PLoS ONE: Sulindac Forbindelser Lette cytotoksicitet β-lapachon ved opregulering af NAD (P) H Quinon oxidoreductase i Human Lung Cancer Cells

abstrakt

β-lapachon, en vigtig komponent i et ethanolekstrakt af

Tabebuia avellanedae

bark, er et lovende potentiale terapeutisk lægemiddel mod forskellige tumorer, herunder lungekræft, den hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. I den første del af denne undersøgelse fandt vi, at apoptotisk celledød induceret i lungecancerceller af høje koncentrationer af β-lapachon blev medieret af forøget aktivering af pro-apoptotisk faktor JNK- og nedsat aktivering af celleoverlevelse /proliferation faktorer PI3K, AKT, og ERK. Desuden blev β-lapachon toksicitet positivt korreleret med ekspressionen og aktiviteten af ​​NAD (P) H quinon oxidoreduktase 1 (NQO1) i tumorcellerne. I den anden del, fandt vi, at FDA-godkendte, ikke-steroide anti-inflammatorisk lægemiddel sulindac og dets metabolitter, sulindac sulfid og sulindac sulfon, øget NQO1 udtryk og aktivitet i lunge adenocarcinom cellelinjer CL1-1 og CL1-5, som har lavere NQO1 niveauer og lavere følsomhed over for Hapachon behandling end de A549 cellelinier, og at inhibering af NQO1 ved enten dicoumarol behandling eller NQO1 siRNA knockdown inhiberede denne sulindac-inducerede stigning i β-lapachon cytotoksicitet. Afslutningsvis sulindac og dets metabolitter synergistisk øge anticancer effekter af β-lapachon primært ved at øge NQO1 aktivitet og udtryk, og disse to lægemidler kan tilvejebringe en ny kombinationsbehandling lungekræft

Henvisning:. Kung HN, Weng TY, Liu YL, Lu KS, Chau YP (2014) Sulindac Forbindelser Lette cytotoksicitet β-lapachon ved opregulering af NAD (P) H Quinon oxidoreductase i human Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (2): e88122. doi: 10,1371 /journal.pone.0088122

Redaktør: Gergely Szakacs, Ungarsk videnskabsakademi, Ungarn

Modtaget: April 2, 2013; Accepteret: 5 januar 2014; Publiceret: 5 feb 2014

Copyright: © 2014 Kung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud (NSC 101-2320-B-002-020-MY3, NSC 98-2320-B-715-001-MY3 (YPC) og NSC 101-2320-B-002-008) fra National Science Rådet , Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

β-lapachon, en naturlig o-naphthoquinon oprindeligt stammer fra

lapacho

træer i Sydamerika, har lovende anti-tumor aktivitet på forskellige tumorceller [1] – [6] og har været testet som en anti-tumor kandidat lægemiddel i fase i /II /III kliniske forsøg i kombination med andre kemoterapeutiske lægemidler [1], [7]. Dens anti-cancer-aktivitet menes at skyldes de to-elektron reduktion af β-lapachon katalyseret af NAD (P) H: quinon oxidoreduktase (NQO1, DT-diaphorase) under anvendelse NAD (P) H eller NADH som elektronkilden [ ,,,0],1], [8], [9]. I nærvær af NQO1, β-lapachon undergår reduktion til en ustabil hydroquinon, som hurtigt undergår en totrins oxidation tilbage til den oprindelige forbindelse, og således gør et forgæves redox-cyklus og resulterer i dannelsen af ​​reaktive oxygenarter (ROS), herunder superoxider [ ,,,0],8], [10] – [12]. Disse reaktive arter kan oxidere thiolgrupper af mitokondrie overgang pore kompleks, hvilket fører til øget mitokondriel indre membran permeabilitet, reduceret mitochondriemembran depolarisering, og frigivelse af cytochrom c, hvilket resulterer i celledød [13], [14]. Fordi NQO1 er mere stærkt udtrykt i forskellige faste cancere end i normale væv [15], kan β-lapachon selektivt at dræbe disse cancerceller. Desuden kan højere NQO1 ekspression eller aktivitet i cancerceller gøre dem mere følsomme over for Hapachon. For at øge den kliniske effekt af β-lapachon, er mange metoder blevet undersøgt for at forøge NQO1 ekspression eller aktivitet i cancerceller [3], [5], [16] – [19].

