PLoS ONE: Berberin radiosensibiliserer Menneskelig kræft i spiserøret Celler ved nedregulering homolog rekombination Repair Protein RAD51

Abstrakt

Baggrund

Esophageal planocellulært karcinom (ESCC) har dårlig prognose. Mens kombineret modalitet af kemoterapi og strålebehandling stiger overlevelse, de fleste patienter dør inden for fem år. Udvikling af midler, der bibringer cancer cellespecifik kemo- og radiosensitivitet kan forbedre terapien af ​​ESCC. Vi her rapporterede opdagelsen af ​​Berberin som en potent strålingssensibiliserende agent på ESCC celler

vigtigste resultater

Berberin ved lave koncentrationer. ( 15 uM) væsentligt radiosensitized ESCC celler. X-ray induceret DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs) fortsætter længere i ESCC celler forbehandlet med Berberin. Berberin forbehandling førte til en betydelig nedregulering af RAD51, en central aktør i homolog rekombination reparation, i ESCC celler, men ikke i ikke-maligne humane celler. Nedregulering af

RAD51

af RNA-interferens tilsvarende radiosensitized kræftcellerne, og omvendt, indførelse af eksogen RAD51 var i stand til væsentligt at modvirke den strålingssensibiliserende effekt af Berberin og dermed skaber RAD51 som en afgørende faktor i stråling følsomhed. Vi observerede også, at RAD51 var almindeligt overudtrykt i humane ESCC væv, hvilket antyder, at det er nødvendigt at nedregulere RAD51 at opnå høj radio- eller kemoterapeutisk effekt af ESCC i klinikken, fordi overekspression af RAD51 vides at give radio- og kemoresistens.

konklusioner /betydning

Berberin effektivt kan nedregulere RAD51 i giver radiosensitivitet på esophageal kræftceller. Dens kliniske anvendelse som hjælpestof i kemoterapi og strålebehandling af esophageal kræft bør udforskes

Henvisning:. Liu Q, Jiang H, Liu Z, Wang Y, Zhao M, Hao C, et al. (2011) Berberin radiosensibiliserer Menneskelig kræft i spiserøret Celler ved nedregulering homolog rekombination Repair Protein RAD51. PLoS ONE 6 (8): e23427. doi: 10,1371 /journal.pone.0023427

Redaktør: Qian Tao, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: December 21, 2010; Accepteret: 17 Juli 2011; Udgivet: 8 August, 2011

Copyright: © 2011 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret af National Natural Science Foundation of China; Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Esophageal planocellulært karcinom (ESCC), der har en særlig høj forekomst i østasiatiske lande, har normalt dårlig prognose. Kun 4% 5-årige overlevelsesrate blev indspillet med kirurgisk behandling [1]. Strålebehandling havde en lignende resultat [2]. Overlevelsesraten for patienter med ESCC kan forbedres betydeligt med kombineret kemoterapi og strålebehandling [3], [4]. Men øge dosis stråling ikke afkaster mere tilfredsstillende resultater [5]. Der er fortsat det er nødvendigt at udvikle midler, bibringer kemo- og radiosensitivitet selektivt på kræftceller samtidig have minimal stråling toksicitet over for normale celler. Skønt forskellige strålingssensibiliserende er blevet testet, herunder midler, der er målrettet DNA- eller ikke-DNA-mål, forbliver det ideelle strålingssensibiliserende at blive opdaget [6].

Berberin, den vigtigste alkaloid komponent i Huang Lian og andre lægeurter , er det mest almindeligt anvendte lægemiddel mod gastrointestinale gener i Kina. Udover sin fælles anvendelse som en daglig lægemiddel, har en række laboratorieundersøgelser vist, at berberine har antitumoraktivitet til en bred vifte af cancerceller, herunder glioblastom [7], oral cancer [8], hepatom [9], gastrisk cancer [10 ], prostatacancer [11], leukæmi [12] og osteosarkom [13]. I de fleste tilfælde blev berberine sig at inhibere cellecyklusprogression og fremkalde apoptose. En nylig undersøgelse viste, at Berberin var i stand til at undertrykke konstitutiv aktivering af NF-KB i nogle kræftceller [14], hvor det blev fundet til direkte at hæmme IKB kinase (IKK) aktivering, hvilket fører til undertrykkelse af phosphorylering og nuklear translokation af p65 . Berberine blev også rapporteret at have et strålingssensibiliserende virkning på lungecancerceller ved at inducere autofagi [15]. Derudover kan berberine forringe tumorvækst ved at inhibere angiogenese [16].

