PLoS ONE: Tab af ekspression af Reprimo, en p53-induceret cellecyklusstop Gene, korrelerer med invasiv tumorudviklingsstadie og P73 Expression i Gastric Cancer

abstrakt

Reprimo (RPRM), en nedstrøms effektor af p53-induceret cellecyklusstandsning ved G2 /M, er blevet foreslået som et formodet tumorsuppressorgen (GTS) og som en potentiel biomarkør for ikke- invasiv påvisning af mavekræft (GC). Formålet med denne undersøgelse var at evaluere epigenetisk inaktivering af RPRM genet ved promotor-methylering og dens tumorsuppressorfunktion i GC cellelinier. Endvidere blev kliniske betydning af RPRM proteinprodukt og dens association med p53 /p73 tumor suppressor protein familie udforsket. Epigenetisk inaktivering af RPRM genet ved promotor-methylering blev evalueret i fire GC cellelinier. Proteinekspression af RPRM blev evalueret i 20 tumor- og ikke-tumor matchede tilfælde. Den kliniske betydning af RPRM association med p53 /p73 tumor suppressor protein familie blev vurderet i 114 GC tilfælde. Tumorsuppressorfunktion blev undersøgt via funktionelle assays. RPRM genekspression blev negativt korreleret med promotor-methylering (Spearman rank r = 1; p = 0,042). RPRM overekspression hæmmede kolonidannelse og forankringsuafhængig vækst. I kliniske prøver, blev RPRM gen proteinekspression påvist i 75% (15/20) af ikke-tumor tilstødende slimhinde, men kun i 25% (5/20) af gastriske tumorvæv (p = 0,001). Klinisk-patologisk korrelationer af tab af RPRM udtryk var signifikant forbundet med invasiv etape af GC (fase I til II-IV, p = 0,02), og en positiv sammenhæng mellem RPRM og p73 gen-proteinprodukt-ekspression fundet (p 0,0001 og kappa-værdi = 0,363 ). Afslutningsvis er epigenetisk inaktivering af RPRM genet ved promotor methylering forbundet med tab af RPRM udtryk. Funktionelle analyser tyder på, at RPRM opfører sig som en GTS. Tab af ekspression af RPRM gen proteinprodukt er associeret med den invasive fase af GC. Positiv sammenhæng mellem RPRM og p73 udtryk tyder på, at andre medlemmer af p53-genet familien kan deltage i reguleringen af ​​RPRM udtryk

Henvisning:. Saavedra K, Valbuena J, Olivares W, Marchant MJ, Rodríguez A, Torres- Estay V, et al. (2015) Tab af ekspression af Reprimo, en p53-induceret cellecyklusstop Gene, korrelerer med invasiv tumorudviklingsstadie og P73 Expression i Gastric Cancer. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10,1371 /journal.pone.0125834

Academic Redaktør: Mohammed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Januar 16, 2015; Accepteret: 25 marts 2015; Udgivet: 8. maj 2015

Copyright: © 2015 Saavedra et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:.. Dette virker blev støttet af tilskud CONICYT-FONDECYT # 1111014 (AHC) og CONICYT-FONDAP # 15.130.011 (AHC og JCR) fra Chiles regering

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald og den femte mest almindelige malignitet verdensplan [1]. På trods af den faldende forekomst af GC, delvis på grund af anerkendelsen af ​​visse risikofaktorer (f.eks

Helicobacter pylori

og miljømæssige faktorer), er det stadig en af ​​de mest almindelige kræftformer i hele verden og er fortsat en klinisk udfordring [2 , 3]. Gastrisk carcinogenese indebærer en gradvis akkumulering af genetiske og epigenetiske ændringer, der fører til dysregulation i ekspressionen af ​​onkogener og tumorsuppressorgener (GTS) [4]. Reprimo (RPRM) er en hidtil ukendt formodet GTS [5,6] og forbundet med gastrisk carcinogenese [7]. Desuden har vi foreslået, at methyleret RPRM cellefri DNA kan være en potentiel biomarkør for den ikke-invasiv detektion af GC [8,9].

