PLoS ONE: Automatiseret Whole Animal Bio-Imaging analyse for human Cancer Udbredelse

Abstrakte

En kvantitativ bio-imaging platform er udviklet til analyse af spredning kræft hos mennesker i en kortsigtet hvirveldyr xenotransplantation assay. Seks dage efter implantation af cancerceller i zebrafisk embryoer, automatiseret billeddannelse i plader med 96 brønde koblet til billedet analysealgoritmer kvantificerer breder sig i hele værten. Fund ved denne model korrelerer med adfærd i langsigtede gnaver xenograftmodeller for paneler af poorly- versus højt maligne cellelinjer afledt af bryst-, tyktarms- og prostatakræft. Desuden kræftceller med spredte mesenkymale egenskaber viser højere udbredelse kapacitet end celletyper med epitelial udseende. Desuden etablerer RNA-interferens af metastase-suppressor rolle for E-cadherin i denne model. Denne automatiske kvantitative hele dyret bio-imaging-analysen kan tjene som en første-line

in vivo

screening skridt i den anti-cancer drug target discovery pipeline

Henvisning:. Ghotra VPS, han S, de Bont H, van der Ent W, Spaink HP, van de Water B, et al. (2012) Automated Whole Animal Bio-Imaging analyse for human Cancer Udbredelse. PLoS ONE 7 (2): e31281. doi: 10,1371 /journal.pone.0031281

Redaktør: Laurent Renia, Agenturet for Videnskab, Teknologi og Forskning – Singapore Immunologi Network, Singapore

Modtaget: August 2, 2011; Accepteret: 4 januar 2012; Publiceret: 8 februar 2012

Copyright: © 2012 Ghotra et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den hollandske Cancer Society (UL-2010-4670) og EU FP7 ZF Kræft-projektet (HEALTH-F2-2008-201439). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

traditionelle anti-cancer narkotika skærme er udført ved hjælp af cellelinjer dyrket i 2D kultur eller bruge

in vitro

protein bindingsassays. Cancer progression, er imidlertid en kompleks proces af dynamiske interaktioner mellem cancerceller og organismen, der involverer genetiske ændringer, der fører til dereguleret overlevelse og proliferation, angiogenese, invasion og metastase [1]. Ideelt set er gener, der spiller en rolle i denne proces identificeres ved

in vivo

ablation eller lyddæmpning. Selvom genetiske musemodeller for kræft og human tumor celle xenotransplantation modeller i gnavere fortsat vigtig, sådanne systemer er dyre, langsomme, og mindre modtagelige for high-throughput analyser for cancer drug target opdagelse. Der er et klart behov for at udvikle hurtige, semi-automatiske

in vivo

systemer til medium til high-throughput screening applikationer i præklinisk target opdagelse og bly sammensatte identifikation.

I denne forbindelse zebrafisk ( ZF) tilbyder en række unikke fordele for undersøge de mekanismer, der driver kræft dannelse og progression. ZF er hvirveldyr, der kan rejses i stort tal i en omkostningseffektiv måde. En næsten komplet genomsekvens afslører, at de fleste cancerceller gener og tumorsuppressorgener er stærkt konserverede mellem ZF og mennesker (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish) og ZF formular spontane tumorer med tilsvarende histopatologisk og genekspressionsprofiler som humane tumorer [2] – [4]. Vigtigere, xenotransplantation med humane cancerceller er mulig [5], [6]. ZF embryoner, der anvendes til dette formål mangler et adaptive immunsystem, hvilket øger succes xenotransplantation mens de giver et mikromiljø hvor humane tumorceller prolifererer, migrerer, formular tumormasser, og stimulerer angiogenese [5] – [8].

ZF embryoner er særligt nyttige til semi high-throughput mikroskopisk analyse platforme, som de er gennemskinnelige, og kan opretholdes i 96 brønds plader. Den optiske gennemsigtighed i ZF tilbyder spændende forskningsmuligheder tillader visualisering af metastatiske proces ved høj opløsning [8], [9]. Nylige resultater viser, at en lang række farmaceutisk aktive forbindelser ulovlig fysiologiske reaktioner i ZF embryoner og inhiberer sygdomsudvikling ligner virkninger i mammale systemer [10] – [12]. Disse resultater understreger potentialet for en ZF embryo xenotransplantation model, der anvendes i anti-cancer drug discovery proces. Men på dette tidspunkt, ved hjælp af ZF til at screene for kræft relevant stof – og gen-mål er begrænset af mangel på omfattende automatiserede bioassays. Her har vi anvendt automatiseret billedbehandling og billedanalyse procedurer til en ZF xenotransplantation model til at udvikle den første semi-automatiske hele organismen kvantitativ bio-imaging analyse til at analysere udbredelsen af ​​cancer i en hvirveldyr.

