Abstrakt
Selvom CD133 er blevet rapporteret at være en lovende tyktarmskræft stamceller markør, den biologiske funktioner CD133
+ kolon kræftceller tilbage kontroversiel. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi de biologiske forskelle mellem CD133
+ og CD133
– kolon kræftceller, med særligt fokus på deres interaktion med kræft-associerede fibroblaster, især CD10
+ fibroblaster. Vi brugte 19 primær tyktarmskræft væv, 30 primære kulturer af fibroblaster afledt af tyktarmskræft væv og 6 tyktarmskræft cellelinjer. Vi isolerede CD133
+ og CD133
– subpopulationer fra tyktarmskræft væv og dyrkede celler.
In vitro
analyser viste, at de to populationer viste lignende biologiske adfærd i deres spredning og kemosensitivitet.
In vivo
analyser viste, at CD133
+ celler viste signifikant større tumorvækst end CD133
– celler (
P
= 0,007). Desuden er der i cokulturer med primære fibroblaster afledt af coloncancer væv, CD133
+ -celler udviste signifikant mere invasive adfærd end CD133
– celler (
P
0,001), især i cokulturer med CD10
+ fibroblaster (
P
0,0001). Yderligere
in vivo
analyser afslørede, at CD10
+ fibroblaster forbedret tumor vækst i CD133
+ celler betydeligt flere end CD10
– fibroblaster (
P
0,05) . Disse data viser, at
in vitro
invasive egenskaber og
in vivo
tumorvækst af CD133
+ kolon kræftceller er forbedret i tilstedeværelse af specifikke cancer-associerede fibroblaster, CD10
+ fibroblaster, hvilket tyder på, at samspillet mellem disse specifikke cellepopulationer har vigtige roller i kræft progression. Derfor kan disse specifikke interaktioner være lovende mål for nye tyktarmskræft behandlingsformer
Henvisning:. Cui L, Ohuchida K, Mizumoto K, Moriyama T, Onimaru M, Nakata K, et al. (2010) fremadrettet Isolerede Cancer-associerede CD10
+ Fibroblaster har stærkere Interaktioner med CD133
+ Colon Cancer Cells end med CD133
– kræftceller. PLoS ONE 5 (8): e12121. doi: 10,1371 /journal.pone.0012121
Redaktør: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong
Modtaget: Marts 8, 2010; Accepteret: 15 Juli 2010; Udgivet: 12. august 2010
Copyright: © 2010 Cui et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Understøttes i del af en Grant-in-Aid fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan, og en bevilling fra Takeda Science Foundation, den japanske Society of Gastroenterology, den Uehara Mindefond, og Nakajima Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Tyktarmskræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i den vestlige verden, og forekomsten er stigende i asiatiske lande som følge af ændringer i retning et vestligt kost [1]. For nylig har begrebet cancerstamceller (CSCS) blevet fokuseret på i biologi af colorektal cancer. Tyktarmskræft viser en markant grad af morfologisk og funktionel heterogenitet i sine celler. Blandt disse cellepopulationer, har CSCS især blevet rapporteret at besidde tumorigene og behandlingsresistente aktiviteter [2]. Derfor kan isolering og karakterisering af kolon CSCS hjælpe mod udviklingen af nye diagnostiske og terapeutiske procedurer [3].
Menneskelig prominin-1 (PROM1, CD133) er et 5-transmembrane glycoprotein af 865 aminosyrer med en total molekylvægt på 120 kDa. Det blev oprindeligt beskrevet som et specifikt overfladeantigen af humane hæmatopoietiske stamceller [4], [5] og en markør for murine neuroepitelceller og flere andre embryonale epitelceller [6]. Selvom de biologiske funktioner af CD133 fortsat ukendt [7], er CD133 alene eller i kombination med andre markører for tiden anvendes til at isolere stamceller fra talrige væv [4], [5], samt prostata [8], lever [9 ] og bugspytkirtel [10], [11]. For nylig CD133 blev rapporteret at være en CSC markør i tyktarmskræft [3], [12]. IETA et al. [13] yderligere rapporteret, at CD133
+ celler afledt af tyktarmskræft cellelinjer udviser højere tumorigent potentiale end CD133
– celler. Imidlertid Shmelkov et al. [14] viste, at CD133 udtrykkes bredt af humane primære coloncancer epitelceller, og at både CD133
+ og CD133
– metastatiske tumor subpopulationer er i stand til langsigtet tumorigenese
in vivo
. Derfor konsekvenserne af CD133 som CSC markør forbliver kontroversiel.