Sulindac er en Food and Drug Administration (FDA) -godkendte non-steroidt antiinflammatorisk lægemiddel (NSAID) til behandling af osteoarthritis, ankyloserende spondylitis, gigt, eller rheumatoid arthritis [20] – [23]. Dens anti-inflammatorisk aktivitet skyldes dets inhibering af syntesen af ​​prostaglandiner [24], som forårsager inflammation og smerte i kroppen. Sulindac har også vist sig at blokere cyklisk guanosinmonophosphat-phosphodiesterase, et enzym, der inhiberer den normale apoptose signalvejen, og denne hæmmende virkning tillader den apoptotiske signalvej at fortsætte uden modstand, hvilket resulterer i apoptotisk celledød, reducere antallet af forskellige tumorer, herunder bryst, esophageal, mave, prostata, blære, ovarie, og lungecancere [25], [26]. Hos mennesker er sulindac reduceres til den aktive antiinflammatoriske metabolit, sulindac sulfid undergår en 2-trins reoxidation til sulindac sulfon [27], [28]. Alle tre forbindelser er blevet vist at have kemobeskyttende virkninger. I tyktarmskræft, er sulindac blevet anvendt til at øge anticancer effekter af visse reagenser eller spændinger, herunder bortezomib [4], hydrogenperoxid [29], og oxidativ stress [30]. Vigtigere, sulindac og dets metabolitter modulerer ekspressionen af ​​multioxidative enzymer, herunder glutathion-S-transferaser og NQO1, hvor sidstnævnte er den vigtigste regulator af β-lapachon-induceret celledød i cancerceller [28], [31], [32], og sulindac kunne derfor have en synergistisk antitumorvirkning med β-lapachon

Lung cancer, den største kræft verdensplan, er nu den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald [33] – [35].. Ifølge en rapport fra Department of Health, Executive Yuan, ROC (Taiwan), offentliggjort i 2010, dødeligheden for lungekræft er 20%, topping listen over alle kræftrelaterede dødsfald. Udgifterne til sundhedsvæsenet til behandling af lungesygdomme stiger voldsomt hvert år, og truer med at overvælde offentlige sundhedsydelser [36]. For at få et bedre mål terapi, har forskere forsøgt at identificere de vigtigste forskelle mellem lunge- kræftceller og normale lunge celler, såsom mutation eller overekspression af gener, herunder

EGFR, ras

, og

VEGF

[37] – [39]. Desværre, nuværende kemoterapier for lungekræft mangler tilstrækkelig specificitet, effektivitet og behandling heterogenitet er også et stort problem [40]. Der er derfor et presserende behov for nye terapeutiske lægemidler eller nye kombinationer af lægemidler til at give en mere effektiv lungekræft terapi. Da NQO1 overekspression er blevet bemærket i både ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinie [41], [42], kan β-lapachon være en potentiel terapeutisk lægemiddel til lungekræft. Men nogle lungecancerceller viser lavere NQO1 ekspression eller aktivitet og kan derfor være resistent over for Hapachon toksicitet. I denne undersøgelse vi først undersøgt forholdet mellem β-lapachon toksicitet og NQO1 niveauer i NSCLC-cellelinier, derefter bestemt signalvejen er involveret i celledød forårsaget af høje koncentrationer af β-lapachon. Vi anvendte også lavere koncentrationer af β-lapachon at undersøge, om sulindac og dets metabolitter kunne lette anticancervirkning af β-lapachon ved forøgelse NQO1 ekspression eller aktivitet i lungekræft cellelinier med lav NQO1 niveauer og kontrolleres betydningen af ​​NQO1 i denne kombinationsterapi . Vi fandt, at toksiciteten af ​​β-lapachon var relateret til niveauet af NQO1 ekspression eller aktivitet i lunge cancerceller og at høje koncentrationer af β-lapachon dræbte celler ved at nedsætte phosphorylering af PI3K, AKT, og ERK og aktivering JNK. Desuden blev cytotoksiciteten af ​​lave koncentrationer af β-lapachon steg med kombination med sulindac og dets metabolitter, en proces, der involverer opregulering af ekspression eller aktivitet af NQO1.

Materialer og metoder Salg

Cell Culture

De humane lungecancer-cellelinjer CL1-1, CL1-5, og A549, blev dyrket i 5% CO

2 ved 37 ° C i RPMI 1640 medium indeholdende 10% føtalt kalveserum, 100 enheder /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (alle fra Gibco). De cellelinjer var gaver fra Dr. PC Yang, National Taiwan University Hospital [43], i hvis laboratorium CL1-5 celler blev udvalgt fra forældrenes CL1-1 celler til større metastatisk potentiale ved hjælp af et transwell system.

