PLoS ONE: Rat N-ERC /Mesothelin som markør for In Vivo Screening af lægemidler mod Pancreas Cancer

Abstrakt

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDA) er en meget dødelig sygdom, som normalt diagnosticeres i et fremskredent stadium. Vi har etableret transgene rotter bærer en muteret K-

ras

gen styres af Cre /loxP aktivering. Dyrene udvikler PDA som er histopatologisk svarende til den i mennesker. Tidligere rapporterede vi, at serumniveauer af N-ERC /mesothelin var signifikant højere i rotter bærer PDA end i kontroller. I den foreliggende undersøgelse at fastslå, om serumniveauer af N-ERC /mesothelin korreleret med tumorstørrelse, målte vi N-ERC /Mesothelin niveauer i rotter, der bærer PDA. Øgede serumniveauer af N-ERC /mesothelin korreleret med øget tumorstørrelse. Dette resultat indikerer en sammenhæng mellem serumniveau af N-ERC /mesothelin og tumorstørrelse. Derefter undersøgte vi virkningen af ​​kemoterapi på serum N-ERC /Mesothelin niveauer. Rotte bugspytkirtelkræftceller blev implanteret subkutant i flanken af ​​NOD-SCID-mus. I musene behandlet med 200 mg /kg gemcitabin, tumorvægt og serumniveau af N-ERC /mesothelin væsentligt blev reduceret sammenlignet med kontroller. Disse resultater tyder på, at serum N-ERC /Mesothelin målinger kan være nyttige til overvågning respons på behandlingen

Henvisning:. Fukamachi K, Iigo M, Hagiwara Y, Shibata K, Futakuchi M, Alexander DB, et al. (2014) Rat N-ERC /Mesothelin som markør for

In Vivo

Screening af lægemidler mod Pancreas Cancer. PLoS ONE 9 (10): e111481. doi: 10,1371 /journal.pone.0111481

Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, USA

Modtaget: Juni 2, 2014, Accepteret: September 25, 2014; Udgivet: 27 oktober 2014

Copyright: © 2014 Fukamachi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af tilpasses og Seamless Teknologioverførsel Program gennem mål-drevne R en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (C) fra Japan Society for fremme af videnskab; en Grant-in-Aid for Forskning i Nagoya City University; Den Aichi Cancer Research Foundation; Programmet til udvikling af den understøttende system til opgradering af uddannelse og forskning fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi; og en Grant-in-Aid for Cancer Research (17S-6, 20S-8) fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Yoshiaki Hagiwara er ansat af Immuno-Biological Laboratories. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. De resterende Forfatterne erklærer nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Introduktion

N-ERC /mesothelin er en 31-kDa protein, der danner det N-terminale fragment af fuldlængde 71 kDa ERC /mesothelin protein og udskilles i blodet af mesotheliom patienter [1] – [3]. Rotten

Erc

(udtrykt i renalcellecarcinom) genet blev identificeret som et stærkt udtrykt gen i renalcellecarcinom af Eker rotte [4], [5]. Den humane homolog af rotte

Erc

er

Mesothelin

/

megakaryocyt forstærkende faktor

(

MPF

) gen [6] – [8]. ERC /mesothelin kommer også til udtryk i æggestok og bugspytkirtel karcinom væv hos mennesker [9] – [12]. N-ERC /mesothelin anses for at være relevant i overvågningen kemoterapeutiske respons hos patienter med lungehindekræft [13], [14].

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDA) bærer den mest dystre prognose af alle solide tumorer [15] . Vi har etableret transgene rotte linjer bærer et menneske H

ras

G12V (Hras250) [16] eller et menneske K

ras

G12V (Kras301, Kras327) [17] onkogen hvori ekspressionen af ​​transgenet reguleres af Cre /loxP-systemet. Målrettet aktivering af transgenet opnås ved injektion af en Cre-rekombinase-bærende adenovirus (AxCANCre) ind i de pancreatiske gange gennem den fælles galdegang. Neoplastiske læsioner i de transgene rotter udviser morfologiske [16], [18] og biologiske [17], [19] – [21] ligheder med dem, der observeres i humane bugspytkirtel læsioner. Vi har tidligere rapporteret, at N-ERC /mesothelin let detekteres i serum fra rotter, der bærer pancreas duktale adenocarcinomer [17]. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi brug af N-ERC /mesothelin som serum markør for evaluering af effektiviteten af ​​kemoterapi.

