PLoS ONE: Xmrk, Kras og Myc transgene zebrafisk leverkræft Modeller Del Molekylær Signatures med delmængder af human hepatocellulært carcinom

Abstrakt

Tidligere tre onkogen transgene zebrafisk linjer med inducerbar ekspression af

xmrk

,

kras

eller

Myc

i leveren er blevet genereret og disse transgene linjer udvikler onkogen-afhængige levertumorer upon kemisk induktion. I den aktuelle undersøgelse blev sammenlignende transkriptomisk fremgangsmåder anvendt til at undersøge korrelationen mellem de tre inducerede transgene levercancere med humane levercancere. RNA-profiler fra de tre zebrafisk tumorer angivet relativt små overlapninger af markant deregulerede gener og biologiske veje. Ikke desto mindre er de tre transgene tumor signaturer alle viste signifikant sammenhæng med avanceret eller meget avanceret menneskelig hepatocellulært carcinom (HCC). Interessant, molekylær signatur fra hver onkogen-induceret zebrafisk levertumor korreleret med kun en lille delmængde af humane HCC prøver (24-29%), og der blev bevaret opreguleret veje mellem zebrafisk og korreleret menneskelige HCC undergruppe. De tre zebrafisk leverkræft modeller sammen repræsenterede næsten halvdelen (47,2%) af de menneskelige HCCs mens nogle menneskelige HCCs viste signifikant sammenhæng med mere end én signatur defineret af de tre onkogen-afhængige zebrafisk tumorer. I modsætning hertil almindeligvis dereguleret gener (21 op og 16 ned) i de tre zebrafisk tumormodeller viste generelt accordant deregulering i de fleste menneskelige HCCs, hvilket tyder på, at disse gener kan være mere konsekvent dereguleret i en bred vifte af menneskelige HCCs med forskellige molekylære mekanismer og således tjene som fælles diagnose markører og terapeutiske mål. Således er disse transgene zebrafisk modeller med veldefinerede onkogen-inducerede tumorer er værdifulde værktøjer til molekylær klassificering af menneskelig HCCs og for forståelse af molekylære bilister i hepatocarcinogenese i hvert menneske HCC undergruppe

Henvisning:. Zheng W, Li Z , Nguyen AT, Li C, Emelyanov A, Gong Z (2014)

Xmrk

,

Kras

Myc

Transgene zebrafisk leverkræft modeller Del Molekylær Signatures med delmængder af menneskelige hepatocellulært carcinom. PLoS ONE 9 (3): e91179. doi: 10,1371 /journal.pone.0091179

Redaktør: Xiaolei Xu, Mayo Clinic, USA

Modtaget 2 oktober, 2013; Accepteret: 9. februar 2014 Udgivet: 14. marts 2014

Copyright: © 2014 Zheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Medical Research Council of Singapore. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Zhiyuan Gong er i øjeblikket en akademisk redaktør af PLoS ONE; Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Menneskelig hepatocellulært carcinom (HCC) er kendt for at være en meget heterogen sygdom, især på mellemliggende og avancerede stadier [1]. På grund af de forskelligartede og komplekse ætiologier bidrager til HCC forekomst, kan forskellige genetiske mutationer eller ændrede molekylære veje være ansvarlig for hepatocarcinogenese. Indtil videre er der blevet identificeret flere kræftfremkaldende veje til at blive inddraget i udviklingen og progressionen af ​​HCC, herunder VEGFR, EGFR, og mTOR veje [2]. I bestræbelserne på at dechifrere rolle forskellige onkogene veje, har en række transgene musemodeller er etableret [3], [4] og komparative transkriptom analyser er blevet brugt til at identificere de bedste transgene musemodeller for humane HCCs [4].

zebrafisk er blevet mere og mere anerkendt som en værdifuld eksperimentel model for humane sygdomme, især for kræft [5], herunder leverkræft [6] – [11]. Det har vist sig, at de zebrafisk tumorer havde slående ligheder med human cancer histologisk [12], [13]. Transkriptom og epigenetiske analyser har også vist bevarede funktioner i kræftfremkaldende-induceret zebrafisk HCC med human HCC [14] – [16]

Vi har tidligere genereret flere lever tumor modeller af transgen udtryk for tre forskellige onkogener (

kras, xmrk

eller

Myc

) specifikt i zebrafisk leveren og disse transgene zebrafisk normalt producerer levertumorer med variable sværhedsgrad fra hepatocellulært adenom (HCA) til HCC [6] – [9]. De tre onkogener vi bruges i zebrafisk er alle blevet vist at være involveret i hepatocarcinogenese.