Vi har tidligere vist, at berberine kan hæmme cancercelleproliferation ved at inducere DNA dobbeltstrengede afbrydelser (DSB’er). Berberine, der udsender en gullig fluorescens, viste sig at være mere intensivt akkumuleret i kernerne i osteosarcomceller end i dem af normale osteoblaster, og dette differentiel akkumulering af Berberin korrelerer til sin vækst-inhibitoriske virkning, at induktionen af ​​DNA-skader, og efterfølgende aktivering af p53 og cellecyklusstop [13]. Derfor signaltransduktionsbanen ligger til grund for antitumorvirkningen af ​​Berberin er sandsynligvis de samme som initieres af andre DNA-beskadigende midler, såsom cisplatin. En nylig rapport viste, at Berberin kan opregulere p53 ved at forstyrre de MDM2-DAXX-HAUSP interaktioner og fremme MDM2 selv-ubiquitinering og nedbrydning [17].

Vi her rapporterer, at Berberin ved lave koncentrationer væsentligt kan radiosensitize ESCC celler. Vi viste, at den strålingssensibiliserende virkning af Berberin medieres af nedregulering af

RAD51

, som koder for et kritisk protein i homolog rekombination reparation. Desuden har vi observeret, at

RAD51

var almindeligt overudtrykt i humane ESCC væv, hvilket indikerer, at det er nødvendigt at nedregulere RAD51 at opnå en høj radio- eller kemoterapeutiske effekt af ESCC in klinik, fordi overekspression af

RAD51

er kendt for at give radio- og kemoresistens.

Resultater

Berberin sensibiliserer esophageal kræftceller for ioniserende stråling

Som tidligere rapporteret for andre typer af kræftceller, berberine behandling alene havde en væksthæmmende virkning på esophageal cancerceller på en dosis- og tidsafhængig måde (fig. 1A). Sammenlignet med normale, humane fibroblaster (HNF), ESCC celler er mere følsomme over for berberine. På 72 timer, IC50 for ESCC celler KYSE450 (12,58 uM), var omkring en fjerdedel af, at der for HNF (51,28 uM) (fig. 1B). Ved lave koncentrationer ( 15 uM), berberine havde en forholdsvis lav toksicitet over for ESCC celler og induceret intet påviseligt apoptose (fig 1C.). Imidlertid ESCC celler, som blev forbehandlet med lave koncentrationer af Berberin udviste en signifikant forøget følsomhed over for ioniserende stråling, som reflekteres af den bemærkelsesværdige fald i deres evne til at danne kolonier (fig. 2). Berberine forbehandling (15 uM, 24 timer) reducerede SF2 (overlevende fraktion ved 2 Gy) i KYSE30 celler til 48,1 ± 0,6%, fra 77,2 ± 1,2% i celler, der ikke var forbehandlet med berberine. En anden ESCC linje KYSE450 viste en lignende reaktion, med SF2 reduceret til 50,2 ± 2,1%, når celler blev forbehandlet med berberine ved 15 uM i 48 timer, sammenlignet med 81,2 ± 2,6% for celler ikke forbehandlet med berberine. I modsætning hertil Berberin havde nogen strålingssensibiliserende virkning på humane normale fibroblaster (fig. 2).

(A), Effekt af Berberin på levedygtighed KYSE30, KYSE450 og HNF celler. Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT-assayet. Celler blev behandlet med DMSO eller de angivne koncentrationer af Berberin i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Resultater blev repræsenteret som middelværdi ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. (B), cytotoksicitet berberinchlorid mod KYSE30, KYSE450 og HNF-celler repræsenteret ved inhibitoriske koncentrationer IC50. (C), måling af apoptose ved Western blot-analyse af caspase-3. KYSE30 og KYSE450 celler blev behandlet med berberine i 24 timer og 48 timer henholdsvis. Paclitaxel-behandlede HL-60 og HeLa-celler som positiv kontrol.

