PLoS ONE: Persistens af EBV Antigen-specifikke CD8 T-celle Clonotypes under homeostatiske immunrekonstitution i Cancer Patients

Abstrakt

Vedvarende virus holdes i skak af specifikke lymfocytter. Den klonale T-cellereceptor (TCR) repertoire mod Epstein-Barr virus (EBV), når det er oprettet efter primær infektion, udviser en robust stabilitet over tid. Imidlertid er determinanterne bidrager til denne langvarig persistens stadig dårligt karakteriseret. Drage fordel af en

in vivo

kliniske omgivelser, hvor lymfocyt homeostase blev forbigående forstyrres, vi studerede EBV antigen-specifikke CD8 T-celler før og efter ikke-myeloablativ lymfo-nedbrydende kemoterapi af melanom patienter. Trods mere avancerede T-celle differentiering, viste patienter T-celler klonal sammensætning sammenlignes med raske personer, der deler en præference for

TRBV20

og

TRBV29

gen-segment brug og flere co-dominant offentlige TCR clonotypes. Desuden afslørede vore data tilstedeværelsen af ​​relativt få dominerende EBV antigenspecifikke T-celle clonotypes, som hovedsagelig bestod efter transient lymfo-depletion (TLD) og lymfocyt nyttiggørelse, sandsynligvis relateret til fravær af EBV-reaktivering og

de novo

T-celle-priming hos disse patienter. Interessant, vedvarende clonotypes ofte co-udtrykte hukommelse /homing-associerede gener (

CD27

,

IL7R

,

EOMES, CD62L /SELL

CCR5

) støtter opfattelsen af, at de er særlig vigtige for langvarige CD8 T-cellereaktioner. Ikke desto mindre blev den klonale sammensætning EBV-specifikke CD8-T-celler konserveret over tid med tilstedeværelsen af ​​de samme dominerende clonotypes efter ikke-myeloablativ kemoterapi. Den observerede clonotype vedholdenhed demonstrerer høj robusthed CD8 T-celle homeostase og rekonstituering

Henvisning:. Iancu EM, Gannon PO, Laurent J, Gupta B, Romero P, MICHIELIN O, et al. (2013) Persistens af EBV Antigen-specifikke CD8 T-celle Clonotypes under homeostatiske immunrekonstitution i kræftpatienter. PLoS ONE 8 (10): e78686. doi: 10,1371 /journal.pone.0078686

Redaktør: Derya Unutmaz, New York University, USA

Modtaget: August 1, 2013; Accepteret: September 15, 2013; Udgivet: 25 oktober 2013

Copyright: © 2013 Iancu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse var sponsoreret og støttet af den schweiziske National center for kompetence i forskning (NCCR) Molekylær Onkologi og den schweiziske National Science Foundation giver 32003B0-118123 og 310.030-129.670. P. O. Gannon er også modtager af et stipendium fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR-IRSC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Primær Epstein-Barr virus (EBV) -infektion er associeret med massiv viral replikation. På trods af genereringen af ​​et specifikt immunrespons robust T-celle, EBV etablerer en latent infektion i B-celler [1]. Ikke desto mindre sunde EBV-inficerede individer forbliver asymptomatisk i hele deres levetid på grund af viral inddæmning af antigen-specifikke memory CD8 T-lymfocytter [1-3]. Som stigende opmærksomhed er afsat til at optimere strategier terapeutiske vaccination mod kræft, immun kontrol af kronisk EBV infektion repræsenterer en interessant modelsystem til at studere de mekanismer, der er involveret i frembringelsen og vedligeholdelse af livslang beskyttende immunrespons.

antigen-primede CD8 T-celle pool er meget heterogen og består T celle subpopulationer med varierende grader af cellulær differentiering baseret på deres fænotype, funktion og anatomiske placering, og dermed gøre sondringen mellem “effektor” og “memory” cytolytiske T-celler udfordrende [4- 6]. Generelt memory-lignende T-celler vise langsigtede overlevelse og selvfornyelse evner, høj proliferativ potentiale, og kapaciteten til hurtigt og effektivt at producere effektorceller som respons på antigen re-møde [7-9]. I modsætning hertil effektor T-celler har kapacitet til at migrere til inflammationsstedet, at dræbe antigen-bærende målceller og udskiller forskellige cytokiner (f.eks IFNy, TNFa) [10].