KRAS

er muteret i ca. 7% af leverkræft i human [17], men Ras-signalering er ubikvitært aktiveres i HCC [18].

Xmrk

er en naturligt forekommende variant af EGFR i fisk af slægten

Xiphophorus

(platyfish og swordtails) med konstitutiv autophosphorylering og aktivering af downstream signaler [19]. Aktivering af EGFR signal korreleres med dårlig prognose af HCC patienter [20].

MYC

er almindeligt forstærkes i mange kræftformer, herunder HCC og højere udtryk niveau af MYC er forbundet med mere avanceret status HCC [21]. Vi har vist, at overekspression af

kras

xmrk

i zebrafisk leveren kunne fremkalde HCC [7] – [9], mens overekspression af

Myc

induceret meste HCA [ ,,,0],6].

Sammenlignende transkriptom analyser af dyremodeller og humane kliniske prøver giver et kraftfuldt værktøj til identifikation af bevarede molekylære veje og biomarkør gener for diagnose og behandling [15], [22]. Vores eksisterende onkogen transgene zebrafisk modeller har veldefinerede opregulering af førerens onkogen og dette kan give et værdifuldt redskab til at identificere de molekylære drivende kræfter i den menneskelige carcinogenese ved sammenlignende transkriptom analyser. Således i denne undersøgelse anvendte vi RNA-sekventering teknologi til at sammenligne de transkriptomisk profiler af de tre onkogen-induceret levertumorer i transgen zebrafisk. Ved sammenlignende analyser med humane lever transcriptomes fra cirrhotiske lever til meget avanceret HCC, fandt vi, at de alle viste stærk molekylær korrelation med avancerede eller meget avancerede humane HCCs. Alligevel er der helt forskellige deregulerede biologiske veje baseret på liberaliserede gener i de tre onkogen transgene modeller. Interessant hver zebrafisk levertumor model korreleret med en delmængde af humant HCCs og hver delmængde har nogle distinkte molekylære funktioner. Vi viste, at de transgene zebrafisk modeller med veldefineret driver-gen aktivitet bør være værdifuldt for klassificering af human HCCs og for forståelse af de molekylære mekanismer bag hver HCC undertype.

Materialer og metoder

Behandling og Induktion af leverkræft i de tre zebrafisk transgene modeller

zebrafisk blev opretholdt efter den godkendte protokol af Institutional Animal Care og brug Udvalg for National University of Singapore (protokol 079/07). Frembringelsen af ​​

xmrk

og

Myc

transgene zebrafisk er tidligere beskrevet, og de blev betegnet som

FOR (xmrk)

[9] og

FOR (Myc)

[6] henholdsvis i de tidligere udgivelser. De to transgene linjer blev konstrueret ved anvendelse af et tetracyclin-inducerbare transgene system, og onkogenet ekspression blev induceret ved doxycyclin.

KRAS

V12

transgene linje anvendes i den foreliggende undersøgelse var nyligt genereret ved anvendelse af en mifepriston-inducerbare system [7] i kombination med en Cre-loxP-systemet (ikke offentliggjort). For

xmrk

og

Myc

transgene linjer, transgene fisk og deres ikke-transgene søskende blev behandlet med 60 ug /m doxycyclin (Sigma, USA) startende fra 3,5 mpf (måned efter befrugtning) i 6 uger. Alle

xmrk

fisk udviklede HCC og alle

Myc

fisk udviklede HCA. I alt for hvert transgen linie, en tumorprøve (transgene fisk behandlet med doxycyclin) og tre kontrolprøver (ikke-transgene søskende behandlet på lignende måde med doxycyclin, transgene søskende uden doxycyclinbehandling, og ikke-transgene søskende uden doxycyclinbehandling) blev indsamlet til RNA-sekventering. I alle tilfælde blev leverprøver anvendt til RNA-sekventering puljet fra fire til fem mandlige fisk. For

kras

V12

transgene fisk blev en måneder gamle transgene fisk behandlet med 1 pM mifepriston (Sigma, USA) i 36 timer for at inducere Cre-medieret rekombination til aktivering af