Det er blevet foreslået, at samspillet mellem kræftceller og de omkringliggende stromale fibroblaster har kritiske roller i tumor invasion og metastase [15], [16]. Selvom bulk-tumorer er kendt for at bestå af heterogene kræftceller med forskellige spredning, invasion og metastase aktiviteter, er der ingen rapporter med fokus på heterogenitet cancer-associerede fibroblaster. I de fleste tidligere undersøgelser [17], [18], [19], [20], har kun to eller tre primære kulturer af cancer-associerede fibroblaster blevet anvendt til undersøgelser. Derfor, for en bedre forståelse af cancer celle-stromale celle-interaktioner, er det vigtigt at fokusere på heterogenitet cancer-associerede fibroblaster, svarende til heterogenitet af kræftceller, såsom CSCS.
I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi de biologiske virkninger af CD133
+ coloncancerceller ved at analysere CD133 ekspression i humane primære tyktarmskræft væv og evaluere de biologiske opførsler af CD133
+ og CD133
– celler afledt af tyktarmskræft cellelinjer
In vitro
in vivo
. Vi fandt betydelige forskelle i invasiv mellem disse to populationer i cokultureme med primære fibroblaster afledt af tyktarmskræft væv, især i cokultureme med fibroblaster er positive for CD10, en membran metalloendopeptidase. Taget sammen antyder disse data, at CD133
+ colon cancerceller er mere invasive i nærvær af specifikke cancerassocierede fibroblaster, især CD10
+ fibroblaster, og at disse cellepopulationer kan være lovende mål for inhibering metastase og tumor gentagelse.
Resultater
CD133 udtryk i kirurgisk resektion primære tyktarmskræft væv
Til dato er blevet rapporteret inkonsistente data vedrørende CD133
+ og CD133
– cellepopulationer i ubearbejdet tyktarmskræft væv [3], [14]. Vi undersøgte procentdele af CD133
+ og CD133
– cellepopulationer i ubearbejdet tyktarmskræft væv ved flowcytometri. Vi anvendte 26 primære tyktarmskræft væv og 24 normale colon epitelvæv fra 26 patienter. Vi analyserede CD133
+ befolkninger i disse kolon væv efter udelukke CD45
+ og CD31
+ celler. Alle kolon kræft prøverne indeholdt både CD133
+ og CD133
– celler (tabel 1; CD133
+ celler: 2-54%). Vi har registreret også CD133
+ -celler ved 0-5% i normale colon væv. At evaluere de kliniske implikationer af CD133 ekspression, undersøgte vi korrelationerne mellem CD133 ekspression og klinisk-patologiske fund, som tumorklassificering, Dukes klassifikation, lymfeknudemetastase, lymfe invasion og venøs invasion (tabel 2). Vi fandt signifikante korrelationer mellem CD133 udtryk og Dukes klassifikation (
P
= 0,010) og mellem CD133 udtryk og lymfeknude metastaser (
P
= 0,023).