RPRM er en meget glycosyleret protein lokaliseret overvejende i cytoplasmaet og er blevet identificeret som en nedstrøms effektor af p53-induceret cellecyklusstandsning ved G2 /M [10]. Rapporter antyder, at RPRM ekspression reguleres af to mekanismer, en gennem DNA-methylering ved dets promotorregion [8] og den anden af ​​p53 pathway [10]. Imidlertid har nyere undersøgelser ikke kunnet bekræfte disse resultater [6]. På den anden side har den kliniske betydning af RPRM blevet dårligt undersøgt [11]. I den foreliggende undersøgelse evaluerede vi rollen af ​​DNA-methylering ved reguleringen af ​​RPRM ekspression, dens kliniske betydning og dets associering med medlemmer af p53 tumor suppressor protein familie (dvs. p53 og p73). Vi fandt tætte methylering i RPRM promotorregionen, der var forbundet med tab af ekspression i GC cellelinier. I kliniske tilfælde blev tab af ekspression forbundet med invasivitet fase af GC. Desuden observerede vi en positiv sammenhæng mellem udtryk for RPRM og p73, hvilket tyder på, at andre medlemmer af p53-genet familien kan være nye kandidater til reguleringen af ​​RPRM udtryk.

Metoder

cellelinjer og vævsprøver

Fire GC cellelinjer (AGS, SNU-1, KATOIII og NCI-N87) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC) i december 2012 dyrket i RPMI-1640 medium (Hyclone) og suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og holdt ved 37 ° C, 5% CO

2. Tyve matchede tumor og ikke-tumor tilstødende slimhinder (NTAM) prøver blev udvalgt til evaluering af RPRM ekspression. Seks blev udvalgt til evaluering af RPRM methylering. En kohorte af 114 GC patienter blev udvalgt til klinisk-patologiske korrelationer af RPRM gen protein produkt. Vævsprøver fra individuelle sager blev klassificeret i henhold til japansk Research Society for mavekræft anbefalinger [12]. Alle sager blev rekrutteret fra Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas-Hospital Clínico San Borja Arriarán (ICHJED-HCSBA), Santiago, Chile mellem 1993-2000 [13] og klinisk-patologiske træk er vist i tabel 1. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional anmeldelse bestyrelser Pontificia Universidad Católica de Chile (Comité de Etica Científico) og ICHJED-HCSBA (Comité de Etica Científico, Servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Chile). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver deltager involveret i undersøgelsen.

Tissue microarray og Immunhistokemi

Tissue microarrays (TMA) blev udført ved hjælp af en manuel Tissue Array II instrument (Beecher Instruments ) som tidligere beskrevet [14,15]. Kernesektionerne (4 um) blev underkastet immunfarvning af Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), ifølge producentens instruktioner. Antistoffer anvendt i denne undersøgelse var RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (klon 318-6-11, Dako Danmark) og p73-protein α (klon 24, Novacastra). Resultater af immunfarvning i hele tumoren og NTAM samt TMA snit blev betragtet som positive for RPRM hvis 30% af epitelceller viste cytoplasmatisk farvning, 10% nuklear farvning for p53, eller 10% nukleare /cytoplasmisk farvning for p73 . Evaluering af immunhistokemisk farvning blev udført uafhængigt af to patologer (JV GC). Der var blindet til kliniske data

Bisulfite sekventering og kvantitativ RT-PCR Expression Analysis

DNA fra GC cellelinjer var ekstraheret ved anvendelse TRlzol-reagens (Life Technologies) ifølge fabrikantens protokol, efterfulgt af omdannelse med bisulfit hjælp af EZ DNA-methylering Gold kit (Zymo Research). RPRM promotoren blev amplificeret fra bisulfit behandlede DNA under anvendelse af primere RPRM_B_FW 5′-TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 ‘og RPRM_B_RV 5′-CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3’, hvilket tillader påvisning af 52 CpG sites inden for en 509-bp promotorregion. PCR-produkter blev oprenset med QIAXEN II gelekstraktionskit (Qiagen) og ligeret i pGEM-T-vektor. Ligeringsproduktet blev anvendt til at transformere kompetente