KRAS

V12

transgenekspression i leveren.

kras

V12

aktiveret transgene fisk blev derefter lov til at vokse i seks måneder at udvikle HCC og HCC prøver blev derefter opsamlet for RNA-sekventering. Tre levertumorer fra induceret transgene fisk og tre normale lever fra ikke-inducerede transgene fisk blev samlet separat som tumor og kontrolprøver. Alle prøver blev anvendt, var fra mandlige fisk og to sæt biologiske replikater blev brugt.

Identifikation af Signature Gene Lister i hvert zebrafisk leverkræft Model

Samlet RNA blev ekstraheret ved anvendelse TRIzol Reagent (Invitrogen, USA ) og behandlet med DNase i for at fjerne genomisk DNA-kontaminering. 3 ‘RNA-SAGE (serial analyse af genekspression) sekventering blev udført på ABI solid platform ved Mission Biotech (Taiwan) ifølge producentens protokol og 10-23 mio læsninger blev genereret fra hver sampler (tabel S1). Kort fortalt blev mRNA oprenset ved anvendelse Dynabeads Oligo (dT) EcoP (Invitrogen) og underkastet cDNA-syntese. Resulterende cDNA blev fordøjet af NlaIII og EcoP15I at resultere i en 27 nukleotider cDNA tag mellem de to sekventering adaptere. Mærkerne blev kortlagt til NCBI RefSeq (reference Sequence) mRNA database for zebrafisk med et kriterium for at lade maksimum 2 nukleotid uoverensstemmelser. Alle RNA-Seq data blev indsendt til Gene Expression Omnibus database med følgende adgang numre: GSE53342 for

xmrk

og

Myc

data og GSE53630 for

KRAS

data. Tag tæller for hver udskrift blev normaliseret til TPM (udskrifter per million) for at lette sammenligningen mellem forskellige prøver. De differentielt regulerede gener i

Myc

– og

xmrk

– induceret leverkræft blev identificeret ved hjælp af en stikprøve t-test som beskrevet tidligere [23], og differentielt udtrykte gener i

kras

induceret leverkræft blev identificeret ved hjælp af to-tailed t-test.

for at lette funktionelle konsekvenser af zebrafisk transkriptom blev alle zebrafisk gener kortlagt til annoteret humane gener for at kunne bruge eksisterende online software udviklet i humane gener. Således blev menneskelig homologi kortlægning af zebrafisk UniGene klynger hentet fra Genome Institute of Singapore zebrafisk Annotation Database (https://123.136.65.67/). For UniGene clusters kortlagt af over en transcript poster, blev den højeste TPM bruges til at repræsentere ekspressionsniveauet af det Unigene cluster. Nogle zebrafisk UniGene klynger blev kortlagt til mere end én humane UniGene klynger, som normalt stammer fra den samme genfamilie. For at fjerne redundans og undgå at forårsage skævhed i funktionelle analyser, blev kun den første humane Unigene klynge på listen er udvalgt til at repræsentere de zebrafisk UniGene klynger. Listerne over markant opreguleret zebrafisk gener, der blev kortlagt med menneskelige homologer og anvendes til sammenlignende analyese med humane HCC data er vist i tabel S2.

Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)

GSEA blev anvendt til at fastslå slægtskab mellem de transgene zebrafisk modeller og humane levercancere [24]. GSEA er en beregningsmetode, der afgør, om en

priori

defineret sæt af gener viser statistisk signifikante, overensstemmende forskelle mellem to biologiske prøver; den beregner en berigelse score ved hjælp af en indkøring sum statistik gennem en prioriteret liste over genekspression datasæt. Humane homologer af markant up-regulerede gener fra zebrafisk tumorvæv blev brugt som kræft underskrifter for hver transgene zebrafisk model for transkriptom sammenligning med humane HCC data. Hver valgte fænotype af humane HCCs (enten en specifik HCC stadium eller en bestemt HCC prøve) blev sammenlignet med resten af ​​prøverne i samme datasæt. Alle gener i den valgte fænotype blev rangordnet af t-test til at bestemme ekspressionsniveauer forskelle blandt forskellige HCC stadier eller forskellige HCC prøver. Den berigelse score på den foruddefinerede transgene zebrafisk kræft signatur blev beregnet ved hjælp af en indkøring sum statistik gennem klassificeret gener. Den statistiske signifikans af berigelse score blev estimeret ved anvendelse af en empirisk fænotype-baserede permutation testprocedure. En FDR (falsk opdagelse sats) værdi blev fastsat ved at indføre regulering af flere test hypotese. Humane leverkræft transkriptom data blev hentet fra Gene Expression Omnibus (GEO) database. Den menneskelige datasæt, herunder forskellige stadier af HCCs anvendes i sammenligningen var GSE6764 [25]. De ti humane HCC datasæt anvendes til undersøgelse repræsentationen af ​​zebrafisk leverkræft gen signaturer er opsummeret i tabel S3. Annotation oplysninger blev hentet fra SOURCE (https://smd.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch). For flere sonder, der kan knyttes til én Unigene klynge, blev den maksimale signal intensitet valgt til at repræsentere udtryk niveau Unigene klynge.

GSEA Pre-rangeret Analyse

GSEA pre-rangeret option blev anvendt til at analysere de deregulerede veje i hver transgene zebrafisk model og undergrupper af humane HCCs. Kort beskrevet blev hele transkriptom sorteret efter logaritme transformeret p-værdi (basis 10). De op-regulerede gener fik positive værdier, og de ned-regulerede gener negative værdier. De kuraterede kanoniske veje fra MSigDB (Molecular Signature Database) blev anvendt. Antallet af permutation anvendte 1000.

RT-qPCR Validation

Total RNA blev revers-transkriberet under anvendelse af SuperScript II-cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). RT-qPCR blev udført med samme sæt af cDNA’er, der anvendes til SAGE sekventering under anvendelse af LightCycler 480 SYBR Green I Master-system (Roche). Reaktionerne blev udført i triplikat for hvert cDNA prøve og primersekvenser er vist i tabel S4. Gene ekspressionsniveauerne i hvert kontrol eller transgene lever prøve blev normaliseret med niveauet for

β-actin

mRNA som den interne kontrol. Loggen

2 fold ændringer mellem tumor og kontrolprøver blev beregnet under anvendelse af CT-fremgangsmåde ifølge formlen: log

2 gange ændrer = -ΔΔCT = – [(CT gen af ​​interesse-CT

β-actin

) transgene prøvetagningsmo (CT genet af interesse-CT β-actin) kontrolprøve]. To-tailed heteroscedastic t-test blev udført ved hjælp af normaliserede CT-værdier (CT-gen – CT β-actin) og ændringer med p 0,05 anses for at være væsentlig

Resultater

Identifikation af differentielt udtrykte. Gener i de tre transgene zebrafisk leverkræft modeller

de tre onkogen transgene linjer (

xmrk, Myc

kras

V12

) blev induceret til at udvikle levertumorer ( Figur S1), og disse tumor prøver blev underkastet RNA-SAGE-sekventering. Ved et udvælgelseskriterier af fold ændring 1,5, p værdi 0,05 og TPM 10 (i enten kontrol- eller tumorprøver), blev differentielt udtrykte gener udvalgt fra de tre tumor sæt. Der var 2.892, 797 og 494 gener opreguleret og 169, 902 og 676 gener nedreguleret i

xmrk

-,

kras

– og

Myc

– induceret zebrafisk leverkræft, henholdsvis (figur 1A, B). Deregulerede gener fra de tre transgene modeller viste relativt små overlapninger, hvilket indikerer, at de tre oncogener reguleret helt forskellige sæt af gener. Dette er i overensstemmelse med den rapport, der morfologisk ensartede kræft type er ofte klassificeret i forskellige undergrupper baseret på deres forskellige genekspressionsmønstre [26]. Interessant nok var der 21 opreguleret og 16 ned-regulerede gener almindeligvis findes i alle de tre tumormodeller (figur 1A, B, tabel 1).