Sammenligninger af maligne adfærd mellem sorterede CD133
+ og CD133
– kolon kræftceller
Brug flowcytometri, undersøgte vi tilstedeværelsen af CD133
+ befolkninger i 6 tyktarmskræft cellelinjer . Vi fandt, at alle cellelinierne besad CD133
+ -celler (6-91%, figur 1A). Især vi opdaget to adskilte populationer, en der kun består af CD133
+ celler, og den anden kun består af CD133
– celler i DLD-1 celler, mens de andre cellelinjer syntes at besidde en population bestående af både CD133
+ og CD133
– celler. Vi sorteret DLD-1-celler på basis af CD133 ekspression og reanalyser viste effektiv selektion (CD133
+: 98%; CD133
-: 100%; Figur 1 B). Efterfølgende undersøgte vi de tidsafhængige ændringer i CD133 ekspressionen på usorterede DLD-1 stamcellerne og sorteret CD133
+ og CD133
– celler. Som vist i figur 1B, sorteret CD133
+ celler viste signifikante tidsafhængige ændringer i CD133
+ og CD133
– populationer under lang tid kultur, mens de procentdele af CD133
+ og CD133
– populationer ikke ændre i stamcellerne og sorteret CD133
– celler. Derefter foretages en sammenligning af de biologiske adfærd med sorteret CD133
+ og CD133
– celler anvendte vi DLD-1 og HCT116-celler og undersøgt deres celleproliferation, kolonidannelse evne og kemoresistens til 5-fluoruracil (5-FU) og doxorubicin (DOX). Vi fandt ingen signifikante forskelle i disse celle adfærd mellem CD133
+ og CD133
– celler (figur S1, S2, S3, S4)
(A) CD133
+ populationer i en. panel af menneskelige kolon cancer cellelinjer. Flowcytometri analyser blev udført for at undersøge CD133
+ populationer i 6 tyktarmskræft cellelinjer. (B) Analyse af CD133
+ -populationen i parentale DLD-1-celler og reanalyser med sorteret CD133
+ -celler (98%) og CD133
– celler (100%) (øverste paneler). De tidsafhængige ændringer i CD133
+ populationer i usorteret forældrenes og sorteret CD133
+ og CD133
– DLD-1 celler er også vist (nederste panel). Den sorterede CD133
+ celler viser betydelige tidsafhængige ændringer i CD133
+ og CD133
– populationer under lang tid kultur, mens de procentdele af CD133
+ og CD133
– populationer ikke ændre sig i de stamcellerne og sorteret CD133
– celler. (C) Tumorvækst blev evalueret på 1 måned efter injektion af 5 x 10
6 CD133
+ eller CD133
– DLD-1 celler i 6 SCID-mus, hhv. Repræsentative fotografier er vist i det øverste panel (venstre: CD133
– celleafledt tumor; højre: CD133
+ celleafledt tumor). Scale bar = 1 cm. The CD133
+ celleafledte tumorer er betydeligt større end CD133
– celleafledte tumorer (
P
= 0,007; nedre panel). Dataene repræsenterer midler ± SD
For at vurdere tumorigent potentiale og
in vivo
tumorvækst af CD133
+ og CD133
-. DLD-1 celler, vi transplanterede serienumre CD133
+ og CD133
– celler i alvorlige kombineret immundefekt (SCID) mus. Selv om der var en tendens til tidligere påvisning af tumor dannelse i mus injiceret med CD133
+ celler sammenlignet med mus injiceret med CD133
– celler, var forskellene ikke signifikante (tabel 3). Ved 10 uger efter transplantation, injektion af mere end 5 × 10
6 CD133
+ eller CD133
– celler genereret synlige tumorer i alle mus. Når imidlertid tumorstørrelser blev sammenlignet, den CD133
+ celleafledte tumorer var signifikant større end CD133
– celleafledte tumorer. (
P
= 0,007, figur 1C)
Cancer-associerede fibroblaster øge invasiv af CD133
+ celler mere effektivt end CD133
– celler
for at belyse de faktorer, der forårsager forskellene i
in vivo
tumorvækst mellem CD133
+ og CD133
– celler, undersøgte vi effekten af cokultureme med cancer-associerede fibroblaster på invasiv af disse celler. Vi fandt, at der ikke var nogen forskel i invasiv mellem CD133
+ og CD133
– celler, når cellerne blev dyrket alene (figur 2A). I modsætning hertil, når cellerne blev dyrket sammen med kræft-associerede fibroblaster viste CD133
+ celler signifikant større invasiv end CD133
– celler og forældrenes celler (
P
0,001 for begge; figur 2A). Vi undersøgte virkningerne af 12 primære kulturer af fibroblaster på invasivitet af CD133
+ -celler, og fandt, at virkningerne af de samdyrket celler på CD133
+ celleinvasion varierede fra 0,88 gange til 1,76 gange (tabel 4 ).