E

.

coli

Top10 celler, ifølge fremgangsmåden beskrevet af Inoue et al. [16]. Transformanterne blev selekteret på LB-agarplader suppleret med ampicillin (100 ug /ml), X-Gal (50 mg /ml) og IPTG (100 mM). De resulterende hvide kolonier blev vurderet ved koloni-PCR. Positive kloner blev dyrket på flydende medium (LB /ampicillin), indtil slutningen af ​​den eksponentielle fase (OD600 = 1) og DNA-plasmider blev oprenset ved anvendelse Pure Udbytte miniprep-system (Promega). Den RPRM promotorområdet blev sekventeret ved anvendelse universel M13 (W 5′-GTAAAACGACGGCCAG-3 ‘og RV 5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′) ved Macrogen (https://dna.macrogen.com). BiQ analysator software blev anvendt til analyse af sekventerede kloner. Alle positive pGEM-T-kloner blev dyrket på LB /ampicillin-medium og opbevaret ved -80 ° C (i 14% glycerol). Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) og cDNA blev syntetiseret under anvendelse iScript cDNA Synthesis kit ifølge producentens instruktioner (BioRad). Efterfølgende blev cDNA anvendt til hver PCR-reaktion med hvert primerpar. De RPRM specifikke primere er: RPRM_FW 5’-GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 ‘og RPRM_RV 5′-CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3’. Real time RT-PCR-analyse blev udført ved anvendelse LightCycler Fast Start DNA MasterPlus SYBR Green I (Roche) i en LightCycler 1.5 Real-Time Detection System (Roche). Relativ kvantitativ analyse normaliseret til RPL-30 blev gennemført via den sammenlignende tærskel cyklus metode [17]. De RPL-30 specifikke primere er:. RPL-30_Fw 5′-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 ‘og RPL30_RV 5′-AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3’

Validering af RPRM antistof ved immunoblot og Immunofluorescens

3×10

5 AGS-celler blev transient transficeret med pCMV6 /RPRM eller pCMV6 (Origene) tom vektor, under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne inkuberet i 24 timer i RPMI1640 med 10% FBS i nærvær eller fravær af N-glycosylering inhibitor Tunicamicyn (10 ng /ml). Celler blev høstet og hel-cellelysater blev ekstraheret ved anvendelse af Triton-buffer (Tris-HCI 50 mM pH 7,5, NaCl 0,1 M, 0,5% Triton X-100) med Protease Inhibitor Cocktail Kit (P8340, Sigma Aldrich) og Phosphatase Inhibitor Cocktail Kit ( sc-45045, Santa Cruz Biotechnology). Proteinkoncentrationer blev bestemt ved hjælp af Quick Start Bradford Reagent (Bio-Rad). Halvtreds ug protein blev separeret på SDS-PAGE på 4% til 12%. Proteiner på gelerne blev elektroblottet til polyvinylidendifluorid-membraner ved hjælp af mini transblotter systemet (Bio-Rad, Hercules, CA). De polyvinylidendifluorid membraner blev blokeret i 5% mælk i Tris-bufret saltvand /Tween 20 (TBST) i 1 time. Primært antistof anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) blev fortyndet 1: 1000 i TBST /3% BSA /og membranerne blev inkuberet i primære antistoffer ved 4 ° C natten over. Membraner blev vasket tre gange i TBST i 10 minutter hver. Anti-kanin peroxidase-konjugeret sekundært antistof (Santa Cruz) blev fortyndet 1: 2000 i TBST og inkuberet på membranerne i 1 time ved stuetemperatur. Membranerne blev vasket som ovenfor og visualiseret ved hjælp SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) ifølge producentens protokol. For at evaluere den cellulære placering af RPRM blev immunfluorescens-assay udført. AGS celler forbigående transficeret med pCMV6-RPRM eller pCMV6 blev dyrket på dækglas. De forbigående transficerede AGS-celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur og derefter vasket tre gange i phosphatbufret saltvand (PBS). Celler blev permeabiliseret i 0,1% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) i 10 minutter, blokeret i 3% BSA i 1 time ved stuetemperatur, og derefter mærket med et anti-RPRM antistof (1: 1000, 38-50, Sigma-Aldrich). Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med en Alexa Fluor 488-konjugeret antistof (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene) i 1 time ved stuetemperatur. Billeder blev erhvervet af fluorescens laser scanning konfokal mikroskopi (se Støtte Information S1 og S2 Fig).