Resultater

Vi udviklede en noninvasiv, kvantitativ hele dyret Bioimaging fremgangsmåde til formidling af xenotransplanted humane cancerceller i ZF embryoner i 96-brønds format. Alle trin er kort skitseret i figur 1.

(A) blommesækken implantation af CM-Dil mærkede tumorceller i Tg (Fli: EGFP) ZF embryoner 2 dage efter befrugtningen. (B) Formaldehyd fast 6 dpi embryoner opstillede i plader med 96 brønde. (C) Automatiseret erhvervelse billedet ved hjælp CLSM platform udstyret med bevægelige scene indfanger flere Z stakke pr embryo hjælp 488 og 561 nm laser linjer. (D og E) Automatiseret oprettelse af udvidet dybde sammensatte billeder. (F) Flere udvidede dybde billeder skildrer embryoner liggende i forskellige laterale orienteringer. (G) Automatiseret ensartet omlægning af billeder. (H) Scatter plot repræsenterer tumorfoci byrde i flere embryoer tilhører en eksperimentel betingelse.

Automatiseret billedoptagelse og forbehandling

CMDiI-mærkede tumorceller blev injiceret i blommen sac af 2 dage gamle Fli-EGFP embryoner [13] og faste 6 dage efter implantation (dpi) (figur 1A). Faste embryoner blev klædt i 96 godt glas bundplader til automatisk imaging ( 5 minutter per plade) (Figur 1B). Epi-fluorescensmikroskopi ikke har kunnet påvise disseminerede tumorceller på grund af overdreven baggrund fra den primære tumormasse. Derfor bruger en konfokal laser-scanning-mikroskop (CLSM) kombineret med en automatiseret stadium; multiple z stakke pr embryo blev fanget for hver brønd i en fuldautomatisk procedure (fig 1C, 1D og video S1). Konfokal billeder blev automatisk konverteret til udvidet dybde sammensatte billeder (Figur 1E), der blev omarrangeret til en ensartet orientering (figur 1F og G) at give mulighed for automatiseret kvantitativ billedanalyse (figur 1 H).

Automatiseret multiparametric analyse af kræft formidling celle

Efter at have fastsat betingelser for automatiseret billedbehandling og image pre-behandling af tumor celle implanteret ZF embryoner; vi efterfølgende udviklet en algoritme til automatisk analyse af tumor foci byrde i de efterbehandlede ZF billeder. Til dette blev Image-Pro baseret software udviklet, der udføres væsentlige tre hovedfunktioner (se materialer og metoder afsnit for detaljerede oplysninger om makroens).

1)

Omlægning af billederne (figur 2): alle embryoner blev automatisk omlagt til en vandret orientering, med hovedet mod højre og blommesækken mod bunden.

2)

Bestemmelse af injektionspositionen af ​​mærkede tumorceller (figur 3A-C): injektionspositionen blev beregnet ud fra billeder baseret på den segmenterede GFP kanal (og bekræftet ved visuel inspektion ved hjælp af røde kanal).

3)

Påvisning af tumor foci (figur 3D og E):. Den røde kanal blev segmenteret ved hjælp af en intensitet tærskel og minimum og maksimum område filtre

(A) Udvidet dybde billede af 6 dpi ZF foster. (B) Grå værdi billede fra en kombination af grønne og røde kanaler. (C) Sløret grå billede efter anvendelse lukning filter til at optimere bestemmelsen af ​​omrids. (D) Embryo segmenteret efter anvendelse tærskel intensitet og område filter. Arrowhead indikerer en rød objekt uden for skitse, der er udelukket fra segmentering. (E) Beskåret billede med kun valgte objekt. (F) Embryo roteres af x ° i vandret nyorientering. (G og H) Bestemmelse af x-position værdien af ​​midten af ​​massen (

cm

) og centrum af tyngdepunkt (

cc

). (I) Horisontal flip af billedet, hvis

cm

er på venstre side af

cc

, hvilket resulterer i billeder med hovedet af embryoet altid til højre side. (J) Billede efter anvendelse lukket filter til den kombinerede grøn og rød kanal for at få omridset af embryoet. Punkt liggende ved 75% afstand fra den yderste venstre af embryonet omrids beregnes. Y-aksen er trukket på denne X-position fra øverste til nederste omrids. Øvre rektangel 1 trækkes. (K) Nederste rektangel 2 trækkes. (L) Lodret flip af billedet, hvis rød intensitet i rektangel 1 er højere end i rektangel 2. (M) Skematisk fremstilling af beregninger for trin E-I. Alt i alt er denne procedure resulterer i billeder, hvor hovedet er på højre og blommesækken er i bunden af ​​billedet. Scale bar = 200 um i E og I.