Materialer og metoder

Dyr

Male K

ras

G12V transgene (Kras301) rotter (Jcl: SD rotte baggrund) blev etableret som tidligere rapporteret [17], [18]. Homozygote rotter blev frembragt ved avl heterozygote hanrotter med heterozygot hunrotter. Homozygote transgene rotter blev identificeret ved semi-kvantitativ PCR og derefter bekræftet ved gentest. Kras301 rotter blev avlet til at opnå levedygtige og fertile homozygot transgene afkom. Fisher344 (F344 /DuCrlCrlj) rotter blev indkøbt fra Charles River Japan, Inc. (Yokohama, Japan). Sprague-Dawley (SD) rotter (Jcl: SD) blev opnået fra CLEA Japan (Tokyo, Japan). SD (Slc: SD) og Wistar (Slc: Wistar /ST) rotter blev opnået fra Japan SLC, Inc. (Hamamatsu, Japan). Rotterne blev holdt i plast bure i et airconditioneret værelse med en 12-timers lys /12-h mørke cyklus. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for dyreforsøg i Nagoya City University Graduate School of Medical Sciences, og godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Nagoya City University Graduate School of Medical Sciences (H21-02, H22M-24) .

Tumor induktion og patologisk undersøgelse

Cre-udtrykkende adenovirusvektorer blev opformeret i HEK293 celler og derefter renset ved hjælp Vivapure Adenopack (VIVASCIENCE, Hannover, Tyskland) som tidligere rapporteret [17]. Pancreas tumorer blev induceret som beskrevet tidligere [16] – [22]. Bugspytkirtlen blev fikseret i 4% paraformaldehyd og bearbejdes til histologisk observation. Anti-rotte C-ERC /mesothelin (306) blev indkøbt fra Immuno-Biological Laboratories (Gunma, Japan), og farvning blev udført som tidligere beskrevet [17].

transplantation af en rotte pancreas cellelinie og behandling med gemcitabin

en bugspytkirtlen carcinom cellelinie (634NOD) blev oprettet fra en pancreas tumor fra en Hras250 rotte [17], [23]. 634NOD tumorceller (2 × 10

6) blev transplanteret subkutant i 6 uger gamle mandlige NOD-SCID-mus (CLEA Japan, Tokyo, Japan). En uge senere, NOD-SCID mus modtog gemcitabin (2 ‘, 2’-difluor deoxycytidin; dFdC) hydrochroride (Eli Lilly Japan K.K., Kobe, Japan) i saltvand fire gange inden for ni dage efter intraperitoneal injektion. Tumorer blev målt ved længden (a) og bredde (b) i mm under anvendelse af skydelære, og tumorvolumener (V) blev beregnet efter forholdet V = ab

2/2, hvor “a” var den længste af de to målinger [24]. Syv uger efter transplantation blev musene aflivet under dyb isofluran anæstesi og tumorerne blev fjernet og vejet, og serum blev opsamlet til analyse af N-ERC /mesothelin.

Serum test

Serumniveauet af rotte N-ERC /mesothelin blev kvantificeret ved ELISA (Code No.27765, Rat N-ERC /mesothelin Assay Kit, IBL, Gunma, Japan) som beskrevet tidligere [25].

Resultater

serum niveau af N-ERC /mesothelin i Kras301 rotter

for at afgøre, om serum niveauet af N-ERC /mesothelin er anderledes i vildtype Jcl: SD rotter og heterozygote og homozygote Kras301 rotter vi analyseret N -ERC /mesothelin niveauer i vildtype Jcl: SD rotter og heterozygote og homozygote Kras301 rotter i en alder af 10 uger: heterozygote rotter F1 blev genereret ved avl homozygote mandlige Kras301 rotter med kvindelige Jcl: SD rotter. Der var ingen signifikant forskel i kropsvægt mellem hanner eller hunner af de forskellige genotyper (data ikke vist). De serumniveauer af N-ERC /mesothelin var signifikant forskellig mellem de tre genotyper (P 0,0001): 28,3 ± 4,0 ng /ml (n = 19) i vildtype Jcl: SD rotter, 51,5 ± 9,2 ng /ml (n = 19) i de heterozygote Kras301 rotter og 77,9 ± 8,2 ng /ml (n = 13) i homozygot Kras301 rotter (figur 1A). Desuden serum niveauet af N-ERC /mesothelin i heterozygote F1 rotter var klart højere end de oprindelige heterozygote rotter [17]

Heterozygot Kras301 rotter blev genereret af avl homozygote Kras301 rotter med vildtype Jcl:. SD rotter . (A) Serum niveauer af N-ERC /mesothelin i vildtype Jcl: SD rotter og heterozygote og homozygote Kras301 rotter. (B) Serum niveauer af N-ERC /mesothelin i mandlige (lukket bar) og kvindelige (åben bar) vildtype Jcl: SD rotter og heterozygote og homozygote Kras301 rotter. *, ** Og #, P. 0,0001 sammenlignet med hinanden