Om hukommelse cellereaktioner opretholdes i længere perioder eller periodisk “ny” forbliver et spørgsmål om debat. Det er et særligt vanskeligt spørgsmål at tage fat i mennesker, da det kræver en grundig analyse af beskyttende immunrespons end længere tid. I denne henseende T-cellereceptoren (TCR) er en fremragende markør, der tillader antigenspecifikke responser, der skal følges langs T-celledifferentiering og over tid [11]. Grundige analyser af både virale og tumor antigen-specifikke CD8 T-cellereaktioner har afsløret, at det antigen-specifikke T-celle-repertoire generelt er sammensat af højt hyppige (også defineret som dominant) samt mindre hyppig (defineret som ikke-dominerende) T-celle clonotypes [12,13]. Gennem en proces kendt som TCR clonotype udvælgelse kan visse clonotypes blive mere dominerende langs T-celledifferentiering [14-16] eller hele tidsforløbet af infektion [17]. Persistens af humane virus-specifik T-celle clonotypes over flere år er blevet påvist i mennesker med forskellige virusinfektioner: influenza [18], herpes simplex virus [19,20], EBV [21], cytomegalovirus (CMV) [14] og human immundefektvirus (HIV) [22]. For nylig, Klarenbeek og kolleger [23] behandlet spørgsmålet om, hvorvidt den klonale repertoire, der er etableret i den tidlige fase af infektioner mod CMV og EBV opretholdes i længere tid ad gangen. De fandt, at immunrespons var meget stabil, og når det er oprettet udviklede sig ikke i løbet af 5-års opfølgning [23]. Mens herpes virus-specifikke T-cellereaktioner afslørede en hidtil uset stabilitet af TCR clonotype repertoire over tid efter primær infektion, er mindre kendt om deres persistens under betingelserne for immunologisk stress hos asymptomatiske bærere.

I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgt robustheden af ​​de EBV antigen-specifikke reaktioner i en

in vivo

omgivelser, hvor balancen mellem virus og immunforsvar kan være kompromitteret midlertidigt efter forbigående lymfo-depletion (TLD). Konkret har vi vurderet EBV-antigen-specifikke CD8 T-celle clonotype sammensætning og persistens i melanom patienter, der blev behandlet med ikke-myeloablativ kemoterapi efterfulgt af adoptiv celleoverførsel (ACT) af autologe perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) [24,25 ]. Til kvantitative vurderinger virus-specifik T-celle-responser, direkte

ex vivo

klontypisk analyser kombineres til genekspressionsprofilering af individuelle antigenspecifikke T-celler blev udført [13]. De antivirale T celle responser i patienter var mere differentieret sammenlignet med raske individer, der omfatter både hukommelse og effektor CD8 T-celler. Dominerende TCR beta-kæde clonotypes, herunder flere offentlige TCR-sekvenser, viste sig at fortsætte med tiden hos raske personer og efter TLD og ACT blandt patienter. Vi studerede derefter T-celle clonotypes med svingende frekvenser efter TLD og immunrekonstitution, og bemærkede, at clonotypes med øget frekvens foretaget en polyfunktionel hukommelse /målsøgende genekspressionsprofil (

CD27

,

IL7R

,

EOMES, CD62L /SELL

CCR5

). Sammenlagt vores data tyder på, at EBV-specifikke T-celle repertoiret fortsætter ikke kun under steady-state betingelser, men også i løbet af forbigående immunologiske forstyrrelser.

Materialer og metoder

Etik erklæring

de kliniske studier er designet og udført i overensstemmelse med de relevante standarder, og godkendt af (i) den etiske kommission ved universitetet i Lausanne, (ii) LICR protokollen Review Committee, og (iii) den schweiziske nationale tilsynsmyndighed (Swissmedic ). De er blevet registreret i de kliniske NCI forsøg under nummer NCT00324623 og EU20607 (www.clinicaltrials.gov). Alle blodprøver fra patienter blev indsamlet efter skriftlig informeret samtykke. Perifere blodprøver fra fire EBV-positive sunde donorer BCI3, BCL4, BCL7 og BCL8, i alderen mellem 25 og 45 år, blev indsamlet på to tidspunkter, i årene 2002 og 2006, og alle donorer gav skriftligt informeret samtykke.