(A) Venn diagram af op-regulerede gener i tre zebrafisk transgene HCC modeller. (B) Venn diagram af nedregulerede gener i de tre zebrafisk transgene HCC modeller. (C) dereguleret veje i de tre onkogen transgene levertumorer. Up- og ned-regulerede veje i hver zebrafisk transgen HCC model blev analyseret ved GSEA pre-rangeret analyse. Rød og grøn indikerer op- og nedregulering henholdsvis og farvekoden baseret på FDR er vist til venstre. Veje korrelerer med grå celler blev ikke påvist med nogen ændring. De op-regulerede veje blev tildelt i syv kræft kendetegnende kategorier (ekskl muliggør replikativ udødelighed) ifølge Hanahan og Weinberg [27] og ned-regulerede veje blev klassificeret baseret på forskellige aspekter af leveren metabolisme (se tabel S1 for detaljer).

Tydelige pathways reguleret i tre zebrafisk levertumor modeller

Pathway analyse ved hjælp GSEA viste, at de tre transgene leverkræft modeller har forskellige veje dereguleret (figur 1C, tabel S5) . Det er blevet almindeligt accepteret, at der er otte kræft kendetegnende for flertrins tumorigenese og kompleksiteten af ​​neoplasmer [27], [28]. Vi fandt, at GSEA-identificerede veje faldet i mindst syv kræft kendetegnende (bortset muliggøre replikativ udødelighed).

Xmrk

hovedsageligt opreguleret veje er involveret i at unddrage sig vækst undertrykkere og undgå immun ødelæggelse, som omfattede aktiverende cellecyklus, der fremmer RNA transskription, opregulering proteasom og ændre immun egenskaber.

Kras

forudsat tumorcellerne med evne selvbærende proliferative signaler ved opregulering EGFR, Raf-MEK-ERK, PI3K-AKT-mTOR og GSK3 signalveje. Konkret er det ændret også de centrale klæbende tegn i tumorceller, som kunne aktivere invasion og metastase.

Myc

hovedsageligt opreguleret oversættelse og proteolyse at hjælpe tumorceller at unddrage sig vækst undertrykkere, og det også opreguleret VEGF vej, hvilket potentielt inducere angiogenese. Mens der var ingen enkelt vej markant opreguleret i alle tre tumormodeller, der var nogle veje opreguleret i to modeller, såsom proteasom i

xmrk

og

Myc

modeller, og IGF1 vej, mTOR pathway, tRNA biosyntese og fokal vedhæftning i

xmrk

og

KRAS

modeller. I modsætning hertil veje i omprogrammering af energistofskiftet var generelt nedreguleret i alle tre modeller selvom nedregulering i

Myc

model var mindre synlige end de to andre modeller. Imens mange andre veje involveret i normal leverfunktion såsom blodfaktorer, aminosyremetabolismen, afgiftning og miljøfremmede metabolisme, fedtsyremetabolisme og galde syntese blev ensartet nedreguleret i alle tre tumormodeller. Men en enkelt undtagelse var hormon regulering, der tilsyneladende var opreguleret i

KRAS

tumorer.

