibitor (figur 5). Forbehandling af celler med dette inhibitor reducerede signifikant aktivering niveauer af Erk2 i A2780 og A2780CP celler, som også korrelerede med et signifikant fald i Snail protein i begge cellelinier. Små stigninger i proteinniveauer af vimentin og ZEB1 blev også observeret (figur 5A). Snegl mRNA niveauer blev reduceret ved begge celler linjer blev behandlet med cisplatin og U0126, hvilket tyder cisplatin-induceret snegl ekspression gennem Erk pathway kræver transskription af sneglen genet. ZEB1 og vimentin mRNA niveauer viste ikke signifikante ændringer, når A2780 og A2780CP celler blev behandlet med cisplatin og U0126 alene eller i kombination (figur 5B). Disse resultater understøtter Resveratrol-induceret EMT inhibering gennem Erk-vejen. Salg

A2780 og A2780CP cellelinier blev forbehandlet med U0126 at inhibere Erk aktivitet og behandlet med cisplatin i 24 timer. Western Blot er vist i (A). Tilsvarende densitometri vises under hver cellelinie. Erk hæmning reduceret Cisplatin-induceret Snail udtryk, men let øget ZEB1 og vimentin udtryk i begge cellelinier. Tilsvarende PCR-resultater er vist i (B). Snail mRNA fald i U0126 + Cisplatin behandlede prøver antyder Snail regulering af Cisplatin involverer gen transskription. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. I grafer, søjler identificeret med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p 0,05). I grafer, mock: ubehandlede celler, CP: cisplatin, U + CP:. U0126 + Cisplatin

Resveratrol blokerer Cisplatin-inducerede morfologiske ændringer

For at undgå overdreven Cisplatin-induceret cytotoksicitet i A2780 celler, besluttede vi at bruge 2,5 uM Cisplatin at vurdere morfologiske ændringer i A2780 og A2780CP celler til en 72 h behandling. Behandling af ovariecancerceller med cisplatin inducerede morfologiske ændringer, der minder om EMT som cellerne mistet deres epitel brosten-lignende morfologi at erhverve en mere langstrakt fibroblast-lignende form. Cellular protusions optrådte også i Cisplatin-behandlede celler sammenlignet med kontrolprøver. Både A2780 og A2780CP celler viste disse ændringer angiver deres progression gennem EMT. For at teste virkningen af ​​resveratrol på dette fænomen, vi anvendte 60 uM, den koncentration, hvor sneglen nedregulering var den mest indlysende. Tilsætning af Resveratrol til cisplatin behandling blokeret disse morfologiske ændringer som cellerne ikke erhverve nogen af ​​de karakteristiske mesenkymale morfologiske træk (Figur 6). Det er også interessant at bemærke, at resveratrol-behandlede celler blev større og vises en uregelmæssig udseende tyder en anden cellulær transformation, såsom en ældning program, være opstået [26].

A2780 (A) og A2780CP (B ) cellelinier blev behandlet i 72 timer med 2,5 uM cisplatin med eller uden 60 pm Resveratrol at tillade EMT morfologiske ændringer bliver synlige. Cisplatin inducerede cellulære morfologiske ændringer, der minder om EMT i A2780 celler tydelige efter 72 timer, som blev ophaeves, naar Resveratrol blev tilsat til behandlingen. Resveratrol udøvede den samme virkning på A2780CP celler, selvom de morfologiske forandringer som følge af Cisplatin var mindre udtalt. Celler blev observeret under 20X forstørrelse, skala bar i øverste venstre hjørne af billederne repræsenterer 20 um. Pile angiver eksempler på celler, der har gennemgået en EMT. Billeder viste er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Resveratrol inducerer ældning

Vi evaluerede ældning induktion i vores cellelinjer efter cisplatin og Resveratrol behandling og observeret en signifikant stigning i Resveratrol-induceret aldring i begge cellelinier efter 72 timer, med en mere udtalt effekt i A2780-celler (figur 7). Vi observerede også højere ældning niveauer i A2780 celler behandlet med cisplatin og foreslå, at vedvarende udsættelse for cisplatin kunne fremkalde en oxidativ stress fører til ældning i disse Cisplatin-sensitive celler. Senescens induktion i A2780 og A2780CP celler kunne være en anden mekanisme er involveret i inhibering af cisplatin-induceret EMT ved Resveratrol.