(A) Udvidet dybde billede af 6 dpi fast embryo efter justeringen. (B) Embryo skitse fra segmenteret GFP kanal og Y-akse, der skærer X-aksen ved 75% fra yderst til venstre. (C) Beregnet injektion punkt ved 75% afstand fra den yderste venstre 75% fra toppen Y-position. (D) Segmenteret røde kanal viser tumor foci byrde i embryoet. (E) Identificerede tumor foci. (F) Flere parametre for tumor foci byrde beregnes pr embryo. Hvert tal i billedet svarer til en tumor fokus. (G) Tumor foci formidling i en enkelt embryo repræsenteret som scatter plot (koordinater 0,0 repræsenterer beregnet injektionsstedet). (H) Kombineret punktdiagram viser foci formidling tumor fra 39 injicerede embryoner. (I) Kvantificering af akkumulerede distance (CD). Hver fyldte torv repræsenterer kumulativ afstand fra injektion punkt i alt identificeret tumor foci i en enkelt embryo. Mean kumulative afstand (MCD) i de 39 injicerede embryoner i dette eksperiment er 15024 um. Scale bar = 200 um i A.

Data blev eksporteret til excel og flere numeriske parametre blev beregnet til at beskrive tumor celle byrde pr embryo. Disse omfattede samlede antal tumorfoci, gennemsnitlig afstand på tumorfoci fra injektionsstedet, og kumulative distance fra injektionsstedet (fig 3F). Som kun den kumulative distance parameter kombineret antal formidlede celler med deres afstand fra injektionsstedet, vi ræsonnerede, at denne parameter bedst afspejlede formidling tumor kapacitet (figur S1). Data blev repræsenteret som grafer, der viser positioner af tumor foci i forhold til indsprøjtningsstedet (på koordinater x, y = 0,0) for hver embryo (figur 3G) eller alle embryoner af en enkelt eksperimentel betingelse (figur 3H). Ud fra disse data blev kumulative afstand fra alle detekterede tumorfoci beregnes pr embryo (CD) og efterfølgende gennemsnit for alle injicerede embryoner i én eksperimentel gruppe som en endelig kvantificering af spredning af tumorceller (middel kumulativ afstand (MCD) (figur 3I og S1) .

vi udførte eksperimenter for at bestemme det tidligste tidspunkt, der tillod robust forskelsbehandling mellem dårligt aggressive og meget aggressive cellelinjer Brug LNCaP og PC3 som et sådant eksempel for prostatakræft [14] – [19]. vi observeret nogen forskel ved 2 dpi; MCD of PC3 kunne skelnes fra MCD af LNCaP ved 4 dpi og ved 6 dpi var markant højere i PC3 sammenlignet med LNCaP med stærke betydning (figur 4) Derfor blev 6 dpi valgt til analyse i hver MCD. yderligere eksperimenter.

(A og B) LNCaP (A) eller PC3 celler (B) blev implanteret og embryoner blev fastsat til 2, 4 eller 6 dpi for imaging (immunofluorescens billeder og automatiseret billedanalyse (scatter plots )). nederste række billeder (skala bar = 50 um) viser zoom-in på området markeret med stiplet linie i øverste række billeder (skala bar = 100 um). (C) CD ved 2, 4 og 6 dpi for LNCaP (grå) og PC3-injicerede embryoner (sort) beregnet ud fra scatterplots i A og B, hhv. Statistisk test for forskellen mellem LNCaP og PC3 på forskellige dpi er indiceret. * P 0,05, *** p. 0,001