(A), radiosensibilisering af berberine af klonogenisk celleoverlevelse assay. KYSE30 og KYSE450 celler blev udsat for berberine (15 uM) eller vehikelkontrol (DMSO) i 24 og 48 timer henholdsvis før de blev bestrålet og udpladet. Humane normale fibroblastceller blev behandlet med berberine i 24 timer og 48 timer, før de blev udsat for røntgenstråler. Datapunkter er gennemsnit af to uafhængige forsøg hver udplades i tre eksemplarer; barer, SE. (B), SF2 værdier efter behandling med berberine. Fald i SF2 værdier angiver strålingssensibiliserende virkninger af Berberin.

Berberin forbehandling forlænger vedvarende stråling-induceret DSBs

Ioniserende stråling dræber celler ved at påføre forskellige skader på genomet . Vi spekuleret på, at strålingssensibiliserende virkning Berberin på cancerceller kan skyldes svækkelse i reparation af DNA dobbelt-strenget pauser (DSB’er). Vi bestemt derfor niveauerne af DSBs ved immunfluorescensfarvning af γ-H2AX foci i ESCCs på forskellige tidspunkter efter udsættelse for røntgenstråler. Som vist i fig. 3A, i KYSE30 celler ikke forbehandlet med berberine, blev størstedelen af ​​de y-H2AX foci blokerede ved 12 timer efter udsættelse for 0,5 Gy af røntgenstråler, og det gennemsnitlige antal γ-H2AX foci aftog til nær basisniveau på 24 timer. I modsætning hertil mere γ-H2AX foci varet ved disse to tidspunkter i KYSE30 celler, som var forbehandlet med berberine (15 uM). Det gennemsnitlige antal γ-H2AX foci per celle i celler, der modtager det kombinerede berberin /strålebehandling var signifikant større sammenlignet med den strålingshærdelige eneste gruppe på 12 og 24 timer tidspunkter (fig. 3B) (

P

= 0,002, og

P

0,001 henholdsvis). Berberin behandling alene blev ikke observeret at fremkalde indlysende DNA-skader i form af γ-H2AX foci induktion i ubehandlede kontroller (

P

= 0,081).

(A), Immunofluorescens farvning af γ-H2AX i KYSE30 celler. (B), Oversigt over γ-H2AX foci i KYSE30 celler på forskellige tidspunkter efter forskellige behandlinger. (C), Oversigt over γ-H2AX foci i KYSE450 celler på forskellige tidspunkter efter forskellige behandlinger. Kolonner, hjælp af tre uafhængige forsøg. Celler vokser på dækglas i 6-brønds plader blev udsat for Berberin (15 uM) i 24, bestrålet (0,5 Gy), og fastsættes på de angivne tidspunkter for immunfluorescensanalyse.

KYSE450 celler viste også en forsinket clearance af X-ray-induceret γ-H2AX foci, når de blev forbehandlet med berberine. Mens størstedelen af ​​y-H2AX foci blev ryddet i kontrolceller ved 24 timer efter udsættelse for røntgenstråler, mere end halvdelen af ​​γ-H2AX foci fastholdt celler, der var forbehandlet med Berberin (fig. 3C). Disse resultater indikerer, at Berberin forbehandling forringet reparation af x-ray-inducerede DSBs.

Berberin nedregulerer RAD51 i cancerceller, men ikke i ikke-maligne celler

DSBs primært repareret af to veje, dvs. non-homolog ende sammenføjning og homolog rekombination [18], [19], [20]. Ku70 og Ku86 er afgørende for det tidligere, hvor som RAD51 er en central aktør i den sidstnævnte. Vi næste afgøres, om niveauerne af disse tre proteiner blev ændret i esophageal kræftceller forbehandlet med Berberin. Vi observerede, mens der ikke var nogen åbenlyse ændringer i niveauerne af Ku70 og Ku86, blev niveauet af RAD51 protein bemærkelsesværdigt reduceret i ESCCs som blev behandlet med berberine i 24 timer eller 48 timer ved 7,5 uM eller 15 pM (fig. 4A). Niveauet af

RAD51

mRNA viste en signifikant reduktion i begge cancercellelinier efter behandling med Berberin (fig. 4B), hvilket antyder, at nedregulering af RAD51 skyldtes sandsynligvis reduceret transskription af

RAD51

mRNA.