Behandling af A2780 og A2780CP celler med Resveratrol steg markant andelen af ​​senescentceller. Cisplatin inducerede en signifikant forøgelse af senescens i A2780-celler. Celler blev farvet for β-galactosidaseaktivitet og talt under et lysmikroskop for at vurdere procentdelen af ​​ældede (blå) celler. I grafer, søjler identificeret med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p 0,05). Analysen blev udført med tre uafhængige forsøg.

Resveratrol hæmmer cellemigration

I betragtning af den morfologiske transformation forekommer i A2780 og A2780CP celler, vi næste evalueret migration evne af disse celler med et sårheling assay. Celler blev behandlet med 2,5 uM Cisplatin, for at undgå overdreven cytotoksicitet i A2780 celler, og 60 uM Resveratrol. I begge cellelinier, blev 72 timer kræves for såret til helt tæt op i ubehandlede celler, hvilket antyder, at disse cellelinjer ikke har en meget mobil fænotype. Resveratrol behandling klart hæmmede celle migration på hver gang punkt, hvor sårlukning blev evalueret, hvilket reducerer såret lukning kun 20-25% efter 72 timer for begge cellelinier mens kontrolcellerne havde næsten helt lukket sår (figur 8A og 8B). Resveratrol handling ville ikke blive berørt af cisplatin i A2780CP celler, hvor dette middel udøvede den samme virkning på cellerne med eller uden Cisplatin.

vandrende evne A2780 (A), A2780CP (B), OVCAR-3 ( C), og SKOV-3 (D) celler blev bedømt ved sårheling assay. En ridse blev foretaget med en steril spids i et konfluent lag af celler og sårlukning blev observeret efter 24, 48 og 72 timer af cisplatin og Resveratrol behandling for A2780, A2780CP, og OVCAR-3-celler, og 12 og 24 timer for SKOV -3, svarende til det øjeblik, hvor såret blev næsten fuldstændig lukket. I begge cellelinier, Resveratrol faldt migrationen af ​​cellerne i såret, forhindrer dets lukning efter 72 timer. Repræsentative billeder er vist ved t = 48 timer. Grafisk repræsentation af sårlukning efter de forskellige tidspunkter undersøgte er vist i (E). De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg udført in duplo. I grafer, er behandlinger sammenlignes indenfor hvert tidspunkt undersøgt og kolonner identificeret med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p 0,05).

Desuden undersøgte vi potentialet i Resveratrol til at inhibere migrationen evne OVCAR -3 celler, en epithelial cellelinie, der udtrykker E-cadherin og uden basal ekspression af ZEB1 eller vimentin, som viser lille potentiale migration, og SKOV-3-celler, en mesenchymal cellelinje viser basal ekspression af vimentin og ZEB1 samt en mesenchymal morfologi og højt potentiale migration trods basal E-cadherin ekspression (fig S1). Svarende til A2780 og A2780CP celler, OVCAR-3 celler kræves mindst 72 timer for at lukke såret. I denne cellelinie, Resveratrol reducerede signifikant lukning af såret efter 72 timer og ved hver tidspunkt undersøgt ved anvendelse i kombination med cisplatin. I SKOV-3-celler, blev kun 24 timer skal overholde 80-85% sårlukning og Resveratrol faldt betydeligt migration af disse celler, når de anvendes alene eller i kombination med cisplatin på dette tidspunkt, hvilket indikerer, at denne phytoalexin besidder evnen til at reducere migration af celler, der besidder en høj basal potentiel migration samt celler med lav potentiel migration (figur 8C og 8D). Resultater observeret i OVCAR-3 og SKOV-3 celler korrelerer med dem, der observeres i A2780 og A2780CP henholdsvis hvor følsomhed over for cisplatin er også lignende.

For at behandle mulighederne for en stigning i invasionen potentiale af cellerne,