melanom patienter og behandling

Blodprøver fra fem EBV-positive melanom patienter i alderen 39 til 75 år, indskrevet i fase i kliniske forsøg på Onkologisk afdeling i Lausanne Universitetshospital (Schweiz) , blev taget på forskellige tidspunkter før og efter behandling. Efter opsamling af PBMC’er ved leukaferese (Leuka) fik patienterne ikke-myeloablativ kemoterapi bestående af enten busulfan på 2 mg /kg (patienter LAU 618 og LAU 672) eller cyclophosphamid (CTX) på 30 mg /kg (LAU 1144 og første runde for LAU 1013) eller 60 mg /kg (LAU 936 og anden runde for LAU 1013) i to dage og fludarabin ved 30 mg /m

2 til 3 dage [24,25]. Tre dage efter den sidste injektion af fludarabin blev autologe PBMC’er reinfunderes og peptid vaccination med Melan-analog peptid emulgeret i ufuldstændig Freunds adjuvans blev givet subkutant som tidligere beskrevet [24]. Patient LAU 1144 modtog også et opløseligt LAG-3-protein som adjuvans. Salg

antistoffer mod EBV i melanom patienter

Plasma prøver blev taget fra alle patienter på flere tidspunkter før og efter lymfo-nedbrydende behandling og analyseret for ændringer i antistofniveauer kendt for at være forbundet med en tilstand af EBV reaktivering. Specifikt sammenlignede vi plasmaniveauer antistoffer mod tre EBV udtrykte proteiner: EBNA-IgG (Epstein-Barr nukleært antigen), EA-IgG (Early Antigen), VCA-IgG og IgM (Viral capsid antigen). EBV-specifikke antistoffer blev analyseret under anvendelse af Athena Multi-Lyte EBV testsystem (Zeus videnskabelige, Sommerville, NJ, USA) på en Luminex 200 læser ifølge producentens instruktioner. Resultaterne blev udtrykt som arbitrære enheder.

Cell forberedelse og flowcytometri

PBMC’er blev opnået ved densitetscentrifugering hjælp Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Sverige). CD8 T-lymfocytter var positivt beriget fra kryopræserverede PBMC’er under anvendelse af anti-CD8-belagte magnetiske mikroperler (Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach, Tyskland). PE-mærket HLA-A * 0201 /peptid multimerer blev fremstillet som beskrevet tidligere [26] med HLA-A2 begrænset epitop GLCTLVAML (benævnt som A2 /GLC) afledt af EBV lytiske protein BMFL1. Celler blev først farvet med PE-mærkede multimerer i 1 time ved stuetemperatur (RT) i PBS, 0,2% BSA, 50 uM EDTA, og derefter med passende antistoffer (20 min ved 4 ° C). Celler blev enten direkte analyseret (LSR-II flowcytometer, BD Biosciences, San Diego, CA) eller sorteres i definerede populationer under anvendelse af en FACSVantage SE maskine (BD Biosciences). Følgende monoklonale Abs blev købt fra BD Biosciences eller BD PharMingen; anti-CD28-FITC, anti-CD8-allophycocyanin /Cy7, anti-CCR7 rotte IgG mAB, gede-anti-rotte-IgG-allophycocyanin, og CD3-AmCyan-A. Anti-CD45RA-PE-Texas Red mAb blev købt fra Beckman Coulter (Marseille, Frankrig).

Generation af T-celle kloner og kultur

HLA-A2 /multimer

+ CD8

+ T-celle delmængder blev defineret som effektor-hukommelse (EM) CCR7

-CD45RA

-CD28

+ (EM28

pos), CCR7

-CD45RA

-CD28

– (EM28

neg) og effektor CCR7

-CD45RA

+ CD28

– (EMRA), og blev sorteret ved flowcytometri direkte

ex vivo

(figur S1) . Sorterede celler blev klonet ved begrænsende fortynding og ekspanderet i RPMI 1640-medium suppleret med 8% human serum (HS), 150 U /ml rekombinant human IL-2 (rhIL-2; en gave fra GlaxoSmithKline), 1 mikrogram /ml phytohæmagglutinin (PHA ; Sodiag, Losone, Schweiz) og 1×10

6 /ml bestrålet allogene PBMC’er (3’000 rad) som feeder-celler. A2 /multimer

+ T-cellekloner blev ekspanderet ved periodiske (hver 15. dag) restimulering i 24-brønds plader med PHA, bestrålede feeder-celler og hrlL-2.