(A), niveauerne af DNA reparation proteiner i esophageal cancer celler behandlet med Berberin. Celler blev behandlet med berberine i de angivne koncentrationer og for det angivne varighed før celler blev fremstillet til celleekstrakter. (B), Fald i

RAD51

mRNA-niveauer efter Berberin eksponering. Celler blev udsat for berberine (15 uM) i 24 timer for KYSE30 celler (48 h for KYSE450 celler), og opsamles til kvantitativ realtids-PCR-analyse af RAD51 /GAPDH mRNA-forhold. (C),

RAD51

promotoraktivitet blev undertrykt af Berberin i KYSE30 og KYSE450 celler. De pGL3-RAD51p luciferase (ildflue) reporterplasmider blev transient transficeret ind i humane øsofageale cancerceller. Fire timer senere blev cellerne behandlet med berberine i 24 timer og derefter analyseret for luciferaseaktivitet. Ildflueluciferase værdier blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet fra en cotransficeret pRL-SV40 kontrolvektor. Hver værdi repræsenterer middelværdien SE for tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev udført under anvendelse uparret Students

t-test. *

, P 0,05 i forhold til kontrolværdier. (D), Manglende RAD51 nedregulering i ikke-maligne celler. Celler blev udsat for Berberin (15 uM) for det angivne tidsrum, og opsamles til immunoblotanalyse. (E), nedregulering af RAD51 i andre typer kræftceller. Celler blev udsat for den udpegede berberin koncentration i 48 timer og opsamles til immunoblotanalyse. De i A, D og E immunoblots er repræsentative for mindst to uafhængige forsøg med GAPDH tjente som protein loading kontrol. C angiver kulturer udsat for vehikelkontrol DMSO.

Ekspressionen af ​​RAD51 vides at være cellecyklus-afhængige og er højere ved S og G2 /M-faser end på G0 /G1-fasen [21] , [22]. For at bestemme om den reducerede ekspression af RAD51 var følge af ændring i cellecyklusfordeling i Berberin-behandlede celler, underkastede vi Berberin-behandlede celler til flowcytometri analyse. Mens berberine behandling (15 uM i 24 timer) reducerede procentdelen af ​​KYSE30 celler ved S og G2 /M til 49% fra 60% i kontrollen (data ikke vist), såsom en ændring var ikke nok til at tage højde for de mange gange reduktion i niveauet af RAD51 ekspression. Vigtigere er, at Berberin behandling (15 uM i 24 timer) ikke signifikant ændrer fordelingen af ​​cellecyklusfordeling af KYSE450 celler (44% og 45% for den procentdel af celler ved S-G2 /M-faser i kontrol og behandlede gruppe, henholdsvis ), hvilket indikerer, at reduktionen af ​​RAD51-ekspression i respons på berberine er ikke på grund af reduceret populationsstørrelse celler ved S og G2 /M-faser. Således nedregulering af RAD51 som svar på berberine er formentlig uafhængig af ekspressionen ændringer, der er forbundet med cellecyklusprogression.

Overekspression af

RAD51

er ofte forbundet med en stigning i dens promotoraktivitet [23]. Vi næste klonet promotoren og 5′-enden region

RAD51

(fra -1693 til +487 bp) i en luciferasereporterplasmid, pGL3-basisk vektor, transficeres dem i esophageal cancerceller, og testet

RAD51

promoter aktivitet som respons på berberine behandling. Som vist i fig. 4C, promotoraktiviteten af ​​

RAD51

blev signifikant reduceret i celler, der blev behandlet med berberine sammenlignet med kontrollen. Sammen viste disse resultater, at Berberin var i stand til at nedregulere ekspressionen af ​​

RAD5

1 i esophageal kræftceller på transskription niveau.