Der var ingen signifikant forskel i serum N-ERC /Mesothelin niveauer mellem mandlige (30,3 ± 4,2 ng /ml, n = 9 ) og kvindelige (26,4 ± 2,8 ng /ml, n = 10) vildtype Jcl: SD rotter. I modsætning hertil var der en signifikant forskel i serumniveauerne af N-ERC /mesothelin mellem mandlige og kvindelige heterozygote Kras301 F1-rotter (hanner, 59,2 ± 8,0 ng /ml, n = 8; kvindelige, 45,9 ± 5,0 ng /ml, n = 11: P 0,0001) og homozygote Kras301 rotter (hanner, 83,4 ± 6,2 ng /ml, n = 6; kvindelige, 73,2 ± 6,7 ng /ml, n = 7: P 0,05) (figur 1B) Salg.

serum niveau af N-ERC /mesothelin i forskellige rotte stammer

for at afgøre, om den genetiske baggrund påvirket serumniveauer af N-ERC /mesothelin, niveauerne af N-ERC /mesothelin i serum var målt i tre forskellige rotte stammer: F344 /DuCrlCrlj, Slc: Wistar /ST, og SLC: SD. Niveauerne af N-ERC /mesothelin var signifikant forskellige mellem rottestammer (P 0,0001) (figur 2A). Niveauerne af N-ERC /mesothelin var 45,0 ± 1,5 (n = 12) i F344 /DuCrlCrlj, 31,4 ± 5,9 (n = 12) i Slc: SD og 19,6 ± 3,0 (n = 12) i SLC: Wistar /ST rotter . Niveauerne af N-ERC /mesothelin var også signifikant forskellig mellem hannerne i de forskellige stammer og hunnerne i de forskellige stammer (figur 2B). I de individuelle stammer, var der ingen signifikant forskel mellem mænd (n = 6) og kvindelige (n = 6) rotter (figur 2B). Desuden var der ingen signifikant forskel mellem Jcl: SD (n = 19) og Slc:. SD (n = 12) rotter Salg

(A) Strain forskelle i serumniveauer af N-ERC /mesothelin. (B) Serumniveauer af N-ERC /mesothelin hos mænd (lukket bar) og kvinder (open bar) for de forskellige rottestammer. *, P 0,0001; **, P 0,005; #, P. 0,0001 sammenlignet med hinanden

Serum niveau af N-ERC /mesothelin korreleret med tumorstørrelse hos rotter

For at bestemme om serumniveauer af N-ERC /mesothelin korreleret med tumorstørrelse, vi analyseret N-ERC /mesothelin niveauer i homozygote Kras301 rotter bærer bugspytkirtlen duktale adenokarcinomer. Voksne mandlige homozygote Kras301 rotter blev aflivet 4 uger efter injektion af rekombinant AxCANCre i pankreasgangen via den fælles galdegang: se Fukamachi et al. 2013 [22] for en detaljeret beskrivelse af AxCANCre-medieret aktivering af Kras onkogen i Kras301 rotter. Mange groft synlige hvidlige tumorknuder blev observeret i hele pancreas i de transgene rotter. Histologisk undersøgelse viste, at disse knuder var adenocarcinomer, som er blevet rapporteret tidligere [16], [17]. Neoplastiske læsioner blev ikke fundet i andre organer. Immunhistokemiske undersøgelser viste højere ekspression af ERC /mesothelin i carcinoma læsioner sammenlignet med omkringliggende normalt væv, som er blevet rapporteret tidligere [17]. Desuden viste, immunhistokemiske undersøgelser ERC /mesothelin blev også positivt udtrykt i pancreas intraepitelialneoplasi (Panin) læsioner (figur 3).

immunfarvning af ERC /mesothelin i PanIN1 (A og B), PanIN2 (C og D) og PDA (E og F) læsioner. A, C, E, H B, D, F, ERC /mesothelin farvning. . Bars = 100 um

En stigning i serum niveauet af N-ERC /mesothelin korreleret med øget tumorstørrelse (R = 0,89665, P 0,0001, n = 14) (figur 4). Dette resultat indikerer en sammenhæng mellem serum niveauet af N-ERC /mesothelin og tumorstørrelse i disse rotter.

serum niveau af N-ERC /mesothelin i homozygote Kras301 rotter bærer bugspytkirtlen duktale carcinomer. Serum niveau af N-ERC /mesothelin korreleret med øget tumor vægt (R = 0,897).