(A) Invaderende celler blev målt efter 48 timers monokultur eller co-kultur med kræft-associerede fibroblaster (f11). CD133
+ celler dyrket sammen med kræft-associerede fibroblaster viser signifikant større invasiv end CD133
– celler og parentale celler (
P
0,001). Scale barer = 100 um. (B) De procentdele af CD10
+ celle befolkning og aktiviteter disse celler til at fremkalde invasionen af dyrket sammen tyktarmskræft celler blev undersøgt i 12 primære kulturer af fibroblaster. Der er en signifikant positiv sammenhæng mellem forbedring af CD133
+ celle invasionsevne og den procentdel af CD10
+ cellepopulation (
P
0,0001). (C) Flowcytometri analyser blev udført for at undersøge CD10
+ befolkninger i primær kolon kræft væv. Der er en signifikant sammenhæng mellem de procentdele af CD133
+ og CD10
+ befolkninger i tyktarmskræft væv (
P
= 0,015).
korrelationer mellem de procentsatser af celleoverflade markør-positive befolkninger i cancer-associerede fibroblaster og deres forøgelse af kræft invasion
for at karakterisere de primære kulturer af cancer-associerede fibroblaster, vi undersøgte udtryk for det stromale celle-associerede overflade markørerne CD10, CD105, CD44 og CD54 på 32 primære kulturer af fibroblaster ved flowcytometri (tabel 4). Vi derefter undersøgt sammenhængen mellem forøgelsen af CD133
+ celle invasionsevne og de procentdele af positive populationer for disse overflademarkører. Vi fandt en signifikant sammenhæng mellem forbedring af CD133
+ celle invasionsevne og den procentdel af CD10
+ population (
P
0,0001, ρ = 0,928, figur 2B, tabel 5). Som vist i tabel 4, den procentdel af CD10
+ -populationen i primære kulturer af cancerassocierede fibroblaster etableret fra colontumorer varierede fra 0,39% til 73,33%. Vi fandt også en signifikant omvendt sammenhæng mellem procentdele af CD10
+ og CD105
+ populationer (
P
0,0001; tabel 5), samt en signifikant omvendt sammenhæng mellem forbedring af CD133
+ celle invasionsevne og den procentdel af CD105
+ population (
P
= 0,0268; tabel 5).