Fordi RAD51 er en central aktør i homolog rekombination reparation, dens nedregulering kunne bidrage til radiosensitivitet af ESCC celler forbehandlet med berberine. Da berberine havde ingen strålingssensibiliserende effekt på HNF, vi spekuleret på, at RAD51 niveau ikke kan blive påvirket af Berberin behandling i HNF. Vi undersøgte først de basale niveauer af RAD51 i flere maligne cellelinjer, herunder HNF. Som vist i fig. 4D, niveauerne af RAD51 var meget lavere i HNF, hMSC (humane mesenchymale stamceller fra navlestrengen) og XWXL (fibroblaster afledt fra en godartet fibroadenoma) end i ESCC celler. Interessant, human umbilical vaskulære endotelceller (HUVEC’er) og HEK-293 celler udtrykte også høje niveauer af RAD51. Men i modsætning til ESCC celler, ingen af ​​de fire typer af maligne celler viste en nedregulering i RAD51 ekspression ved berberine behandling (fig. 4D).

For at bestemme om den nedregulering af RAD51 ved Berberin gælder andre typer af cancerceller, vi også udsat humane brystcancerceller MCF7, humane osteosarcomceller U2OS, mus prostatacancerceller RM-1 og muse lungecancerceller LLC for lave koncentrationer af Berberin i 48 timer og målt proteinniveauet af RAD51. Som vist i fig. 4E, RAD51 blev nedreguleret i alle disse fire cancer testede cellelinjer, hvilket antyder, at nedregulering af RAD51 ved Berberin er ikke enestående for ESCC celler. Tilsammen indikerer disse resultater, at forskellige typer af celler kan reagere forskelligt på Berberin behandling i form af regulering af RAD51 udtryk.

opregulering af RAD51 ved IR kan dæmpes ved Berberin

Vi observerede, at ioniserende strålingsinduceret en opregulering af RAD51 i ESCC celler (fig. 5A). I overensstemmelse med stigningen i RAD51 på proteinniveau, niveauet af

RAD51

mRNA blev forøget i ESCC celler, som havde været udsat for IR (data ikke vist). Dette fund er i overensstemmelse med en tidligere rapport af RAD51 induktion ved IR i gliomceller [24]. Fordi IR kan opregulere ekspression af

RAD51

, vi næste testede, om Berberin forbehandling kunne modvirke denne effekt af IR. De ESCC celler blev først behandlet med berberine, derefter med IR og niveauet af RAD51 ekspression blev målt. I modsætning til den højde af RAD51 i celler, som blev behandlet med IR alene, berberinchlorid forbehandling dæmpet effektivt opreguleringen af ​​RAD51 induceret af IR (fig. 5B), hvilket viser, at berberine var i stand til at overvinde den opregulering af RAD51 induceret af IR. Ikke alene var der en reduktion i total protein niveau, blev dannelsen af ​​RAD51 foci som respons på IR spænder inhiberet af Berberin (fig. 5C). Nedreguleringen af ​​RAD51 ved Berberin blev igen reflekteret ved transkriptionsniveauet (Fig. 5D).

(A), Stråling øger RAD51 ekspression i tumorceller. Celler blev udsat for de angivne doser af stråling og opsamlet 24 timer senere for immunoblotanalyse. (B), forandring af RAD51 proteinniveauer som reaktion på Berberin og stråling. Celler blev forbehandlet med berberine (15 uM) i 24 timer før den blev bestrålet med 6 Gy af røntgenstråler. Celler blev indsamlet til immunoblotanalyse ved 24 timer efter bestråling. (C), Inhibering af strålingsinduceret RAD51 foci-dannelse ved berberine. Vist er immunfluorescerende billeder af KYSE30 og KYSE450 celler farvet med anti-RAD51-antistof efter 24 timers forbehandling med berberin og ved 24 timer efter bestråling med 6 Gy af røntgenstråler. DAPI kontrastfarvning viste kernerne. (D),

RAD51

mRNA-niveauer efter forbehandling med berberine (15 uM) i 24 timer (KYSE30) eller 48 timer (KYSE450) før bestråling med 6 Gy. Celler blev indsamlet til kvantitativ realtids-PCR-analyse af RAD51 /GAPDH mRNA-forhold på 24 timer efter udsættelse for 6 Gy af røntgenstråler. Immunblots og mRNA udtryk værdier er repræsentative for mindst to uafhængige forsøg.