Cell levedygtighed Assays

CL1-1, CL1-5 eller A549-celler (1×10

4) blev podet i 24 timer ved 37 ° C i en 96-brønds kulturplade, derefter blev underkastet udsultning for 14 h i RPMI 1640 medium indeholdende 2% føtalt kalveserum, 100 enheder /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin. Efter 6 timer forbehandling med medium eller den angivne koncentration af sulindac eller dets metabolitter (alle fra Sigma) blev cellerne inkuberet i 12 timer med eller uden den angivne koncentration af β-lapachon i den fortsatte tilstedeværelse af sulindac eller dets metabolitter, og derefter cellelevedygtighed blev evalueret.

To cellelevedygtighedsassays blev anvendt. I krystalviolet farvning assay blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, farvet med 0,4% krystalviolet i 15 minutter, og vasket med H

2O, derefter 50% syre alkohol blev anvendt til at opløse det bundne krystal violet, og OD ved 550 nm målt på en ELISA-læser. I MTT-assayet, blev 10 pi MTT (0,5 mg /ml) (Sigma) tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer, derefter formazan produkt blev opløst i 100 pi DMSO ved 37 ° C i 30 min, og OD ved 570 nm målt på en mikropladelæser.

acridin orange (AO) Farvning

Celler (5×10

4) dyrket på cover-slides i 24 brønde pladerne blev inkuberet i 14 timer i RPMI 1640 medium indeholdende 2% føtalt kalveserum, præinkuberet med sulindac sulfid i 6 timer, og derefter behandlet med eller uden β-lapachon i 24 timer, derefter straks blev fikseret i 4% paraformaldehyd i phosphatpufret saltvand (PBS) i 10 minutter ved stuetemperatur (RT) og farvet i 10 minutter med 0,5 ml AO (10 mg /ml i PBS) (Sigma). Efter flere gange vask med PBS blev cellerne undersøgt på et Olympus BH-2 omvendt mikroskop udstyret med en fluorescens vedhæftet fil.

Påvisning af apoptose og måling af intracellulære calcium niveauer

For at detektere apoptose celler ( 1×10

6) blev behandlet i 3, 6 eller 9 timer med 5 pM β-lapachon, derefter blev vasket med iskold PBS, trypsinbehandlet med 0,05% trypsin-0,02% EDTA, farves i 15 minutter ved 37 ° C med Annexin V-FITC (10 ug /ml) (Stærk Biotech Corporation, AVK050, Taipei, Taiwan), og analyseret ved flowcytometri på en FACScan flowcytometer (Becton Dickinson).

for at måle intracellulære calcium niveauer, cellerne blev inkuberet i 10 minutter ved 37 ° C med 2 mM Fluo-4 /AM (Molecular Probes), vasket med PBS, trypsinbehandlet, og analyseret ved FACSan flowcytometri under anvendelse af FL1H parameter. Salg

Western Blot analyser

Behandlede celler blev lyseret med RIPA-buffer indeholdende 10 ug /ml proteaseinhibitor (Sigma), og derefter blev lysatet centrifugeret ved 10.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatanten opsamles til immunblotting. Proteinkoncentrationen blev målt ved Bradford-assay, og prøver indeholdende 20 ug protein blev separeret ved 10 eller 12% SDS-PAGE og derefter overført til Immobilon-P-membraner i 2 timer ved 200 V (Millipore) i en Trans-Blot elektroforetisk overførsel celle. Membranerne blev blokeret i 1 time ved stuetemperatur med 5% skummetmælk i PBS-0,2% Tween 20 (PBS-T), derefter inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med antistoffer mod NQO1 (Cell Signaling), PI3-kinase eller p-PI3-kinase (Millipore), AKT eller p-AKT (Epitomics), ERK, p-ERK, JNK eller p-JNK (Cell Signalling), GAPDH (Genetex) eller β-actin (Abcam) fortyndet 1:1000 i 1% BSA. Efter vask i 30 minutter ved RT med PBST blev membranerne inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Perkin-Elmer, Boston, MA; 1:5000 fortynding i PBST), blev derefter bundet antistof påvises ved anvendelse af ECL Western blotting-reagens (Amersham), idet kemiluminescens detekteret under anvendelse af en Fuji Medical X-ray film (Tokyo, Japan) og kvantificeres ved gel imageanalyser med Image Pro software. Intensiteten af ​​båndet af interesse blev divideret med det for β-actin eller GAPDH (loading kontroller), og denne værdi normaliseret til den, der ses med ingen behandling.