Direkte ex vivo celle sortering, cDNA forstærkning og enkelt celle gen-specifikke PCR

Enkelt eller fem-celle portioner blev sorteret direkte

ex vivo

fra T-celle delmængder af interesse og cDNA forberedelse og global cDNA-amplifikation udført som tidligere beskrevet [27,28]. Gene underskrift individuelle T-celle blev identificeret ved genspecifikke PCR’er som beskrevet [28] og PCR-produkter visualiseret efter elektroforese på en 2,5% agarosegel. Vi brugte følgende primere:

GAPDH

: 5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 ‘; rev-5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 ‘,

beta2 mikroglobulin

: 5′-CCAGCAGAGAATGGAAA GTC-3′; rev-5′-GATGCTGCTTACATGTCTCG-3 ‘,

CCR7

: 5′-CCAGGCCTTATCTCC AAGACC-3′; rev-5′-GCATGTCATCCCCACTCTG-3 ‘,

CD27

: 5′-ACGTGACAGAGTGCC TTTTCG-3′; rev-5′-TTTGCCCGTCTTGTAGCATG-3 ‘,

IL7R

(IL-7RA /CD127): 5′-ATC TTGGCCTGTGTGTTATGG-3′; REV-5′-ATTCTTCTAGTTGCTGAGGAAACG-3 ‘;

EOMES

(eomesodermin): 5′-AGCAGGCTGTGAACATTGG-3 ‘; rev-5’-TTGACTCCTGGG CCTAGTATC-3 ‘,

CCR5

: 5-TCAGCAGGAAGCAACGAAGG-3′; rev-5′-TCTTTGACTTG GCCCAGAGG-3 ‘,

KLRD1

(CD94): 5′-GTGGGAGAATGGCTCTG CAC-3′; rev-5′-TGAGCTGTTGCTTACAGATATAACGA-3 ‘,

IFNg

(IFN): 5′-GCCAAC CTAAGCAAGATCCCA-3′; rev-5′-GGAAGCACCAGGCATGAAATC-3 ‘,

PRF1

(Perforin): 5′-TTCACTGCCACGGATGCCTAT-3′; rev-5′-GCGGAATTTTAGGTGGCCA-3 ‘,

GZMB

(Granzyme B): 5′-GCAGGAAGATCGAAAGTGCGA-3′; rev-5′-GCATGCCAT TGTTTCGTCCAT-3 ‘,

SELL

(CD62L): 5′-CCGTCTGTGAATTGGACCAT-3′; rev-5′-AAC AGCAAAACCCCCAAACT-3 ‘.

TCR spectratyping, sekventering og TCR clonotyping

TCR spectratyping [14] blev brugt til at identificere alle TCR clonotypes, som blev klassificeret i henhold til Immunogenetics (IMGT) nomenklatur foreslået af Lefranc og kolleger (http : //imgt.org/) [29]. Til hurtigt at identificere TRBV segment brug, cDNA-pools af EBV-antigen-specifikke CD8-T-celler blev indledningsvis underkastet individuelle PCR under anvendelse af et sæt af allerede validerede fluorescensmærkede fremad primere specifik for 22 TCR

BV

underfamilier og en umærket reverse primer specifik for den konstante region af beta-kæden af ​​TCR [30]. Dette TRBV-CDR3 spectratyping analyse repræsenterer en prescreening trin, der tillader sparer tid og reagenser (data ikke vist). Når positive TRBV underfamilier blev identificeret, individuel cDNA prøver genereret fra enten

ex vivo

sorterede enkelt celleprøver (n = 477) og 5-celleprøver (der repræsenterer svarende til 300 til 450 EBV-specifikke CD8 T-celler pr rask donor eller melanompatient) eller fra

in vitro Salg genererede T-cellekloner (raske donorer, n = 530 kloner, melanompatienter, n = 779 kloner) blev underkastet TRBV-specifikke PCR’er. Separation og påvisning af amplificerede PCR-fragmenter, der indeholdt hele CDR3 segmentet blev udført i nærvær af fluorescerende størrelsesmarkører på en ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (AppliedBiosystems /Life Technologies Corporation, Zug, Schweiz) og data blev analyseret med GeneScan 3.7.1 ( AppliedBiosystems). I det sidste trin blev PCR produkter af interesse direkte oprenset og sekventeret med reverse primer (Fasteris SA, Geneve, Schweiz). Størstedelen af ​​PCR-produkter blev sekventeret, men i flere dominerende TCR clonotypes (n = 8 for HD, n = 10 for patienter), unikke primere svarende til