RAD51 nedregulering af RNAi radiosensibiliserer kræftceller

Fordi Berberin kan påvirke mange cellulære veje, der er involveret i celledeling og overlevelse, kan det ikke udelukkes, at andre end nedregulering af RAD51 veje var ansvarlige for den strålingssensibiliserende effekt af berbeirne. For at demonstrere, at det er den nedregulering af RAD51, der er ansvarlig for denne effekt af Berberin, vi næste forarmet RAD51 i esophageal kræftceller ved RNAi og testet deres radiosensitivitet. Som vist i fig. 6A,

RAD51

udtryk kunne effektivt bragt til tavshed af siRNA specifikt rettet mod

RAD51

i begge cellelinier. Desuden blev den spontane dannelse af RAD51 foci stærkt reduceret (Fig. 6B). Som forventet, udtømningen af ​​RAD51 førte til en betydelig reduktion i klonogene celle overlevelse for både kræft i spiserøret cellelinier (fig. 6C). Den SF2 blev reduceret til 33,3 ± 0,4% i RAD51-RNAi KYSE30 celler fra 78,4 ± 1,2% i kontrol. KYSE450 celler viste en lignende reaktion på RAD51 udtynding. Således blev strålingssensibiliserende virkning af Berberin på esophageal celler primært medieret af nedregulering af RAD51.

(A), nedregulering af RAD51 af siRNA. RAD51 proteinniveauer blev målt ved Western blot. KYSE30 og KYSE450 celler blev transficeret med siRNA-duplexer (200 nM) specifikke for

RAD51

eller negativ oligo i serumfrit medium i 4 timer, derefter erstattet med komplet medium i 24 timer. Helcelleekstrakter blev indsamlet til western blot-analyse under anvendelse RAD51 antistoffer. (B). Reduceret dannelse af stråling-induceret RAD51 foci i esophageal celler kræft, hvor

RAD51

blev bragt til tavshed af RNAi. Celler blev udsat for 6 Gy af røntgenstråler ved 28 timer efter transfektion med siRNA-duplexer. (C), Virkning af RAD51 knockdown på radiosensitivitet af esophageal cancer-celler som bestemt ved klonogene overlevelse assay. (D), Western blot-analyse af RAD51 protein i cancerceller, som blev transfekteret med pcDNA3.1 eller pcDNA3.1B-mRAD51. De viste immunoblots er repræsentative for to uafhængige forsøg med GAPDH tjente som protein loading kontrol (KYSE30 /KYSE450 forælder cellelinjen, KYSE30 /KYSE450 (pcDNA3.1) celler stabilt transficeret med pcDNA3.1, KYSE30 /KYSE450 (mRAD51) celler stabilt transficeret med pcDNA3.1B-mRAD51). (E), Virkning af RAD51 overekspression på radiosensitivitet af esophageal cancer-celler som bestemt ved klonogene overlevelse assay. Resultaterne for de celler, transficeret med mRAD51 eller pcDNA3.1 vektor behandlet med Berberin blev sammenlignet (* P 0,01).

Introduktion af eksogene RAD51 modvirker strålingssensibiliserende effekt af Berberin

for yderligere at validere rolle RAD51 som en central aktør i at mediere den strålingssensibiliserende effekt af Berberin, vi lavede en konstruktion, der udtrykker muse RAD51 under CMV-promotoren, pcDNA3.1B-mRAD51, og havde ESCC celler stabilt transficeret. Ekspression af det eksogene RAD51 var tydelig i celler transficeret med mRAD51, som vist ved Western blot (fig. 6D). Vigtigt er det, så er der strålingssensibiliserende virkning af Berberin signifikant svækket i både KYSE30 og KYSE450 cellelinier, som blev transfekteret med mRAD51 (fig. 6E). Disse resultater, sammen med dem, der opnås med RAD51-RNAi, viste, at RAD51 er en kritisk faktor for radioresistance i ESCC celler.