Korrelation af de tre Gene underskrifter zebrafisk levertumorer med forskellige stadier af menneskets HCCs

up-regulerede gener, 2892, 797 og 494 fra

xmrk

,

kras

Myc

tumorer henholdsvis blev brugt som signatur generne for hver model. Disse up-regulerede gener blev konverteret til 1362, 490, og 146 human Unigenes henholdsvis for at sammenligne med tilgængelige transkriptom data fra humane undersøgelser. Vi derefter sammenlignet de tre signatur gen sæt med et sæt af menneskelige transkriptom data (GSE6764) fra forskellige humane lever betingelser: syge lever, lav kvalitet dysplastiske knuder (LGDN), høj kvalitet dysplastiske knuder (HGDN), og meget tidligt, tidligt , avanceret, og meget avanceret HCC (veHCC, eHCC, AHCC og vaHCC), hvor de patologiske HCC etaper er defineret af tumorstørrelse, differentiering status og metastase niveau [25]. De tre signatur gensæt blev alle opreguleret som sygdommen skrider frem, men de begyndte at være opreguleret på forskellige stadier af tumorigenese (figur 2).

xmrk

signatur viste positiv korrelation med HCCs startende fra eHCC, og det var signifikant korreleret med AHCC og vaHCC.

kras

signatur positivt korreleret med AHCC og vaHCC, og det blev kun signifikant korreleret med vaHCC.

Myc

signatur viste signifikant positiv sammenhæng med HCCs startende fra eHCC, ens med vores tidligere resultat med et uafhængigt sæt af RNA-seq data fra samme transgene linje [6]. Interessant, de fælles 21 up-regulerede gener i alle tre tumormodeller viste også opregulering selv fra meget tidlige fase af HCC, hvilket indikerer disse gener er korreleret med hele neoplastisk proces.

opreguleret gen underskrifter fra de tre transgene tumorer (xmrk, kras og Myc) og 21 almindeligt up-regulerede gener (fælles) blev anvendt til GSEA og Ness (normaliseret berigelse scores (y-akse) er plottet mod forskellige stadier af menneskelige HCCs (x-aksen .) NES er angivet i tabellen og stjerne angiver statistisk signifikans: FDR 0,25 Forkortelser:. CL, cirrhotiske lever; LGDN, lav kvalitet dysplastiske knuder, HGDN, høj kvalitet dysplastiske knuder, veHCC, meget tidlig HCC, eHCC, tidlig HCC; AHCC, avancerede HCC,. vaHCC, meget avanceret HCC

repræsentation tre Gene underskrifter zebrafisk levertumorer i Human HCC prøver

på grund af de karakteristiske veje ændret i tre zebrafisk leveren tumormodeller og det høje niveau af heterogenitet i humane HCC patienter, vi søgte at undersøge omfanget af repræsentationen af ​​de tre zebrafisk leverkræft modeller i humane HCC prøver. Vi undersøgte ti sæt publicerede kliniske HCC microarray data, som hver især har omfattet mindst 80 kliniske prøver. De ti datasæt indeholder i alt 1.272 prøver, der dækker forskellige etniske grupper og risikofaktorer (tabel S2). Vi fandt, at

xmrk

,

kras

Myc

gen underskrifter var signifikant korreleret med 30,8%, 24,8% og 25,6% af alle kliniske prøver, hhv. 47,2% af de humane HCC-prøver havde signifikant sammenhæng med mindst en af ​​de tre zebrafisk gen signaturer (tabel 2, figur S2). I forskellige menneskelige HCC datasæt, de procentvise varierer fra 22,0% til 60,4%. Desuden blev nogle af de kliniske prøver korreleret med to eller endda tre zebrafisk gen signaturer. Co-korrelation af to gen-signaturer, nemlig

xmrk

/

kras

,

kras

/

Myc

og

kras

/

Myc,

udgjorde 17,5%, 13,5% og 12,4% af de humane HCC prøverne. 9,3% af de humane prøver viste co-korrelation af alle tre gener signaturer. Således fremgår det, at de tre transgene zebrafisk lever tumormodeller repræsenterer molekylære mekanismer for hepatocarcinogenese i næsten halvdelen af ​​de menneskelige HCC sager og den anden halvdel af den menneskelige HCC kan skyldes forskellige molekylære mekanismer.