RNA Interference

Cellerne blev transficeret med ikke-targeting kontrol siRNA (siNeg) eller siRNA målrettet NQO1 (siNQO1) (Applied Biosystems) ved hjælp XtremeGene siRNA transfektion reagens (Roche), så niveauet af de angivne udskrifter og proteiner blev undersøgt ved realtime PCR (under anvendelse af primerne anført i tabel S1 ), RT-PCR og Western blotting, og cellerne blev derefter anvendt i eksperimenter.

Reverse Transcription-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret med Trizol (Invitrogen) og revers-transkriberet til cDNA ved anvendelse af en SuperScript II revers transkription (Invitrogen), derefter PCR blev udført under anvendelse af følgende primere:. NQO1 (F, TCCTCAGAGTGGCATTCTGC R, TCTCCTCATCCTGTACCTCT) eller GAPDH (F, CAACTACATGGTTTACATGTTC R, GCCAGTGGACTCCACGAC)

NQO1 Aktivitet assay

For at måle endogen NQO1 aktivitet i celleekstrakter blev celler vasket med PBS og sonikeret i lysepuffer (25 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 mM DTT). Assayet reaktionsblanding (slutvolumen 200 pi) indeholdt 25 mM Tris pH 7,5, 0,01% Tween 20, 0,7 mg /ml BSA, 40 uM 2,6-dichlorindophenol (DCPIP, Sigma), 5 uM FAD, 200 uM NADH, 50 ug celleekstrakt, og enten 10 uM dicoumarol eller medium. Faldet i DCPIP absorbans ved 600 nm i fravær eller nærvær af dicoumarol blev målt ved 5 sek intervaller i 60 sek og aktiviteten udtrykkes som relativ aktivitet, med kontrollen aktivitet givet en værdi på 1.

Statistisk analyse

Alle kvantitative data er præsenteret som middelværdi ± SEM i mindst tre separate forsøg. Forskelle mellem grupper blev undersøgt under anvendelse af envejs ANOVA med Scheffe test, med p 0,05 (* eller #), s 0,005 (**), eller p 0,001 (***) er betragtet som statistisk signifikant

Resultater

NQO1 Expression og aktivitet i Lung cancer Cells korrelerer med β-lapachon Toksicitet

for at sammenligne cytotoksicitet β-lapachon forskellige lunge- kræftceller, tre cellelinjer, CL1-1 , CL1-5, og A549, blev inkuberet i 12 timer med β-lapachon (fra 0 til 10 uM), derefter celleoverlevelse blev målt ved krystalviolet farvning. Som vist i figur 1A, ved anvendelse af 1-5 pM β-lapachon viste A549-celler en signifikant lavere procentdel overlevelse end CL1-1 og CL1-5 celler, men der var ingen signifikant forskel mellem de forskellige celler ved anvendelse af 10 uM β- lapachon. Da NQO1 aktivitet er blevet positivt korreleret med β-lapachon cytotoksicitet i bryst- cancercellelinier [8], [9], [44], undersøgte vi, om følsomheden af ​​de forskellige lungecancer-cellelinjer til Hapachon toksicitet var forbundet med intracellulær NQO1 ekspression. Figurerne 1B-D viste NQO1 aktivitet (fig. 1B), NQO1 RNA-niveauer (fig. 1C), og NQO1 proteinniveauer (fig. 1D) i CL1-1, CL1-5, og A549-celler og viste, at under normale kultur betingelser, alle tre værdier var højest i A549-celler og lavest i CL1-5 celler. Vi derefter sammenlignet følsomheden af ​​A549, CL1-1, og CL1-5 celler til behandling med 0-10 pM β-lapachon for 3, 6, 12 eller 24 timer under anvendelse af krystalviolet farvning og fandt, at den procentvise overlevelse CL1- 5-celler var højere end for CL1-1 celler ved alle 4 tidspunkter, og at A549-celler viste den laveste procentvise overlevelse (fig 1E). Disse resultater stemte godt med de intracellulære NQO1 niveauer i de tre cellelinier, som følsomheden overfor Hapachon var højere i celler med højere NQO1 niveauer. Disse data viste, at NQO1 niveau eller aktivitet spiller en central rolle i β-lapachon cytotoksicitet for lungekræft cellelinier.