RAD51 overekspression er almindelig i esophageal cancer væv

opregulering af

RAD51

ekspression er almindelig i tumorcellelinjer [25], og i en række humane maligniteter [26], [27], [28]. Vi næste evaluerede

RAD51

ekspressionsniveau i et panel af 86 humane primære øsofageale pladecellecarcinom væv ved immunhistokemisk farvning. Nuklear og /eller cytoplasmatisk farvning af RAD51 blev påvist i 81 af 86 prøver. Med eksemplarer, der udviser positiv farvning af RAD51 blev subcellulær fordeling og intensitet varieres. Intensitet blev scoret som en i 29, 2 i 43, og 3 i 9. Seks prøver viste fremherskende nukleare farvning, 30 prøver viste overvejende cytoplasmatisk farvning, og 45 prøver viste både cytoplasmatisk og nuklear farvning (fig. 7A-E). I modsætning hertil

RAD51

ekspression var lav eller fraværende i normale væv, der omgiver carcinom (Fig.7F). Vi fandt imidlertid ingen sammenhæng mellem RAD51 ekspressionsniveauer og de klinisk-patologiske parametre i ESCCs (tabel 1). Alligevel viste vores resultater, at RAD51 almindeligvis overudtrykkes i ESCC prøver. Fordi overekspression af RAD51 normalt giver resistens over for stoffer, som skader DNA [29], [30], [31], vores resultater kræver foranstaltninger, der nedregulerer RAD51 for at nå høje radio- eller kemoterapeutiske effekt af ESCCs i kliniske indstillinger. Interessant berberine behandling også nedreguleret RAD51 i tre yderligere øsofageale cancercellelinier (KYSE410, EC109, og TE-1), som i KYSE30 og KYSE450 celler (data ikke vist), hvilket antyder, at berberin kan gøre strålingssensibiliserende virkning som en bred vifte af esophageal kræftceller.

Billeder af vise andet udtryk niveau og cellulære fordeling er vist. (A), fravær af RAD51-specifik farvning (blå kerner som følge af Mayers Hemalum modfarvning). (B), lave niveauer af RAD51 i cytoplasmaet, men ikke i kerner, af den invasive carcinomceller. (C), mellemliggende niveauer af RAD51 i både cytoplasmaet og kerner af den invasive carcinomceller. (D), høje niveauer af RAD51 i cytoplasmaet, men ikke i kerner, af den invasive carcinomceller. (E), et højt nukleart RAD51 i kerner af invasive carcinomceller. Nr cytoplasma farvning er indlysende. (F), fravær af RAD51 farvning i normal esophageal væv. Immunhistokemi blev udført som i Materialer og Metoder. Alle originale billeder blev taget til fange ved × 400 forstørrelse.

Diskussion

Vi viste for første gang, at Berberin kan effektivt nedregulere RAD51 udtryk i kræftceller i at overdrage radiosensitivitet. Berberin behandling førte til en reduktion i

RAD51

transskription og en hæmning af

RAD51

promotor-aktivitet. Det kan også overvinde opregulering af RAD51, der induceres af ioniserende stråling (IR). Den strålingssensibiliserende effekt af Berberin blev svækket i kræftceller overekspression eksogen RAD51. Nedregulering af RAD51, hvilket er afgørende for homolog rekombination reparation, i høj grad forringet reparation af DSB’er induceret af IR og førte til ringe overlevelse af IR-behandlede celler. Vigtigt er, vi observeret, at RAD51 var almindeligt opreguleret i humane ESCC væv, som kan gøre modstand mod terapier, der rammer DNA. Derfor kan administration af Berberin som radio- og chemosensitizer tjene som en strategi til behandling af ESCC patienter.

opregulering af RAD51 i cancerceller blev vist at være forbundet med øget kemoresistens [29], [30] . Adskillige tidligere undersøgelser viste også, at nogle anti-cancer medicin gør kræftceller radiosensitive og chemosensitive ved nedregulering RAD51 og dermed forringe homolog rekombination reparation i kræftceller. For eksempel, imatinib (Gleevec), der inhiberer c-Abl tyrosinkinasen, kan effektivt reducere ekspressionen af ​​RAD51 i cancerceller og giver radiosensitivitet [24], [32]. Gefitinib, en selektiv epidermal vækstfaktorreceptor-tyrosinkinase inhibitor, viste sig at nedregulere RAD51 i lungecancerceller og sensibilisere dem til mitomycin C [33] og gemcitabin [34]. Phenyl hydroxamsyre PCI-24.781, en histondeacetylaseinhibitor der har en strålingssensibiliserende virkning på cancerceller, virker også ved at nedregulere RAD51 [35]. Ud over at have en række bivirkninger, disse lægemidler har tendens til at være meget dyrt.