N-ERC /mesothelin som en markør af den kemoterapeutiske effekt af en anti-cancer drug

Vi næste undersøgt, om serum N-ERC /mesothelin niveauer blev påvirket af behandling af pancreas adenocarcinom med det kemoterapeutiske stof gemcitabin. 634NOD celler [17], som blev afledt af en bugspytkirtel duktalt adenokarcinom fra en Hras250 rotte, blev implanteret subkutant i flanken af ​​NOD-SCID mus. Efter 1 uge blev musene administreret gemcitabin (200 mg /kg, i.p.) fire gange inden for ni dage efter intraperitoneal injektion. Fra uge 1 til uge 7 tumorstørrelsen fortsatte med at stige i både kontrol- og gemcitabin behandlede mus (figur 5A). Selv på grund af den store spredning af tumorstørrelser, der ikke var en signifikant forskel i tumorstørrelsen mellem de to grupper, den gennemsnitlige tumorstørrelse var markant mindre i gemcitabin-behandlede mus sammenlignet med kontrolmusene fra uge 3 til uge 7 ( Figur 5A). I slutningen af ​​uge 7 blev musene aflivet, og tumorerne blev fjernet og vejet; tumor vægt i gemcitabin-behandlede mus (0,33 ± 0,26 g, n = 9) blev signifikant reduceret sammenlignet med kontrolmusene (1,60 ± 1,37 g, n = 10) (P 0,05) (figur 5B). Der var ingen morfologisk forskel mellem tumorer fra gemcitabin-behandlede og kontrolmus (data ikke vist). I slutningen af ​​uge 7, serumniveauet af N-ERC /mesothelin var signifikant nedsat (P 0,01) i mus behandlet med gemcitabin (22,4 ± 22,6 ng /ml, n = 9) sammenlignet med kontrolmusene (123,7 ± 100,6 ng /ml, n = 10) (figur 5C). I modsætning hertil hverken tumorvægt eller serumniveauer af N-ERC /mesothelin var signifikant forskellige fra kontrollen (n = 10) hos mus behandlet med 75 (n = 10) eller 150 (n = 9) mg /kg gemcitabin (figur S1 ). Selv på grund af den store spredning af tumor størrelser og N-ERC /Mesothelin niveauer, der var ikke en signifikant forskel i tumorstørrelse eller N-ERC /Mesothelin niveauer mellem mus behandlet med 75 eller 150 mg /kg gemcitabin og kontrol mus, gennemsnittet af begge værdier var mindre i de gemcitabin behandlede mus sammenlignet med kontrolmus. Således er niveauet af serum N-ERC /mesothelin korrelerede godt med effekten af ​​gemcitabin (R = 0,96597, P 0,0001). (Figur 5D)

Rat bugspytkirtel kræftceller (634NOD celler) blev implanteret subkutant i flanken af ​​NOD-SCID mus. Efter 1 uge blev musene administreret gemcitabin (0 eller 200 mg /kg, i.p.) fire gange inden for ni dage efter intraperitoneal injektion. (A) Periodisk observation af tumorer i NOD-SCID mus behandlet med gemcitabin (0 mg /kg, åbne cirkler; 200 mg /kg, udfyldte cirkler). (B) Den tumorvægt og (C) serumniveau af N-ERC /mesothelin blev signifikant reduceret ved behandling med gemcitabin (200 mg /kg, udfyldte cirkler) sammenlignet med kontrol (åbne cirkler) (P 0,05, P 0,01 henholdsvis ). (D) Korrelation af tumor vægt og serumniveauer af N-ERC /mesothelin. Serumniveauet af N-ERC /mesothelin korreleret med tumorvægt og gemcitabin (R = 0,966). Åbne cirkler, 0 mg /kg; lukkede cirkler, 200 mg /kg.