Cell kultur og transfektion

For stabil transfektion eksperimenter, AGS celler blev udsået på 3×10

5 celler /100-mm dyrkningsskål og transficeret efter 24 timer med pCMV6-RPRM eller pCMV6 (Origene) tom vektor under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Otteogfyrre timer efter transfektion blev celler dyrket under de samme betingelser med G418 (500 g /ml). Dyrkningsmedier blev skiftet hver 24. time i 14 dage.

Kolonidannelse assay

I kolonidannelse assayet blev 200 celler stabilt transficeret med pCMV6-RPRM eller pCMV6 tom vektor. Celler blev dyrket i RPMI-1640 medium (Hyclone) og suppleret med 10% FBS. Dyrkningsmedier blev skiftet hver 24 timer. Kolonier blev farvet ved anvendelse 0,4% krystalviolet (Sigma) i 50% methanol, 21 dage efter første podning og talt ved 20 billeder taget under omvendt mikroskop (Evos XL Core Cell Imaging System, Life Technologies). Hver transfektion blev udført tre gange. Desuden blev replikerer eksperimenter udført for at opnå yderligere kloner til ekspression analyse.

forankringsuafhængig vækst assay

forankringsuafhængig cellevækst blev analyseret ved udpladning 1% agarose indeholdende 2×10

5-celler stabilt transficeret med pCMV6-RPRM eller pCMV6 tom vektor i 6-brønds plader. Celler blev fodret ugentligt ved overliggende frisk blød-agar-opløsning, og kolonier blev fotograferet efter 4 ugers inkubation. Forsøget blev udført i tre eksemplarer.

Statistical Analysis

Spearman korrelationskoefficient blev beregnet til at analysere sammenhængen mellem RPRM methylering og genekspressionsniveauer. Kategoriske variabler blev analyseret ved Pearson Chi-square test (to-sidet) blev p-værdien korrigeres med en logistisk regressionsanalyse. Kontinuerlige variabler blev analyseret ved anvendelse af Students

t

test og data blev udtrykt som middel ± SD. Kappa test blev anvendt til at analysere sammenhængen mellem RPRM udtryk og p73 udtryk. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 17,0 (SPSS Inc., Chicago, IL) statistisk pakke og GraphPad Prism5 software (La Jolla, CA, Amerikas Forenede Stater). Alle værdier var to-halet, bortset Spearman rank korrelation. Statistisk signifikans blev defineret som p 0.05.

Resultater

RPRM methylering og udtryk i gastrisk cancer cellelinjer

Tidligere vi og andre har rapporteret, at RPRM udtryk kan genoprettes ved demethyleringsmiddel 5-aza -2-deoxycytidin (Se Støtte Information S3 og S4 fig) [5,8,18]. Men RPRM methylering er blevet svagt korreleret med dets ekspression [18]. For yderligere at vurdere sammenhængen mellem RPRM promotor methylering og genekspression blev den komplette promoter region RPRM gen analyseret ved DNA bisulfit sekventering i fire GC cellelinier (AGS, SNU-1, KATO III og NCI-N87) (Fig 1A). Således status methylering af 52 CpG sites, ligger mellem -207 og +302 nukleotider i forhold til transkriptionsstartsitet (TSS), blev analyseret. Denne analyse viser tætte methylering i cellelinjer AGS og SNU-1 (89,6% og 86%, henholdsvis), i sammenligning med KATO III og NCI-N87 (79,7% og 51,8%, henholdsvis) (p = 0,0002) (fig 1B) . Dernæst niveau af RPRM ekspression blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Lav RPRM genekspression blev observeret i AGS og SNU-1 i forhold til KATO III og NCI-N87 cellelinjer (p 0,0001) (Fig 1C). Af Spearmans korrelationsanalyse viste betydelig negativ korrelation blev fundet mellem methylering tæthed og RPRM genekspression (r = 1; p = 0,042) (Fig 1D). Tilsammen tyder disse resultater på, at methylering af RPRM promoter region spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​RPRM udtryk.