CDR3

gensegment blev udformet og anvendt til clonotyping PCR’er som tidligere beskrevet [15]. Alle

ex vivo

enkelt celle, 5-celle, og

in vitro

genererede T-celleklon cDNA prøver fra raske donorer og melanompatienter blev forarbejdet på samme stringens.

statistiske analyser

Som anført i hele teksten, blev Kruskal-Wallis ikke-parametrisk, envejs ANOVA og Spearman s korrelationer udført med Prism 5.0 (La Jolla, Californien, USA) og

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Co-ekspression lagkagediagrammer blev sammenlignet med hinanden ved hjælp af 10’000 permutationer beregnet med Softwaren SPICE 5,2 (NIH, Bethesda, USA).

Resultater

Forbedret effektor celle differentiering af EBV antigen-specifikke CD8 T-celler efter forbigående lymfo-udtømning og immunrekonstitution

Seneste immunterapi forsøg har vist, at lymfo-udtømning fremkaldt af ikke-myeloablativ kemoterapi stillede efterfølgende udvidelse af adoptivt overførte T-celler ved homeostatiske mekanismer ([31] Figur 1A). For yderligere at forfine denne strategi, havde vi tidligere analyseret effekten af ​​tre forskellige ikke-myeloablative condition kemoterapi på lymfo-udtømning og rekonstituering i melanom patienter [24,25]. De tre kemoterapeutiske regimer inducerede betydelig forbigående udtynding af lymfocytter, efterfulgt af effektiv inddrivelse af total lymfocyt [24,25] og CD8 T-celle (figur 1B, venstre panel) tæller til normale niveauer fire uger efter adoptiv celle transfer (post-ACT).

A. Skematisk fremstilling af ikke-myeloablating lymfo-nedbrydende behandling efterfulgt af ACT af PBMC’er for melanom patienter. Blodprøver blev analyseret for alle patienter på leukaferese tid-point (Leuka) før TLD kemoterapi og post-ACT (tid-punkt T1), hvilket svarede til dag 32 (patient LAU 1144), dag 45 (LAU 1013) eller dag 60 (LAU 618, LAU 936, og LAU 672). B. Venstre panel; totale tællinger af CD8 T-celler fra fem melanom patienter på Leuka og post-ACT. Right panel; fænotype af totale CD8 T-celler, der viser andelen af ​​tidlige-opdelte (EM28

pos; CCR7

negCD45RA

negCD28

POS) og sen-opdelte (bestående af EM28

neg; CCR7

negCD45RA

negCD28

neg og EMRA; CCR7

negCD45RA

posCD28

neg) delmængder fra fire raske donorer (HDS) og fra fem melanom patienter på Leuka og post-ACT. C. Venstre panel; totale tællinger af EBV-specifikke CD8-T-celler i perifert blod fra fem melanompatienter på Leuka og post-ACT tidspunkter. Right panel; fænotype af EBV-specifikke CD8 T-celler, der viser andelen af ​​tidlige-opdelte (EM28

pos; CCR7

negCD45RA

negCD28

POS) og sen-opdelte (bestående af EM28

neg; CCR7

negCD45RA

negCD28

neg og EMRA; CCR7

negCD45RA

posCD28

neg) delmængder fra fire raske donorer og fra fem melanom patienter på Leuka og post-ACT. D. EBV-specifikke antistof niveauer, der måles i plasmaprøver fra fem melanom patienter på forskellige tidspunkter før og efter lymfo-nedbrydende behandling. Dag 0 på x-aksen repræsenterer dagen for ACT. Resultaterne er repræsenteret som arbitrære enheder på et relativt indeks skala. Plasma-niveau evolution vises separat for hver anti-EBV antistof (anti-VCA IgM og IgG, anti-EBNA IgG og anti-EA IgG), og den grå bjælke repræsenterer cut-off mellem negative og positive status for hver markør.