Dernæst undersøgte vi CD10-ekspression i kirurgisk resektion primære væv og fandt, at 0,4 til 25% af cellerne er afledt af coloncancer væv var CD10
+ (tabel 1). Vi derefter undersøgt sammenhængen mellem den procentdel af CD10
+ befolkning og de klinisk-patologiske fund. Vi fandt tendenser i retning positive korrelationer mellem den procentdel af CD10
+ befolkning og Dukes klassifikation og mellem den procentdel af CD10
+ befolkning og lymfeknudemetastaser, selv om de ikke var statistisk signifikante (tabel 2). Vi undersøgte også korrelationerne blandt celleoverflademarkører i de samme patienter og fandt en signifikant sammenhæng mellem de procentdele af CD133
+ og CD10
+ populationer (
P
= 0,015; ρ = 0,4063 ;. Figur 2C)
CD10
+ fibroblaster forbedre
in vitro
invasion og
in vivo
tumor vækst af CD133
+ kræftceller
for at undersøge de funktionelle forskelle mellem CD10
+ og CD10
– fibroblaster, vi sorteret CD10
+ og CD10
– fibroblaster (figur 3A) fra primære kulturer af cancer-associerede fibroblaster. Niveauerne af
CD10
mRNA i disse to populationer var i overensstemmelse med niveauerne af CD10 celleoverfladeprotein ekspression (figur 3A). Ved hjælp af disse to populationer af fibroblaster, vi undersøgte deres virkninger på invasiv af CD133
+ og CD133
– kræftceller. CD10
+ fibroblaster forbedret invasiv af CD133
+ kræftceller betydeligt flere end CD10
– fibroblaster (
P
0,0001; HCT116 celler, figur 3B, DLD-1 celler, figur 3C). CD10
+ fibroblaster også lidt forbedret invasiviteten af CD133
– kræftceller mere end CD10
– fibroblaster, men væsentligt mindre end deres effekt på invasiv af CD133
+ kræftceller (
P
0,001; figur 3C). For at vurdere virkningerne af CD10
+ og CD10
– fibroblaster på
in vivo
tumorvækst, vi cotransplanted CD133
+ eller CD133
– HCT116 kræftceller og CD10
+ eller CD10
– fibroblaster i SCID-mus. CD10
+ fibroblaster øget tumorvækst af CD133
+ kræftceller betydeligt flere end CD10
– fibroblaster (
P
0,05, figur 3D)
(. A) Analyse af primære kulturer af tyktarmskræft-associerede fibroblaster (venstre panel) og reanalyser af sorteres CD10
+ celler (midterste øverste panel) og CD10
– celler (midterste nedre panel).
CD10
mRNA-niveauer i den sorterede CD10
+ og CD10
– fibroblaster blev målt ved QRT-PCR (højre panel). (B, C) Den invasivitet af CD133
+ og CD133
– kræftceller samdyrket med CD10
+ eller CD10
– fibroblaster blev evalueret. Repræsentative fotografier er vist (B, HCT116 celler C, DLD-1 celler). Scale barer = 100 um. CD10
+ fibroblaster øge invasiv af CD133
+ kræftceller betydeligt mere end CD10
– fibroblaster (
P
0,0001). (D) Virkningerne af CD10
+ og CD10
– fibroblaster på
in vivo
tumorvækst blev vurderet ved 4 uger efter cotransplantation af CD133
+ eller CD133
– HCT116 kræft celler og CD10
+ eller CD10
– fibroblaster i SCID mus (
n
= 6 for hver gruppe). Repræsentative fotografier er vist (øvre panel). Scale bar = 1 cm. CD10
+ fibroblaster øge tumorvækst af CD133
+ HCT116 kræftceller betydeligt mere end CD10
– fibroblaster (
P
0,05; nederste panel). Dataene repræsenterer midler ± SD.
Effekt af CD10 knockdown i CD10
+ fibroblaster på invasionen af dyrket sammen kolon kræftceller
For at undersøge, om CD10 protein i fibroblaster funktionelt bidrager til forøgelsen af invasion af samdyrket cancerceller, fibroblaster transficeret med
CD10
-targeting små interfererende RNA’er (siRNA’er) (siRNA-1 og siRNA-2) eller en kontrol-siRNA blev anvendt til invasion assays. Både af
CD10
-targeting siRNA’er hæmmede 90% af
CD10
mRNA-ekspression. Knockdown af CD10-ekspression i CD10
+ fibroblaster bemærkelsesværdigt reduceret invasiv af dyrket sammen CD133
+ HCT116 kræftceller (
P
0,001; figur 4) men havde en begrænset effekt på invasiv af CD133 .