A) RPRM promotorområde analyseret af bisulfit kvantificering. B) DNA Bisulfite sekventering i gastriske cancercellelinier. C) Relativ udtryk for RPRM i fire gastrisk cancer cellelinjer ns: ingen betydende; * P 0,01; ANOVA test En-vejs. D) Spearman rank korrelation mellem RPRM udtryk og promotor methylering status RPRM. E) RPRM methylering i tumor og ikke-tumor tilstødende slimhinder (NTAM) væv, højere methylering niveauer i tumorvæv observeres i forhold til NTAM i alle seks parrede GC sager.

RPRM methylering og udtryk i mavekræft væv

For at bekræfte tidligere data i GC væv, blev RPRM methylering niveauer bestemt i 6 parrede tumor og NTAM prøver. Resultaterne indikerer højere methylering niveauer i tumorvæv sammenlignet med NTAM væv (se fig 1E). For at undersøge ekspressionen af ​​RPRM gen proteinprodukt i GC væv blev udført IHC analyser. Positive RPRM ekspression blev hovedsageligt observeret i cytoplasmaet af gastriske epitelceller. RPRM gen-proteinekspression blev påvist i 75% (15/20) af NTAM væv prøver. Men kun 25% (5/20) af tumorprøver viste ekspression af RPRM gen proteinprodukt (figur 2). Disse forskelle var yderst signifikant (p = 0,001) og antyder, at ekspression af RPRM er tabt i GC væv. For at evaluere den kliniske betydning af dette tab af RPRM udtryk en kohorte af 114 GC sager blev evalueret. Tab af RPRM ekspression blev fundet i 62% (71/114) af GC tilfælde. Klinisk-patologiske korrelationer af RPRM ekspression er vist i tabel 1. Progression fra trin I GC til trin II-IV (p = 0,006) og lymfeknudemetastaser (p = 0,037) var signifikant associeret med tab af ekspression af RPRM gen proteinprodukt. logistisk regressionsanalyse viser dog, at kun progression fra trin I til II-IV er signifikant associeret med tab af RPRM gen proteinprodukt (p = 0,020).

A) Et repræsentativt eksempel på ikke-tumor tilstødende slimhinder (NTAM ) viser positiv cytoplasmatisk farvning af RPRM i mere end 30% af cellerne. B) Repræsentant eksempel på tumor (T) mavekræft prøve viser negativ farvning af RPRM.

Funktionel analyse af RPRM i gastrisk cancer (kolonidannelse og forankringsuafhængig vækst)

Som tabet af RPRM udtryk var forbundet i GC og hovedsagelig med progression fra fase i til II-IV, kan en tumor suppressor rolle RPRM være plausibel. Derfor funktionelle assays, såsom

in vitro

kolonidannelse og forankringsuafhængige vækst-assays blev udført i AGS celle transficeret med pCMV6 /RPRM (Fig 3A). Ikke-udtrykkende AGS cellelinier transficeret med RPRM ekspressionsplasmider viste en signifikant reduceret antal kolonier i sammenligning med pCMV6- tom vektor-transficerede cellelinier transficeret med pCMV6-tom vektor (p 0,05). Under hver graf er repræsentative plader viser reduktion af kolonier efter gen overekspression Fejlsøjler; SD. C) Overekspression af RPRM i AGS celler (pCMV6 /RPRM) resulterede i en betydelig reduktion af

in vitro

forankringsuafhængig kolonidannelse sammenlignet med AGS cellelinje transfekteret med pCMV6 tom vektor (pCMV6). Hvert forsøg blev udført tredobbelt. Der var en statistisk signifikant reduktion af kolonier dannelse i overekspressionen eksperimenter (* p 0,05). Under hver graf er repræsentative plader viser reduktion af kolonier efter gen overekspression Fejlsøjler; SD

Foreningen af ​​RPRM udtryk og p53 /p73 tumor suppressor protein familie i mavekræft