Vi analyserede derefter de specifikke for EBV lytiske protein BMFL1 fra fem patienter med stadie IV melanom før og efter TLD (figur S1) og fra fire raske donorer CD8 T-celler. Den samlede andel af EBV antigen-specifikke T-celler før og efter behandling forblev uændret (figur 1C, venstre panel;

P

= 0,625, Kruskal-Wallis). I forhold til raske personer, BMFL1-specifikke CD8 T-celler fra melanom patienter viste mere avanceret effektor celledifferentiering med øgede procentdele af EM28

neg (defineret som CCR7

negCD45RA

negCD28

neg) og EMRA ( defineret som CCR7

negCD45RA

posCD28

neg) delmængder allerede før behandling (dvs. på tidspunktet for leukaferese) (figur 1C, højre panel). Disse delmængder steg yderligere og blev dominerende post-ACT. Hos raske donorer er en sådan avanceret effektor celledifferentiering typisk ikke observeret inden for EBV-specifikke CD8 T-celler, der ligner mere til CMV-specifikke T-celle responser [14,32]. Til en svagere grad, blev avanceret effektor celledifferentiering også observeret i den totale CD8 T-celle pool (figur 1B højre panel), hvilket antyder, at de foregående historier på tumorudvikling og modtagne behandlinger, såsom kemoterapi og immunterapi, kan have påvirket CD8 T cellekammer.

Forbigående lymfo-depletion resulterer ikke i EBV reaktivering

for at undersøge evnen af ​​EBV-antigen-specifikke CD8 T-celle respons til at styre viral aktivitet under situationer med formindsket immun kontrol, vi afgjort, om ikke-myeloablativ kemoterapi kunne have resulteret i EBV reaktivering. Plasma-antistofniveauer for viral capsid antigen (VCA) IgG og IgM, Epstein-Barr nukleært antigen (EBNA) IgG og tidlig antigen (EA) IgG blev målt før og efter TLD og ACT behandlinger (figur 1D) [33]. EBV-specifikke antistoffer forblev stabile i adskillige måneder efter behandling hos alle patienter. Dette er i overensstemmelse med en latent EBV infektion uden viral reaktivering, selv om sidstnævnte ikke helt kan udelukkes. EBV DNA-kopier per million PBMC’er var under niveauet for påvisning af real-time PCR-reaktion i blodprøver før og efter TLD (data ikke vist).

Ex vivo EBV-antigen-specifikke CD8 T-celle-repertoiret efter forbigående lymfo-udtømning afslører clonotype vedholdenhed trods frekvens udsving

Vi har tidligere udviklet en strategi for global cDNA forstærkning på 5-celleniveau egnet til direkte

ex vivo

vurdering af individuelle TCR BV-CDR3beta (TRBV) gen-segment forbrug [14,34]. Kort fortalt blev cDNA-pools af EBV epitop-specifikke CD8-T-celler oprindeligt frembragt og anvendt som en screening for tilbagevendende TRBV familier. Efterfølgende blev dominans af hver TRBV familie bestemt ved at teste hver enkelt 5-celleprøve, omfattende puljen for de positive TRBV familier, og som repræsenterer hvad der svarer til 300 til 450 virus-specifikke CD8 T-celler pr person. De amplificerede TRBV-CDR3-JB gen-segmenter blev til sidst sekventeret eller PCR-clonotyped at identificere den unikke TCR signatur af hver T-celle clonotype, som beskrevet i Materialer og Metoder. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, vi oprindeligt sammenlignet TCR clonotype repertoire af direkte

ex vivo

sorteres 5-celle af EBV-specifikke T-celler med den for single T-celler genereret af

in vitro Salg begrænsende fortyndingskulturer . Sammenlignelige proportioner af individuelle TCR clonotype underskrifter blev fundet ved brug af

ex vivo

sorteres 5-celle og

in vitro

T-celle kloning tilgange (Figur S2A), i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [14 , 15,28]. Desuden individuelt gennemført

ex vivo

sortering eksperimenter på enkelte virus antigenspecifikke T-celler, afslørede tilsvarende relative hyppigheder af dominerende T-celle-clonotypes (Figur S2B). Tilsammen indikerer disse resultater, at vores direkte

ex vivo

tilgang giver høj opløsning molekylær karakterisering af clonotype repertoire

in vivo

i veldefinerede antigen-specifikke subpopulationer.