(A) Procentvis overlevelse af lungekræft cellelinier CL1-1, CL1-5, og A549 . Celler blev behandlet med 0-10 pM β-lapachon i 12 timer, derefter cellelevedygtigheden blev bestemt ved krystalviolet farvning assay og udtrykt i procent af værdien for kulturer uden β-lapachon. (B-D) NQO1 aktivitetsniveauer (B), NQO1 RNA ekspressionsniveauerne (C), og NQO1 protein udtryk niveauer (D) i de tre lunge kræft cellelinjer dyrket under normale dyrkningsbetingelser. (E) overlevelsen af ​​A549-celler (venstre panel), CL1-1 celler (midterpanelet) og CL1-5 celler (højre panel) inkuberet med den angivne koncentration af β-lapachon for 3, 6, 12 eller 24 timer Procent undersøgt ved krystalviolet farvning og udtrykt som procent overlevelse sammenlignet med de ubehandlede celler. Resultaterne er gennemsnit ± SD for 3 uafhængige forsøg, hver i tre eksemplarer.

I efterfølgende eksperimenter, da β-lapachon alene var meget effektiv til at dræbe A549 celler, og vi ønskede at undersøge, om sulindac eller dets metabolitter havde en synergistisk virkning med β-lapachon koncentrerede vi os om CL1-1 og CL1-5 celler. Eftersom den største forskel i overlevelse CL1-1 og CL1-5 celler blev set ved β-lapachon koncentrationer på 2 til 5 uM, brugte vi 5 pM β-lapachon at undersøge virkningen af ​​β-lapachon alene og 2 uM β-lapachon at studere synergistiske virkninger af sulindac og β-lapachon.

Identifikation af de apoptotiske signalvej udløst af β-lapachon

for at undersøge den underliggende mekanisme er involveret i β-lapachon toksicitet, 5 pM β-lapachon blev anvendt til at udforske den apoptotiske signalvej aktiveres af β-lapachon i CL1-1 og CL1-5 celler. Brug af Annexin V-farvning, celledød i β-lapachon-behandlede CL1-1 og CL1-5 blev påvist at forekomme ved apoptose (figur 2A). Cell cyklus analyse viste også, at sub G0 /G1-forholdet (apoptotiske celler) steg i en tidsafhængig måde (figur S1A). I undersøgelser, der måler intracellulære calciumniveauer, blev en stigning ses efter 1 eller 2 timer af β-lapachon behandlingen i begge CL1-1 og CL1-5 celler (figur 2B, pil), som set under aktivering af apoptotiske vej ved β-lapachon [6], [45]. Den procentvise celleoverlevelse, målt under anvendelse af MTT-assayet blev kun delvis genoprettet ved tilsætning af 0-10 uM BAPTA (Molecular Probes), en intracellulær calcium chelator, under inkubation i 24 timer med 5 pM β-lapachon (figur 2C), der viser at øgede intracellulære calcium var ikke den eneste faktor involveret i β-lapachon-induceret celledød af disse celler. Selvom calpain og caspase 3, komponenter af den apoptotiske signalvej, blev aktiveret ved behandling med 5 pM β-lapachon for 0-9 timer (fig S1B), som vist i supplerende Figur 2, caspaser og calpain var ikke involveret i lungekræft celledød induceret af β-lapachon, som 1 h forbehandling med pan caspaseinhibitor den zVAD eller calpaininhibitor ALLM eller ALLN (alle fra Sigma) hæmmede ikke virkningen (figur S2). I begge cellelinier blev mitokondrielle membranpotentiale (MMP) faldt ved behandling i 3, 6 eller 9 timer med β-lapachon (fig S1c), men intracellulært H

2O

2 niveauer blev ikke ændret ved β -lapachone behandling i 3 eller 6 timer (Figur S1D). Disse resultater viser, at β-lapachon forårsager apoptose af både CL1-1 og CL1-5 celler ved faldende MMP.