Diskussion

Vi har tidligere rapporteret, at serum niveauet af N-ERC /mesothelin korreleret med tumorstørrelse i mus med transplanteret rotte pancreas kræftceller (634NOD celler) [17]. I den foreliggende undersøgelse, efter aftale med vores tidligere rapport, serum niveauet af N-ERC /mesothelin korreleret med bugspytkirtlen tumorstørrelse hos rotter (figur 4). Disse resultater viste, at relativ pancreas tumorstørrelse kan estimeres ud fra serumniveau af N-ERC /mesothelin uden at ofre dyrene. Vi viste ligeledes, at N-ERC /mesothelin i serum var en biomarkør, som kan anvendes til monitorering af respons på kemoterapi. Når mus med tumorer afledt fra transplanterede 634NOD celler blev behandlet med gemcitabin, tumorvægt og niveauet af N-ERC /mesothelin i serummet blev formindsket sammenlignet med kontrollen. Serumniveauet af N-ERC /mesothelin forbundet med den terapeutiske virkning af anti-cancer lægemiddel (figur 5). Derfor kan N-ERC /mesothelin anvendes til kvantitativ analyse af den terapeutiske virkning af anticancermidler på pancreas cancer i dyremodeller anvendt i denne undersøgelse.

serumniveau af N-ERC /mesothelin i homozygote Kras301 rotter var signifikant højere end for rotter vildtype. Serumniveauet af N-ERC /mesothelin i heterozygot F1 af homozygote rotter var også signifikant højere end hos rotter vildtype. Imidlertid serumniveau N-ERC /mesothelin i de oprindelige heterozygotiske rotter ikke var forskellige fra vildtype Jcl: SD rotter [17]. De homozygote Kras301 rotter blev opretholdt ved avl homozygot mandlige og homozygote hunrotter. Det er sandsynligt, at rotter med høje niveauer af N-ERC /mesothelin uheld blev udvalgt i løbet af fastsættelse af homozygote Kras301 rotter.

serum niveau af N-ERC /mesothelin var signifikant forskellig blandt rotte stammer (F344 /DuCrlCrlj, Slc: SD og Slc: Wistar /ST). Disse resultater antyder, at den genetiske baggrund af forskellige rottestammer påvirker det basale niveau af serum N-ERC /mesothelin. Derfor til evaluering af kemoterapeutiske reaktioner ved hjælp serum N-ERC /mesothelin, er det vigtigt at bruge passende kontroller.

N-ERC /mesothelin blev påvist i supernatanterne af dyrkede humane bugspytkirtel kræftceller og korreleret med ekspressionsniveauer af ERC /mesothelin [26]. ERC /mesothelin er ofte udtrykt i duktalt carcinom, men ikke i normal pancreas [11], [26] – [28]. Således kan ERC /mesothelin udtryk findes i både humane og rotte bugspytkirtel duktalt adenocarcinom. Men i modsætning til forventningerne, var der ingen signifikant forskel i serum N-ERC /Mesothelin fusioner og patienter bugspytkirtlen kræft og raske kontrolgrupper [26]. Derfor, mens N-ERC /mesothelin kan bruges som et serum biomarkør for pancreas duktalt carcinom i dyremodeller anvendes i den foreliggende undersøgelse, er det ikke egnet til mennesker.

I øjeblikket er der ingen effektiv lægemiddel mod bugspytkirtel kræft; Derfor er brugen af ​​dyremodeller for at teste reaktionsevne bugspytkirtelkræft på terapi er af allerstørste vigtighed. Anvendelsen af ​​rotte N-ERC /mesothelin som serummarkør ligger i dens evne til at skelne mellem rotter med eller uden pancreas cancer uden at åbne bughulen. Gemcitabin er generelt anses for at udgøre first-line behandling for kræft i bugspytkirtlen. Den maksimalt tolererede dosis af gemcitabin hos rotter var 50 mg /kg en gang om ugen. Denne dosis havde ingen virkning på tumorstørrelse i Kras301 rotter. Derfor blev serum niveauet af N-ERC /mesothelin ikke signifikant påvirket i disse dyr (vores upublicerede resultater). Især i mus behandlet med gemcitabin, niveauer af gemcitabin, der ikke signifikant påvirker tumorstørrelse påvirkede ikke serum niveauet af N-ERC /mesothelin (Figur S1). Mens gemcitabin alene viser ikke anti-cancer effekter på endogent udviklet bugspytkirtel kræft i rotter (vores ikke offentliggjorte resultat), eller i musemodeller [29], resultaterne præsenteres her demonstrere anvendeligheden af ​​N-ERC /mesothelin som serum markør i overvågning præklinisk forsøg for terapi i mus og rotter modeller af bugspytkirtlen duktalt adenokarcinom: serodiagnose i dyremodeller kan bruges til at forbedre screening for kandidat kemoterapeutiske stoffer, der kunne evalueres til human brug

Støtte oplysninger

figur S1..

Virkning af gemcitabin i NOD-SCID mus med transplanterede 634NOD celler. Tumoren vægt og serum niveau af N-ERC /mesothelin blev ikke reduceret ved behandling med 100 eller 150 mg /kg gemcitabin

doi:. 10,1371 /journal.pone.0111481.s001

(TIFF)