Vi næste bestemmes den vedvarende EBV BMFL1-specifikke T-celle clonotypes i raske personer over tid. Hovedparten af ​​clonotypes var til stede på både tidlige og sene tidspunkter (figur 2A). Desuden viste en korrelation en statistisk signifikant sammenhæng mellem hyppigheden af ​​clonotypes detekteret over en periode på 4 år (figur 2B, Rho = 0,739,

P

0,001, Spearman korrelation). Vi kunne observere fremkomsten af ​​nye clonotypes over tid, men disse nyligt fundne clonotypes var af lave frekvenser (

5%) (Figur 2B). Tilsammen udgør disse resultater er i overensstemmelse med dem, der tidligere er rapporteret af vores gruppe [14] og andre [23], og viser, at når de er etableret i raske voksne, den klonal sammensætning under kronisk herpes virus infektion holdes stabilt i mindst flere år.

A og C. TRBV clonotype sammensætning af EBV-specifikke CD8 T-celler i PBMC’er fra to raske donorer (A) ved tidligt (2002) og sene (2006) tidspunkter, og i PBMC’er fra fire melanom patienter ( C) ved Leuka tid-point og post-ACT. Hver clonotype repræsenteres af dens specifikke TRBV familie og dens kodenummer (clono). Clonotype frekvenser beregnes ved tilstedeværelsen af ​​hver klonotypisk sekvens blandt individuelle 5-celleprøver (raske donorer, n = 142; melanom patienter, n = 344) sorteres direkte

ex

vivo

. Notatet frekvenser kun fra enten nye “stigende” eller “faldende” clonotypes er afbildet. B og D. Korrelation af de enkelte clonotype frekvenser opnået fra

ex

vivo

sorteres 5-celleprøver (B) mellem blodprøver på tidlige (2002) og sene (2006) tidspunkter fra to raske donorer og (D) mellem Leuka og post-ACT fra fem melanom patienter (Spearman korrelation). Mellemværker viser sammenhængen mellem TCR clonotypes med frekvenser under 10% for raske donorer og 20% ​​for patienter.

Vi vurderede yderligere EBV-antigen-specifikke TCR repertoire i fem melanom patienter til at bestemme inddrivelse potentiale dominerende T-celle clonotypes efter TLD og ACT (Figur 2C). I lighed med de raske donorer, den samlede TCR repertoire varet efter TLD og ACT med det store flertal af clonotypes være påviselig før og efter behandling (Figur 2C). Undtagen patient LAU 936, de clonotypes der enten forsvundet eller syntes var af lav frekvens ( 5%), som kan være relateret til følsomheden af ​​den teknik mere end det faktiske udseende eller forsvinden af ​​et specifikt clonotype. Ikke desto mindre fandt vi mere udtalt udsving i frekvenserne af de påviselige clonotypes blandt patienter sammenlignet med raske donorer, som var især tydeligt for clonotypes med frekvenser 20% (figur 2D). Tilsammen vores data viser, at den klonale sammensætning EBV-specifikke CD8-T-celler globalt blev opretholdt i melanom patienter, der gennemgår TLD og efterfulgt af immunrekonstitution, uanset udsving i frekvenser inden for specifikke patienter og clonotypes detekterbare ved lavere frekvenser.

EBV antigen-specifikke clonotypes bærer offentlige TRBV sekvenser er ofte delt mellem raske donorer og melanom patienter

En større lighed for EBV epitop-specifikke CD8 T-celler mellem raske voksne og patienter var den foretrukne