– kræftceller
Knockdown af CD10-ekspression i CD10
+ fibroblaster reducerer bemærkelsesværdigt invasiviteten af dyrket sammen CD133
+ HCT116 kræftceller (
P
0,001) , men har en begrænset effekt på invasiv af CD133
– kræftceller. Repræsentative fotografier (øvre paneler) og grafer (nedre panel) er vist. Scale barer = 100 um
Differentiel udtryk profilering af CD10
+ og CD10
-. Fibroblaster
For at belyse de centrale molekyler involveret i CD10
+ fibroblast-medieret forstærkning af
in vitro
invasion og
in vivo
tumorvækst af CD133
+ kolon kræftceller, vi udførte microarray-analyser ved hjælp af CD10
+ og CD10
– primære-dyrkede fibroblaster afledt fra colontumorer. Sammenligninger af de microarray data mellem CD10
+ og CD10
– primære-dyrkede fibroblaster identificeret 20 gener, der blev opreguleres af 2-fold i CD10
+ fibroblaster (tabel S1). For at validere disse microarray data blev QRT-PCR udført. Vi valgte
ALDH1A1
,
GPNMB
,
MMP3
IGFBP2
fra generne, der er anført i tabel S1, fordi der er blevet rapporteret disse gener at være involveret i kræftcellen invasion og colon stamceller blev også rapporteret til at udtrykke ALDH1 [21], [22], [23], [24], [25]. De validerede data var i overensstemmelse med de microarray data (figur S5).
For at vurdere virkningerne af
CD10
knockdown på udtrykkene i de fire invasion-associerede gener (
MMP3
,
ALDH1A1
,
GPNMB
og
IGFBP2
) i CD10
+ fibroblaster, blev CD10
+ fibroblaster transficeret med
CD10
-targeting eller kontrol siRNAs, og udtryk for de fire invasion-associerede gener blev vurderet. Der var ingen væsentlige ændringer i udtrykkene for disse fire gener (figur S6).
Diskussion
I den foreliggende undersøgelse, afslørede vores
in vitro
eksperimenter, CD10
+ fibroblaster afledt af tyktarmskræft væv væsentligt forbedret invasionen af CD133
+ kolon kræftceller sammenlignet med CD10
– fibroblaster. Vi fandt også, at knockdown af CD10 i CD10
+ fibroblaster delvist reduceret invasiv af dyrket sammen CD133
+ kolon kræftceller. Desuden er vores
in vivo
analyser viste, at cotransplantation af CD10
+ fibroblaster signifikant øget tumor vækst i CD133
+ kolon kræftceller sammenlignet med cotransplantation af CD10
– fibroblaster. Taget sammen antyder disse data, at en specifik undergruppe af colon cancerceller, CD133
+ -celler, har vigtige interaktioner med en specifik undergruppe af cancerassocierede fibroblaster, CD10
+ fibroblaster. Dette er den første rapport at beskrive cancercelle-stromale celle-interaktioner mellem fremadrettet sorteret specifikke undergrupper af colon cancerceller og cancerassocierede fibroblaster.
CSCS er blevet isoleret fra tyktarmskræft på grundlag af deres ekspression af cellen overflade markør CD133 [3], [12], [26]. Selv om flere forskere for nylig har offentliggjort rapporter om CD133
+ kolon kræftceller [3], [12], [26], der var inkonsistente data vedrørende tumor-initierende evne CD133
+ kolon kræftceller. I nærværende undersøgelse fandt vi tumorigent potentiale i både CD133
+ og CD133
– kolon kræftceller, i overensstemmelse med resultaterne af Shmelkow et al. [14]. Desuden fandt vi ingen signifikant forskel mellem disse to cellepopulationer i deres
in vitro
celledeling, kolonidannelse og kemoresistens. Men den nuværende
in vivo
analyser viste, at CD133
+ celler genereret betydeligt større tumorer end CD133
– celler. For at forstå konsekvenserne af de inkonsistente resultater mellem
in vitro
og
in vivo
eksperimenter, vi fokuseret på kræft celle-stromale celle-interaktioner, som er kendt for at have afgørende roller i kræft progression [ ,,,0],27]. I cokulturer med flere primære kulturer af cancerassocierede fibroblaster, invasivitet af CD133
+ colon cancerceller blev signifikant forøget sammenlignet med den for CD133