(A) CL1-1 celler (venstre panel) eller CL1-5 celler (højre panel) blev inkuberet med 5 uM β-lapachon i 0, 3, 6 eller 9 timer, derefter blev undersøgt for apoptose ved anvendelse af Annexin V. (B) CL1-1 celler (venstre panel) eller CL1-5 celler (højre panel) blev inkuberet med 5 pM β-lapachon i den angivne tid, så intracellulære calcium-niveauer blev målt under anvendelse af Fluo-4-farvning og flowcytometri. Intensiteten af ​​Fluo-4-farvning blev øget med β-lapachon behandling, især på 1 time (pile). (C) CL1-1 celler (venstre felt) eller CL1-5 celler (højre panel) blev efterladt ubehandlet eller blev inkuberet i 24 timer med den angivne koncentration af BAPTA-AM, et intracellulært calcium chelator, og /eller 5 uM β- lapachon, derefter celleoverlevelse blev målt ved MTT-assayet og udtrykt som procent overlevelse sammenlignet med de ubehandlede celler. * P 0,05, ** p. 0,01 i forhold til Hapachon alene

For at bestemme de signalveje aktiveret i β-lapachon-induceret lungekræft celledød, niveauer af phosphorylerede former for PI3K, AKT, og MAPK’er ERK og JNK i CL1-1 og CL1-5 celler blev undersøgt. β-lapachon behandling for 10-180 min forøget JNK-phosphorylering, men faldt phosphorylering af ERK (figur 3A) og af PI3K og AKT (figur 3B). Desuden ved koncentrationer på 1, 2 eller 5 uM, JNK-inhibitoren SP600125 delvist reddet celler fra toksicitet induceret af 24 timers inkubering med β-lapachon (figur 3C), hvilket viser, at JNK spiller en vigtig rolle i lungekræft celledød induceret ved β-lapachon.

(A) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (højre) blev inkuberet med 5 uM β-lapachon i den angivne tid, derefter niveauer af p-ERK, ERK , p-JNK, og JNK blev målt ved Western blotting. (B) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (højre) blev inkuberet med 5 uM β-lapachon i 0, 3, 6 eller 9 timer, derefter niveauer af p-PI3K og p-AKT blev undersøgt af Western blotting. (C) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (højre) blev forbehandlet med de angivne koncentrationer af JNK-inhibitor sp600125 i 6 timer, og derefter behandlet med eller uden 5 pM β-lapachon i 24 h.Cell overlevelse blev målt ved MTT-assayet og udtrykt som procent overlevelse sammenlignet med de ubehandlede celler * p. 0,05 (D) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (højre) blev efterladt ubehandlet eller blev præinkuberet i 1 time med 10 uM dicoumarol, så medium eller 5 uM β-lapachon blev tilsat, og cellerne inkuberes i 9 timer og niveauer af p-PI3K og p-AKT blev målt ved Western blotting.

for at fastslå, om NQO1 var en central regulator i β-lapachon-medieret lungekræft celledød, blev celler inkuberet i 6 timer med 10 pM dicoumarol, en specifik NQO1 inhibitor, og dette resulterede i en reduktion på 67% og 77% i NQO1 aktivitet i CL1- 1 og CL1-5 celler, henholdsvis (fig S3A). Dicoumarol behandling betydeligt inhiberede fald i phosphorylering af p-PI3K og p-AKT forårsaget af 9 h af β-lapachon behandling (figur 3D), blokerede forøgelsen af ​​intracellulære calciumniveauer induceret af 1 time af β-lapachon behandling (fig S3B) og markant inhiberede apoptotisk celledød forårsaget af 6 timers inkubering med β-lapachon, som vist ved Annexin V-farvning (figur 4A) og acridinorange (AO) farvning (Figur 4B).

(A) CL1 -1 celler (øverst) eller CL1-5 celler (nederst) blev efterladt ubehandlet eller blev inkuberet i 6 timer med 5 pM β-lapachon og /eller 10 uM dicoumarol, derefter farvet med Annexin V-FITC og Annexin V fluorescens målt ved flowcytometri. (B) morfologiske ændringer efter lægemiddelbehandling. CL1-1 eller CL1-5 celler forblev ubehandlede (CTL) eller blev inkuberet i 24 timer med 5 pM β-lapachon med eller uden 10 pM dicoumarol, derefter farvet med acridinorange for at observere morfologien af ​​cellekernen. Skalaen søjle repræsenterer 50 um.