RPRM er blevet defineret som en p53-medieret gen i embryonale fibroblastceller [18]. Imidlertid er det blevet rapporteret, at regulering af RPRM ekspression kan være uafhængig af p53-genet status i neuronale celler behandlet med kobber [19]. På den anden side p73 kan aktivere transkriptionen af ​​p53-responsive gener [20]. I betragtning af denne indstilling, vurderet vi udtryk for p53 og andre medlemmer af p53-proteinet familien, P73 GTS. Ekspression af p53 var placeret i kernerne i maveslimhinden celler. Positive p53-ekspression blev påvist i 23,5% (20/114) af GC tilfælde. Kun tumorstørrelse var forbundet med ekspressionen af ​​p53 (p = 0,035, se tabel 2). Ekspression af P73 blev placeret i cellekernerne og cytoplasma af epitelceller. Positive P73-ekspression blev fundet i 30,6% (34/114) af GC-prøver. Interessant nok blev signifikante klinisk-patologiske korrelationer af p73-ekspression er forbundet med invasiv trin (trin I 55,6%; 10/18 til trin II-IV 25,8%, 24/93, s = 0,012) og lymfeknudemetastaser (p = 0,038) (tabel 2 ). Da tab af udtryk for RPRM og p73 genet protein produkter har lignende klinisk-patologiske korrelationer, vi evaluerede sammenhæng mellem udtryk for niveauet af begge proteiner. Med henblik herpå sager blev adskilt i fire grupper efter ekspression af RPRM og p73 protein produkter. Analysen viste, at 22 ud 111 GC sager var positive for både RPRM og P73 proteiner, mens 57 ud 111 var negative. Denne forening var statistisk signifikant (p 0,0001) med en kappa værdi på 0,363 (tabel 3)

Diskussion

RPRM er en yderst glykosyleret cytoplasmatisk protein, i første omgang identificeret. som en nedstrøms effektor af p53-induceret cellecyklusstandsning ved G2 /M. Tidligere er det blevet foreslået, at RPRM er tavse af promotor methylering, selvom den er blevet svagt korreleret med dets ekspression [5,8]. Desuden har RPRM blevet foreslået som et formodet tumorsuppressorgen i renalcellecarcinom og hypofysetumorer [5,6]. I denne undersøgelse har vi påvist, at RPRM genekspression er stærkt forbundet med dets status promotorregion methylering, hvilket antyder epigenetisk inaktivering af RPRM genekspression. Desuden viser vi, at RPRM gen protein produkt blev reduceret i GC væv sammenlignet med noncancerous maveslimhinden. Disse resultater er i lighed med Luo

et al

. [11], som rapporterede tab af RPRM i GC sammenlignet med mavesår vævsprøver. Desuden er vores konklusion vedrørende tab af ekspressionen af ​​RPRM i overgangen fra fase I til fase II-IV er klinisk relevant. Luo

et al

. [11] rapporterede en lignende konklusion, men i et mindre antal trin I GC tilfælde (n = 15). Disse resultater kan have klinisk betydning som en prædiktiv faktor for udviklingen af ​​GC. Derfor med dette tab af RPRM udtryk i udviklingen af ​​GC, vores funktionelle assays (koloni dannelse og forankringsuafhængige vækst) foreslog også en formodet tumor suppressor rolle for RPRM i GC.

Selvom p53 oprindeligt blev beskrevet som en RPRM spole [10], kliniske undersøgelser udført ajour har ikke været i stand til at bekræfte sådanne fund [6,18]. Her har vi identificeret, at tab af RPRM udtryk korrelerer med tab af ekspressionen af ​​et andet medlem af p53 familien, P73. Selvom P73 TSG udtrykkes på et meget lavt niveau i normale humane væv [21], overudtrykkes i mange forskellige humane cancere, såsom brystcancer, neuroblastom, lunge, spiserør, mavesæk, colon, blære og ovarie [14,22]. Desuden er det blevet rapporteret, at p73 kan aktivere transkriptionen af ​​p53-responsive gener, herunder p21Waf1 /Cip1, bax, MDM2, cyclin-G, GADD45 og IGFBP3 [20]. Således baseret på vores resultater, foreslår vi, at RPRM ekspression kunne reguleres ved P73 i en p53-uafhængig måde.