Vi endvidere dokumenteret, at delmængder af menneskelige HCCs som viste signifikant positiv sammenhæng med det samme gen signatur også delte lignende up-regulerede veje (Figur 3, tabel S6). Til denne analyse blev hver af de humane HCC sæt adskilt i to undergrupper: dem, der angiver signifikant korrelation med en af ​​de zebrafisk signaturer, og resten. Differentielt udtrykte gener mellem de to grupper blev identificeret ved to-halet t-test, og pathway blev udført af GSEA pre-rangeret analyse. Veje blev udsat for hierarkisk klyngedannelse af logaritme-transformerede FDR værdier ved hjælp af MeV [29], [30]. Som vist i figur 3, transportvejene differentielt reguleret i humane HCCs som udviste signifikant sammenhæng med en af ​​de zebrafisk underskrifter havde distinkte mønstre. Den vej klynge A er bestod af veje opreguleret i alle tre undergrupper, herunder proteasom, tRNA biosyntese og oxidativ phosphorylering. Ribosom, transkription og translation, og cellecyklus var også stærkt opreguleret, hvilket antyder, at de humane HCC prøver signifikant korreleret med nogen af ​​de zebrafisk underskrifter var sandsynligvis mere proliferativ end dem, der ikke signifikant korreleret. Den vej klynge B indeholder veje nedreguleret i de fleste af de undergrupper, der er forbundet med

xmrk

men opreguleret i undergrupperne forbundet med

kras

Myc

. Interessant, afhandlinger veje var i overensstemmelse med højt nedreguleret veje i

xmrk

-induceret zebrafisk HCC, herunder energi metabolisme, aminosyre metabolisme, fedtsyre stofskiftet, galdesyrebiosyntese, komplement pathway, biosyntese af steroid, og N-glycan-biosyntese. Den vej klynge C er mere opreguleret i

kras

associeret HCC undergrupper, herunder glutamat metabolisme og glykolyse. Det er blevet rapporteret, at

Kras

kunne øge omdannelsen af ​​glucose til glutamat, og dette var afgørende for

Kras

medieret tumorgenicitet [31]. Den vej klynge D var generelt opreguleret i

xmrk

– og

kras

-correlated menneske HCCs, men viste en uensartet mønster i

Myc

-correlated menneskelige HCCs . Denne klynge indeholdt mange kinase veje, som blev liberaliseret i

xmrk

– og

kras

induceret zebrafisk leverkræft, men ikke ændret sig væsentligt i

Myc

-induceret zebrafisk lever kræft. Den vej klynge E var ret uensartet. Den vej klynge F var godt adskilt fra alle de andre, og det indeholdt veje, som mest var nedreguleret i alle de menneskelige HCC undergrupper forbundet med zebrafisk signaturer, herunder hæmatopoietisk cellelinie, cytokin pathway, calcium signalering, og GPCR-vejen. Da de fleste af disse ned-regulerede veje er involveret i inflammatorisk respons, er det sandsynligt, at undergrupper af menneskelige HCCs ikke fanget af de tre zebrafisk modeller har mere alvorlig inflammatorisk status.

Farvelinjerne repræsenterer logaritmen-transformerede FDR værdier. Opreguleret veje får positive værdier (rød) og ned-regulerede veje negative værdier (grøn). Pathways korrelerer med grå celler ikke påvises i reaktionsvejen analyser. Veje med enten FDR = 1 eller ikke påvist i mere end fem ud af de 30 kombinationer er pre-udelukket fra analysen.

De Almindeligt Up og Down-regulerede gener i zebrafisk levertumorer er også Konsekvent up og Down-reguleret i human HCCs

Mens de tre gen-underskrifter repræsenterer opregulering af distinkte veje og korrelerer med forskellige undergrupper af menneskelig HCCs, søgte vi at undersøge, om den 21 almindeligt opreguleret og 16 almindeligvis ned-regulerede gener i alle tre transgene modeller ville være tilsvarende reguleres i humane HCCs. Blandt de ti menneskelige HCC datasæt vi brugte, var vi i stand til at undersøge to datasæt, som omfattede både HCCs og deres tilsvarende ikke-tumorvæv (GSE14520 og GSE25097). Dog kunne kun GSE14520 sammenlignes med zebrafisk data som de fleste af de menneskelige gener homologe til de fælles zebrafisk gener kunne identificeres fra microarray platform bruges: 19 af de 21 up-regulerede gener (undtagen