in vivo

udvælgelse af dominerende clonotypes med TRBV kæder tilhører den

TRBV14

,

TRBV20

og

TRBV29

familier (figur 2). Vi identificerede også mindst fjorten offentlige TRBV sekvenser, med to CDR3 motiver RDxTGNGY og VGxGGTNEKL, som blev overrepræsenteret og deles i raske personer og melanom patienter (figur 3A). Offentlige clonotypes defineres ved tilstedeværelsen af ​​den samme identiske TRBV-CDR3-BJ sekvens fundet i mindst to ubeslægtede individer. I tråd med tidligere rapporter [35], flere af de offentlige TRBV clonotypes identificeret i den foreliggende undersøgelse blev kodet af to eller tre forskellige nukleotid sekvens variationer. Når vi sammenlignet hyppigheden af ​​offentlige TRBV clonotypes inden for de overordnede EBV-specifikke CD8 T-celle responser, en tredjedel af dem repræsenterede dominerende clonotypes (med frekvenser 5%) (figur 3B). Mellem 35 og 48% af EBV antigenspecifikke clonotypes blev fundet ved lave frekvenser (mellem 1 og 5%), mens omkring en fjerdedel fandtes kun én gang i raske donorer eller patienter. Sammen viste vores data beviser for en høj grad af lighed mellem EBV BMFL1-specifikke CD8-T-celler mellem melanom patienter og raske individer, som illustreret ved (i) deling af hyppige offentlige TRBV sekvenser og (ii) den fortsatte disse offentlige TRBV clonotypes med tiden og efter TLD.

A. Udarbejdelse af de 14 offentlige aminosyre TCR beta-domæne sekvenser detekteret blandt tre raske individer og fem melanom patienter. Hver TCR-beta-kæde clonotype beskrives af TRBV segment, CDR3-beta-sekvens, TRBJ segment, antal nukleotidsekvens varianter identificeret for hver aminosyresekvens, samt andelen af ​​raske donorer og patienter, hvorfra hver sekvens blev identificeret. B. Fordeling af offentlige sekvenser inden for de overordnede EBV-specifikke CD8 T-celler hos raske donorer og patienter efter deres relative frekvens; dominerende clonotypes (med frekvens 5%) er repræsenteret i sort, lav dominant (1-5%) i grå og unikke sekvenser i hvidt.

Forbedret genekspression polyfunctionality enkelte EBV antigen-specifikke CD8 T-celler efter forbigående lymfo-udtømning og immunrekonstitution

For yderligere at undersøge effekten af ​​TLD og ACT, vi karakteriseret udviklingen af EBV epitop-specifikke CD8 T-celle respons i patienten LAU 1013 som gennemgik to successive cyklusser af TLD og immunrekonstitution (figur 4A), uden at vise tegn på EBV reaktivering (figur 1D). Hyppigheden af ​​EBV-specifikke tidlige-opdelte “memory-lignende” EM28

POS og sen-opdelte EM28

neg /EMRA CD8 T-celler var sammenlignelige mellem de to Leukaferese tidspunkter (Leuka I og Leuka II) ( Figur 4B). I overensstemmelse med dataene vist i figur 1, observerede vi forbedret effektorcelle-differentiering af EBV-specifikke T-celler før (ved Leuka I) og følgende lymfo-depletion (Leuka II), når der sammenlignes med virus-specifikke T-celler fra raske donorer .

A. Tidsplan for behandlingsplanen for patient LAU 1013, der fik to runder af TLD (afbildet som grå felter). De grå pile angiver leukaferese (Leuka I og Leuka II) og reinfusion af PBMC’er hhv. Blodprøver blev udtaget på dag 45 (post-Leuka I) og på dag 15/22 (post-Leuka II) efter reinfusion. B. Fænotype af EBV BMFL1-specifikke CD8 T-celler (venstre panel) og de samlede CD8 T-celler (højre panel), der viser andelen af ​​tidlige-opdelte (EM28

pos; CCR7

negCD45RA

negCD28

pos) og sen-opdelte (bestående af EM28

neg; CCR7

negCD45RA

negCD28

neg og EMRA; CCR7

negCD45RA

posCD28

neg) delmængder i PBMC’er taget fra patient LAU 1013 på Leuka i (n = 2) og Leuka II (n = 3) tidspunkter. Fejl barer (betyde +/- SD) repræsenterer uafhængige eksperimentelle replikater. C. Direkte

ex

vivo

kumulativ udtryk for hukommelse /homing-associerede gener (

CD62L /SELL

,

CCR5

,

IL7R

,

CD27

EOMES

) og effektor-relaterede gener (

PRF1

,

KLRD1 /CD94

,

IFNg

og

GZMB

). Single EBV-specifikke CD8 T-celler blev sorteret fra tidlig-opdelte EM28

pos og sen-opdelte EMRA på Leuka I (n = 266) og Leuka II (n = 162) tidspunkter og behandlet for den globale cDNA forstærkning som beskrevet i Materialer og Metoder.

P

-værdier blev udført af envejs ANOVA test; ns, ikke signifikant.