Sulindac og dets metabolitter Øge cytotoksiske effekt af β-lapachon gennem Aktivering af NQO1

NSAID sulindac og dets metabolitter, sulindac sulfid (den reducerede form) og sulindac sulfon (det oxiderede form), er kendt for at modulere ekspressionen af ​​nogle multioxidative enzymer, herunder NQO1 [31], [32]. Eftersom NQO1 niveauer og aktivitet negativt var associeret med cytotoksiciteten af ​​β-lapachon, Derefter undersøgte vi, om sulindac og dets metabolitter kan øge cytotoksiciteten af ​​β-lapachon for celler med lav NQO1 ekspression og lavere β-lapachon følsomhed, såsom CL1-1 og CL1-5 celler.

for at bestemme om sulindac og dets metabolitter kan modulere NQO1 udtryk i lungekræft-cellelinjer, blev de brugt i koncentrationer på 100 og 250 pM at behandle CL1-1 og CL1-5 celler til 6, 12 eller 24 timer. Som vist i figur 5A, i CL1-1 celler, begge koncentrationer af sulindac eller metabolit opreguleres NQO1 proteinniveauer på alle 3 tidspunkter, mens, i CL1-5 celler, var resultaterne mere kompleks, en stigning blive set efter inkubation i 12 eller 24 timer med 100 uM, men ikke 250 pM, sulindac, på alle tre tidspunkter med begge koncentrationer af sulindac sulfon eller 100 uM sulindac sulfid, og med 250 pM sulindac sulfid i 6 timer (12 og 24 timer ikke testet) (figur 5A). NQO1 enzymaktivitet blev også forøget med alle tre kemikalier (figur 5B). Som vist i figur S4, ved 100 og 250 uM, de tre lægemidler havde ingen signifikant virkning på den procentvise overlevelse CL1-1 og CL1-5 celler efter inkubering med sulindac eller sulindac sulfon i 54 timer eller med sulindac sulfid i 12 timer. For at undersøge den synergistiske virkning af sulindac eller dets metabolitter og β-lapachon i lungecancerceller, blev CL1-1 og CL1-5 celler inkuberet med 0, 50, 100 eller 250 pM sulindac eller metabolitter i 6 timer, derefter med 2 pM β-lapachon i den fortsatte tilstedeværelse af sulindac eller metabolit i 12 timer, og den procentvise overlevelse blev målt ved anvendelse krystalviolet farvning. Sammenlignet med celler behandlet med β-lapachon alene, var overlevelsen af ​​begge cellelinier faldt med 10-40%, når cotreated med β-lapachon plus sulindac, 20-40% med β-lapachon plus sulindac sulfon, og 30-60% med Hapachon plus sulindac sulfid (figur 6A). Den samtidig behandling-inducerede nedgang var større med CL1-5 celler end med CL1-1 celler, dvs. den var større med de celler, der udtrykker lavere niveauer NQO1 (figur 6A); Desuden er ingen yderligere virkning af kombineret behandling sammenlignet med Hapachon alene blev set med A549-celler (fig S5), som udtrykker de højeste NQC1 niveauer. Disse data viser, sulindac kan øge følsomheden af ​​celler med lave NQO1 niveauer til Hapachon cytotoksicitet. Brug af AO-farvning og fluorescensmikroskopi, 6 timer forbehandling med 100 eller 250 pM sulindac sulfid, efterfulgt af tilsætning af 2 uM β-lapachon i 12 timer resulterede i et fald i CL1-1 og CL1-5 celledensitet sammenlignet med Hapachon alene (figur 6B), og lignende resultater blev opnået med kombinationen af ​​β-lapachon og enten sulindac eller sulindac sulfon (data ikke vist).

(A) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (højre) blev efterladt ubehandlet eller blev inkuberet med 100 eller 250 pM sulindac, sulindac sulfon eller sulindac sulfid til 6, 12 eller 24 timer, derefter proteinniveauer blev målt ved Western blotting. (B-D) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (højre) blev efterladt ubehandlet (CTL) eller inkuberet med den angivne koncentration af sulindac (B), sulindac sulfon (C), eller sulindac sulfid (D ) i den angivne tid, blev derefter NQO1 aktivitet målt. *: P 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001 sammenlignet med kontrollen

(A) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (. højre) blev efterladt ubehandlet eller blev forbehandlet i 6 timer med den angivne koncentration af sulindac, sulindac sulfon, og sulindac sulfid, derefter 2 pM β-lapachon blev tilsat i 12 timer, derefter celleoverlevelse blev målt ved anvendelse krystalviolet farvning og udtrykt som procent overlevelse sammenlignet med de ubehandlede celler. *: P 0,05 sammenlignet med Hapachon alene. (B) To sæt af hver celletype blev efterladt ubehandlet eller blev inkuberet i 6 timer med 100 eller 250 pM sulindac sulfid, derefter 2 uM B-lapachon blev tilsat til det ene sæt og inkubationen fortsatte i 12 timer, derefter morfologien blev undersøgt ved acridinorange-farvning. Skalaen søjle repræsenterer 100 um.