FOXA3

MRPS9

) og 12 af de 16 ned-regulerede gener (med undtagelse af

cyp2ad2

,

slco1d1

,

TDH

og

MIOX)

. GSE14520 datasæt indeholder 229 primære HCCs og de tilsvarende parret ikke-tumor hepatiske væv [32], [33].

xmrk

,

kras

Myc

underskrifter var signifikant korreleret med 30,5%, 20,0%, og 20,5% af HCC prøverne, og i alt 47,6% af den HCC prøver viste signifikant opregulering af mindst en af ​​de zebrafisk leverkræft signaturer (tabel 2). Blandt de 19 up-regulerede gener, 16 af dem blev opreguleret i mere end halvdelen af ​​HCC-patienter, og 9 af dem var opreguleret i mere end 75% af patienterne (figur 4).

STMN1

blev opreguleret i 96,9% af de menneskelige HCCs fra datasættet, som er den mest allestedsnærværende opreguleret.

STT3A

og

SRP14

blev opreguleret i 93,0% af de menneskelige HCCs. Blandt de 12 ned-regulerede gener, 11 af dem blev nedreguleret i mere end halvdelen af ​​HCC-patienter.

FBP1

blev nedreguleret i 96,9% af de undersøgte menneskelige HCCs. FBP1 er en glukoneogenese regulerende enzym og det fungerer til at modvirke glykolysen i gastrisk kræft [34].

FBP1

nedreguleres i størstedelen af ​​menneskelige HCCs ved methylering [35]. Restaurering af FBP1 udtryk i humane HCC-cellelinjer signifikant hæmmede cellevækst, hvilket tyder på, at det kunne fungere som en tumor suppressor [35].

19 af de up-regulerede gener og 12 af de ned-regulerede gener blev identificeret i microarray platform. Den røde farve indikerer opregulering, og den grønne farve indikerer nedregulering.

Endelig blev ekspressionen af ​​disse 19 up- og 16 ned-regulerede gener også valideret af RT-qPCR i alle tre forskellige typer tumorer. Som vist i figur S3, hovedparten af ​​genet i de fleste tests (-90%) bekræftede konsistent trend af ændringer i tumorprøverne.

Diskussion

Det er velkendt, at humane HCCs er meget heterogene; derfor bør cross-arter komparative studier på transkriptom niveau være værdifuldt at identificere bevarede og kritiske veje i carcinogenese i hvirveldyr. Her har vi først bestemmes deregulerede veje fra hver af de onkogen transgene zebrafisk model. Selvom de tre transgene tumormodeller havde helt forskellige deregulerede biologiske veje, de alle korreleret til avancerede eller meget avancerede HCCs sammenlignet med gen-signaturer fra humane HCCs. Endvidere har vi også fundet, at hver af zebrafisk model repræsenterer en undergruppe af humant HCCs. Da vores onkogen transgene linjer er veldefineret kørsel veje i carcinogenese bør oplysningerne fra de transgene zebrafisk være værdifulde for at forstå de vigtigste molekylære mekanismer i hver HCC undergruppe, der er afgørende for udvikling af mere effektive lægemidler specifikke for hver undergruppe. Interessant, vores tre onkogen transgene zebrafisk modeller betydeligt udgør kun mindre end halvdelen af ​​den menneskelige HCCs, og der er behov for at udvikle flere og forskellige onkogen transgene dyremodeller til at dække flere menneskelige HCCs for yderligere forståelse af distinkte molekylære mekanismer i hepatocarcinogenese, med fokus på inflammatoriske veje.

i den foreliggende undersøgelse, vi også identificeret en liste over almindeligt deregulerede gener i levertumorer induceret af forskellige onkogene signaler blev identificeret og deres udtryksmæssige ændringer i humane HCC prøver blev valideret

i silico

(tabel 1, figur 4). Disse gener kan være tjent som potentielle terapeutiske mål, da de var uafhængige af de enkelte onkogene veje. De op-regulerede gener omfatter dem i protein oversættelse og bearbejdning (

eif5a2

,

abce1

,

rrp9

,

srp14

,

itm1 <