Sammenfattende vores data tyder på, at epigenetisk inaktivering af RPRM genet ved promotor-methylering er forbundet med tab af RPRM ekspression og følgelig foreslået funktionelle assays en formodet tumor suppressor rolle RPRM i GC. I kliniske prøver, er RPRM tabt ved invasive stadier af GC og dens udtryk korrelerer med den for p73 tyder på, at andre medlemmer af p53-genet familien kan deltage i reguleringen af ​​RPRM udtryk. Yderligere forskning er berettiget til at karakterisere rolle RPRM i udviklingen af ​​GC og validere biologiske regulering af RPRM ved P73.

Støtte Information

S1 data. . Data, ligger til grund for undersøgelsen

doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s001

(ZIP)

S1 Fig. Effekter af Tunicamicyn på RPRM protein.

RPRM er en yderst glykosyleret cytoplasmatisk protein visualiseret til 25 kD ved Western blot, glycosyleringen inhibitor tunicamycin (TK) forskyder 25 kD RPRM bandet til 15 kD i AGS celler med RPRM overekspression (pCMV6 /RPRM) (RPRM forudsagte størrelse 12 kD). Celler blev inkuberet i 24 timer i RPMI1640 med 10% FBS i nærvær eller fravær af inhibitoren af ​​N-glycosylering tunicamicyn (10 ng /ml). RPRM ekspression blev bestemt ved Western blotting under anvendelse af et RPRM polyklonalt antistof (øverste panel, fortynding 1: 1000, Sigma-Aldrich). Udtrykket af β-actin (nedre panel, fortynding 1: 2000, Santa Cruz) repræsenterer protein lastning

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s002

(TIF)

S2 Fig. Lokalisering af RPRM udtryk i overekspression AGS cellelinje Immunofluorescens af RPRM i mavekræft AGS cellelinje transfekteret med pCMV6 vektor kodning RPRM.

24 h efter transfektion celler blev fikseret i paraformaldehyd 4% og inkuberes med anti-RPRM-kanin (1 : 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) og sekundært antistof Alexa Fluor-488 (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene). En positiv udtryk for RPRM (GRØN) er primært ses i cytoplasmaet. Billeder blev taget til fange ved hjælp Axio Vision4 multikanal software i fluorescens mikroskop Axio Scope.A1- Zeiss

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s003

(TIF)

S3 Fig. RPRM ekspression tavse af promotor-methylering.

A) RT-PCR-analyse af RPRM mRNA-ekspression i AGS gastrisk cancercellelinie med og uden DNA-methyleringsinhibitor 5-azacytidin (1 uM i 72 timer). GAPDH blev anvendt som kontrol. B) Amplifikation af RPRM ved methylering specifik PCR i AGS gastrisk cancercellelinie. Amplifikation af methyleret MYOD1 blev anvendt som kontrol. AGS cellelinje blev methyleret i promotorregionen. NC: negativ kontrol

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s004

(TIF)

S4 Fig. RPRM ekspression tavse af promotor-methylering (original gel).

A) RT-PCR-analyse af RPRM mRNA-ekspression i AGS gastrisk cancercellelinie med og uden DNA-methyleringsinhibitor 5-azacytidin (1 uM i 72 timer). GAPDH blev anvendt som kontrol. B) Amplifikation af RPRM ved methylering specifik PCR i AGS gastrisk cancercellelinie. Amplifikation af methyleret MYOD1 blev anvendt som kontrol. AGS cellelinje blev methyleret i promotorregionen. NC:. Negativ kontrol

doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s005

(TIFF)

Tak

Vi vil gerne takke Sabina Magedson for hendes bidrag i bygning tissue Microarrays. Vi vil også gerne takke Hiroshi Kawachi for histologisk undersøgelse af sager, Ignacio Wichmann for deres værdifulde kommentarer til vores manuskript og Oslando Padilla for hans vigtige støtte i statistisk analyse.