NQO1 spiller en central rolle i Sulindac-inducerede stigning i β-lapachon cytotoksicitet for Lung Cancer Cells

Selvom NQO1 udtryk og aktivitet blev forøget med sulindac og dets metabolitter, hvorvidt NQO1 var en stor bidragyder til sulindac-inducerede stigning i β-lapachon cytotoksicitet stadig nødvendig efterforskning. To metoder blev anvendt til at inhibere enzymaktiviteten eller protein ekspression af NQO1, en NQO1 inhibitor og NQO1 siRNA knockdown.

dicoumarol tidligere er blevet anvendt til specifikt at inhibere ekspressionen og aktiviteten af ​​NQO1 [44]. Som vist i figur 7, forbehandling af celler med 100 eller 250 pM sulindac (figur 7A), sulindac sulfon (figur 7B), eller sulindac sulfid (figur 7C), efterfulgt af tilsætning af 2 uM β-lapachon i 12 timer forøgede cytotoksiciteten af β-lapachon for både CL1-1 og CL1-5 celler og disse effekter blev væsentligt reduceret ved tilsætning af 10 uM dicoumarol.

CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (højre) blev efterladt ubehandlet eller blev forbehandlet i 6 timer med 100 eller 250 pM sulindac (a), sulindac sulfon (B), eller sulindac sulfid (C) med eller uden 10 pM dicoumarol, derefter inkuberet i yderligere 12 timer med eller uden tilsætning af 2 pM β-lapachon, derefter celleoverlevelse blev målt ved krystalviolet farvning og udtrykt som procent overlevelse sammenlignet med de ubehandlede celler. *: P. 0,05

Brug siRNA knockdown af NQO1, på dag 1 til 3 efter NQO1 siRNA transfektion af CL1-1 og CL1-5 celler, ingen ændring i cellevækst eller cellemorfologi blev bemærket (Figur S6). Effektivitet af knockdown i CL1-1 og CL1-5 celler blev påvist for RNA-ekspression ved hjælp af RT-PCR (figur 8A) og realtime-PCR (figur S7) og for proteinekspression ved western blotting (figur 8B og C), der viser, at NQO1 siRNA nedregulerede NQO1 ekspression betydeligt. Som vist i figur 8D, NQO1 siRNA transfektion inhiberede stigningen i NQO1 enzymaktivitet induceret i CL1-1 celler ved inkubation i 6 eller 24 timer med 100 eller 250 pM sulindac (venstre panel), sulindac sulfon (midterpanelet), eller sulindac væsentligt sulfid (højre panel). Når celler transficeret i 24 timer med siNQO1 eller kontrol siRNA blev forbehandlet i 6 timer med sulindac eller dets metabolitter, derefter cotreated i 12 timer med narkotika plus 2 pM β-lapachon viste procentvise celle overlevelse resultater resultater, transfektion med NQO1 siRNA forårsagede en signifikant fald i cytotoksiciteten af ​​kombinationer af β-lapachon med sulindac (figur 9A), sulindac sulfon (figur 9B), eller sulindac sulfid (figur 9C). Disse resultater viste, at NQO1 spiller en vigtig rolle i stigningen i β-lapachon celledød forårsaget af sulindac eller dets metabolitter. Salg

(A-C) CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (højre) blev transficeret i 1 til 3 dage med kontrol siRNA (CTL) eller siRNA rettet mod NQO1, blev derefter RNA-ekspression målt ved PCR (A) og proteinekspression ved Western blotting (B og C). (D) CL1-1 celler transficeret i 2 dage med kontrol siRNA eller NQO1 siRNA blev inkuberet alene eller med 100 eller 250 pM sulindac, sulindac sulfid, eller sulindac sulfon for 6 eller 24 timer, blev derefter NQO1 aktivitet målt. *: P 0,05, ***: p 0,001 sammenlignet med de identisk behandlede celler transficeret med kontrol siRNA

CL1-1 celler (venstre) eller CL1-5 celler (højre) blev transficeret. med kontrol siRNA (-) eller NQO1 siRNA (+) i 24 timer, derefter blev efterladt ubehandlet eller blev inkuberet i 6 timer med 100 eller 250 pM sulindac (A), sulindac sulfon (B), eller sulindac sulfid (C), derefter