– celler, mens primære kulturer af andre cancerassocierede fibroblaster synes ikke at har en sådan potentiale til at øge invasivitet af cancerceller. Derfor har vi karakteriseret disse primære kulturer af cancer-associerede fibroblaster, og fandt, at CD10
+ fibroblaster spillet en væsentlig rolle i styrkelsen af CD133
+ kræftcellen invasiv i
in vitro
in vivo
eksperimenter
i den foreliggende undersøgelse, vi brugte CD133
+ og CD133
– celler isoleret fra dyrkede cellelinier, fordi vi ikke kunne få reproducerbare resultater for tumorigenisitetsforsøg analyser og cokultur eksperimenter, når vi brugte CD133
+ og CD133
– celler isoleret fra patienters tumorer i en forundersøgelse. Imidlertid er det vigtigt at undersøge de biologiske opførsler af CD133
+ og CD133
– subpopulationer isoleret fra patienters tumorer. Derfor er yderligere undersøgelser nødvendige for at afklare forholdet mellem primær tumor-afledt CD133
+ kræftceller og CD10
+ fibroblaster. Men vi er nødt til at forbedre vores metoder til primære kulturer af kræftceller, før der kan udføres sådanne undersøgelser. Derudover brugte vi subkutane modeller i nærværende undersøgelse på grund af vanskelighederne ved bedømmelsen af tumor størrelse ortotopisk modeller. I betragtning af den betydning af vævet mikromiljø, undersøgelser under anvendelse ortotopisk modeller skulle udføres som det næste trin.
CD10 er et 90-100 kDa celleoverfladen zink-afhængige metalloprotease, der er bredt udtrykt af cellerne i forskellige væv, såsom lymfoide progenitorceller, myoepitelcellerne og stromale celler i normal knoglemarv og endometriet [28], [29], [30], [31]. Desuden blev CD10 rapporteret at være en markør for kategorisering akutte leukæmier og subclassifying maligne lymfomer [32]. Nylige immunhistokemiske undersøgelser viste, at hyppigheden af positive CD10 stromal ekspression i tumorer var signifikant korreleret med prognosen for patienter med brystcancere [18] samt invasionen og metastase af gastriske cancere [19]. Ogawa et al. [31] foretaget en immunhistokemisk undersøgelse af kolorektal cancer og rapporterede, at ekspressionen af CD10 i stromale celler blev oftere fundet i invasive tumorer end i ikke-invasive tumorer. Resultaterne af disse tidligere immunhistokemiske undersøgelser er uændret i forhold til vores nuværende funktionel undersøgelse.
De foreliggende resultater viste, at knockdown af CD10-ekspression i CD10
+ fibroblaster delvist, men betydeligt, faldt den invasive evne dyrket sammen CD133
+ kolon kræftceller. Vores microarray data identificeret flere gener, der er involveret i invasionen af kræftceller, men knockdown af CD10-ekspression påvirkede ikke udtryk for disse gener. Dataene kan antyde, at CD10
+ fibroblaster har både CD10-afhængige og CD10-uafhængige mekanismer til at fremme invasionen af dyrket sammen CD133
+ kolon kræftceller, selv om yderligere undersøgelser er nødvendige for at belyse de detaljerede mekanismer disse interaktioner.
som konklusion, de nuværende funktionelle analyser tyder på, at interaktioner mellem CD133
+ tyktarmskræft celler og cancer-associeret CD10
+ fibroblaster har vigtige roller i tyktarmskræft progression. Disse interaktioner kan være lovende mål for tyktarmskræft behandlinger.
Materialer og metoder
Etik erklæring
Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Kyushu University (godkendelsesnummer, 19 -13) og udført i overensstemmelse med de etiske retningslinjer for menneskelige genom /Gene Research vedtaget af den japanske regering. Alle patienter skal have underskrevet informeret samtykke om godkendelse af brugen af deres væv til uspecificerede forskningsformål. For alle forsøg med mus, blev dyrene anbragt i laminar flow kabinetter under specifikke patogenfrie betingelser, der er godkendt af Kyushu University (godkendelsesnummer, A020-018-0).