Mange naturlige produkter har bemærkelsesværdige medicinske værdier. Udover at være mere overkommelige, plantelægemidler normalt har en lav toksicitet. Flere naturlige forbindelser har vist sig at bibringe radiosensitivitet og kemosensitivitet på cancerceller. En undersøgelse viste, at curcumin, en komponent i gurkemeje (

Curcuma longa

), kunne radiosensitize prostata kræftceller via hæmning af NFKB-funktion, hvilket førte til en nedregulering af anti-apoptotiske gen

Bcl-2

[36]. Behandling af cervixcancer celler med curcumin førte til forøget produktion af IR-induceret reaktive oxygenarter (ROS), som forårsager vedvarende ERK1 /2-MAPK-aktivering [37]. I modsætning hertil blev emodin, et stof, der findes i nogle planter, herunder rabarber, rapporteret at inhibere aktiveringen af ​​ERK1 /2 i lungecancerceller, hvilket igen fører til en nedregulering af RAD51 og bibringer kemosensitivitet [38], [39].

Huang Lian er en af ​​de mest almindeligt anvendte medicinske urter i Kina. Det er en af ​​de 12 mest anvendte lægeurter i USA [40]. Udover sin fælles anvendelse som et lægemiddel til gastrointestinal ubehag, er Berberin blevet testet i kliniske forsøg for type 2-diabetes mellitus [41], [42] og om hyperkolesterolæmi [43]. Vigtigt er det, patienter, der tager berberin erfaring relativt milde bivirkninger. Mens tidligere undersøgelser viste, at berberine besidder direkte antitumorvirkninger ved at inducere produktionen af ​​reaktive oxygenspecies i cancerceller, hvilket formentlig vil give strålingssensibilisering [44], [45], [46], [47], vores undersøgelse er den første at vise, at Berberin kan bibringe radiosensitivitet ved nedregulering en central aktør i reparation af DSBs. Det skal bemærkes, at styrken af ​​Berberin i nedregulere RAD51 i ESCC celler er sammenlignelig med den for Gleevec i gliomceller [24]. Ved højere koncentrationer forventes Berberin at spille en dobbelt rolle i at fremme død af de celler, hvor det er bevaret, ved samtidig at påføre DNA-skader og forringe en vej, der er ansvarlig for reparation af skader. Vigtigt er det, ved koncentrationer, der bibringer radiosensitivitet til esophageal cancerceller, berberine havde nogen strålingssensibiliserende virkning på normale humane fibroblaster. Tilsvarende blev berberine ikke observeret at nedregulere RAD51 i ikke-maligne celler. Disse resultater antyder, at strålingssensibiliserende virkning af Berberin kan være specifik for cancerceller.

Sammenfattende viste vi, at berberine ved lave koncentrationer væsentligt radiosensitized esophageal pladecellecarcinom celler. Det virker ved nedregulering RAD51, en central aktør i homolog rekombination reparation, hvilket fører til værdiforringelse i reparation af dobbelt-strenget pauser. Vores resultater afslørede således en hidtil ukendt biologisk aktivitet af en almindeligt anvendt og billige lægemiddel og indikerede, at berberine, med dens relativt lav toksicitet, kan anvendes som en adjuvans i cancer strålebehandling.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle procedurer, der involverer kliniske prøver blev godkendt af den etiske komité Shandong University School of Medicine.

cellelinier

Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i befugtet inkubator indeholdende 5% CO

2. Den menneskelige esophageal planocellulært karcinom (ESCC) linjer KYSE30, KYSE450, KYSE410, EC109 og TE-1 blev opnået fra Cancer Institute Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing) og dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. KYSE30, KYSE450 og KYSE410 var oprindeligt genereret af Dr. Yutaka Shimada, var normale menneske fibroblast (NHF) celler opnået fra Institut for Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing), og blev opretholdt i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin-streptomycin og 4 ug /ml bFGF. HUVEC’er blev fremskaffet fra ATCC. Mesenkymale stamceller fra humant navlestrengen var en gave fra Dr. Dong Li, Qilu Hospital, Shandong University. Fibroblaster (XWXL) blev etableret fra et kirurgisk fjernet fibroadenoma, med informeret samtykke fra patienten og godkendt af etiske komité i Shandong University School of Medicine.