Celler og reagenser
Humane tyktarmskræft cellelinier (DLD-1, RCM1 og Colo201) blev købt fra den japanske Collection of Research Bioressourcer (Osaka, Japan). De LoVo og Colo205 cellelinier blev opnået fra Riken (Tsukuba, Japan), og HCT116 cellelinien blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Vi etablerede 32 primære kulturer af tyktarmskræft-associerede fibroblaster afledt af resektion colontumorer fra 26 patienter som tidligere [33] beskrevet. Cellerne blev dyrket i DMEM suppleret med streptomycin (100 ug /ml), penicillin (100 U /ml) og 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fugtig miljø af 90% luft og 10% CO
2. Alle forsøgene blev udført under anvendelse af celler dyrket i medium suppleret med 10% FBS. Alle vævsprøver blev opnået på tidspunktet for kirurgi ved Institut for Kirurgi I, Kyushu University Hospital (Fukuoka, Japan). Erfarne patologer udført histologiske undersøgelser af alle væv støder op til prøverne.
5-Fu og DOX blev venligst stillet til rådighed af Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan) og Nippon Roche K.K. (Kamakura, Japan), hhv.
Flowcytometri
Vævsprøverne blev vasket grundigt med phosphatpufret saltvand (PBS), hakket i ca. 1 mm
3 terninger med en saks og dissocieret til enkelte celler ved fordøjelse med collagenase (Wako Pure Chemical Industries). De dissocierede celler blev passeret gennem et filter. Primære celler afledt af de operativt fjernede væv og dissocierede DLD-1-celler blev suspenderet i iskold 1% FBS i PBS ved 1 × 10
6 celler /100 pi. Hver suspension blev inkuberet med et antistof på is i 40 min. De mærkede celler blev analyseret under anvendelse af et EPICS ALTRA flowcytometer (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) udstyret med to lasere, der er fastsat excitationsbølgelængder på 488 nm for fluorescein (FITC), phycoerythrin (PE) og propidiumiodid (PI) signaler og 635 nm for de allophycocyanin (APC) signaler. De resulterende emissioner fluorescens blev indsamlet ved hjælp båndpasfilter sæt ved 525 ± 15 nm for FITC, 575 ± 10 nm for PE, 610 ± 12 nm for PI og 675 ± 25 nm for APC. EXPO32 flowcytometri software (Beckman Coulter Inc.) blev anvendt til at kvantificere de fluorescenssignaler og fastsætte de logiske elektroniske-gating parametre. De primære antistoffer anvendt til FACS analyser er anført i tabel S2. Salg
QRT-PCR Salg
Totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede og /eller sorterede celler under anvendelse af en High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics , Mannheim, Tyskland) med DNase i (Roche Diagnostics) behandling, i henhold til producentens anvisninger. Vi har designet specifikke primere (tabel S3) og udførte BLAST søger at sikre de særlige forhold disse primere. Et-trins QRT-PCR blev udført under anvendelse af en QuantiTect SYBR Green Reverse Transcription-PCR-kittet (Qiagen KK, Tokyo, Japan) og en Chromo4 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) som beskrevet tidligere [ ,,,0],34]. Hver prøve blev kørt tredobbelt, og ekspressionen af hvert gen blev præsenteret som forholdet mellem ekspressionen af hvert målgen mRNA, og som af
18S rRNA
.
CD10
siRNA’er
Inhibering af
CD10
genekspression blev opnået ved RNA-interferens med siRNA’er mod
CD10
(siRNA-1: sense, 5′-GGUUGAAUUUCACAAAUGATT-3 ‘, antisense, 5’-UCAUUUGUGAAAUUCAACCAG-3 ‘; siRNA-2: sense, 5′-GUGUGGUGUGGAACCUAUATT-3′, antisense, 5’-UAUAGGUUCCACACCACACCT-3 ‘; Qiagen, Poison Information center Mainz, Tyskland) som beskrevet tidligere [35].
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.