For at karakterisere tumor foci identificeres ved denne metode, vi beregnet den gennemsnitlige diameter af segmenterede røde objekter i halen region PC3 implanterede embryoner. Den gennemsnitlige middeldiameter var -15 um med nogle større objekter op til ~45 um men ingen objekter med gennemsnitlig diameter 8 um blive udvalgt til analyse, montering med identifikationen af ​​de enkelte tumorceller eller små klynger (figur 5A). Vi yderligere analyseret identificeret tumor foci ved høj opløsning billeddannelse, 3D-rekonstruktion, og overfladen rendering (figur 5B og video S2). Dette bekræftede og udvidede konstateringen at enkelte tumorceller eller små klynger blev identificeret ved den automatiserede billedanalyse og viste tumorceller interagerer med værten vaskulatur (figur 5B). For at udelukke artefakter på grund af CMDiI mærkning, vi injicerede mCherry mærkede PC3 celler. I fuldstændig aftale med egenskaberne af røde objekter, der identificeres efter injektion af CMDiI-mærket PC3, blev der observeret enkelte PC3-mCherry celler i tæt samarbejde med vært blodkar (figur 5C og video S3). Endelig forsøg med unimplanted embryoner (figur 6a) og sammenligning af CM-Dil-mærkede PC3 celler injiceret i standard Fli-EGFP eller Casper Fli-EGFP embryoner mangler alle pigmenter (Figur 6B og C), udelukkes eventuelle falske positiver på grund af autofluorescens af pigment celler.

(A) Kvantificering af middeldiameteren af ​​makro identificerede tumorcelle foci fra halen region PC3-injicerede embryoner. Data fra 5 embryoer. (B) Høj opløsning billeddannelse af CM-Dil-mærkede PC3 tumor celle foci. (B1) Makro-identificerede PC3 tumor celle foci. (B2) Zoom-in på området angivet i

B

1 viser tumorceller i forbindelse med host kar. (B3 og B4) Tre dimensionel rekonstruktion og overflade gengivelse af areal i insert på B2; pilespidser peger på tumorceller dels inde distale langsgående anastomotiske fartøj (Video S2 og S3). (C) Høj opløsning billeddannelse af PC3-mCherry tumor celle foci. C1-4, som B1-4 for PC3-mCherry. Scale bar er 100 um i B1 og C1; 50 um i B2 og C2; 15 um i B3 og C3; 10 um i mellemværker i B3 og C3; 5 um i B4 og C4.

(A-C) I hvert tilfælde øverst til venstre billede viser grønt signal (Fli-EGFP) og øverste højre billede viser rødt signal for tumorceller. Bottom billeder viser zoomer af indrammede område i øverste venstre billede giver grønt (venstre) og rødt signal (i midten) og transmitteret lys (højre). Scale bar er 100 um i billeder, der viser hele embryo og 50 um i zoomede billeder. (A) Ikke-implanterede Fli-EGFP embryo afbildet på 8 dage efter befrugtning. Antallet af ikke-implanterede embryoer og antal tumorceller (falsk) detekteres af automatiseret billedbehandling og billedanalyse metode er angivet ved den højre. (B) Fli-EGFP embryo implanteres med CM-Dil-mærkede PC3 afbildet ved 6 dpi. (C) Fli-EGFP Casper embryo implanteres med CM-Dil-mærkede PC3 afbildet ved 6 dpi.

Tilsammen denne metode eliminerer behovet for visuel scoring og muliggør automatiseret generering og arkivering af billeder og numeriske data, der beskriver udbredelsen af ​​tumorceller hos et hvirveldyr organisme. Desuden for tumorceller identificeret ved denne automatiserede bio-imaging assay, tumor-vært interaktioner kan yderligere undersøgt i detaljer ved høj opløsning mikroskopi

Validering:. Korrelation med adfærd i musemodeller og epitelial versus spredte fænotype

for at demonstrere anvendeligheden af ​​vores automatiske platform til at skelne mellem dårligt aggressive og meget aggressive kræftceller, blev analyseret tre forskellige paneler af cellelinier:

1) Hus til prostatakræft, PC3 (stærkt metastatisk i musemodeller, prostatacarcinom /knoglemetastaser; androgenuafhængig; spredt vækst i 2D kultur mesenchymale markører) og LNCaP (meget dårligt metastatisk i musemodeller, prostatacarcinom /lymfekirtel; ekspression af prostata differentieringsmarkører; epiteliale øer i 2D kultur; epiteliale markører) blev analyseret [14] – [19].

2) Hus Til brystkræft, BT474 (metastatisk i musemodeller, bryst invasive duktalt karcinom /kanalen ER + /PR + /p53mutated; høj Her2 udtryk “svagt luminale epitel som” fænotype i kultur reduceret ekspression af epitelial markører) og MCF7 (meget svag metastatisk potentiale i fravær af ektopisk udtrykte onkogener; brystadenocarcinom /pleural effusion; ER + /PR + /p53 normal; lav Her2; epiteliale øer i 2D kultur epiteliale markører) blev analyseret [20] – [23 ].

3) Hus Til kolorektal cancer, SW620 (kolorektal adenocarcinom Dukes ‘type C /lymfeknude metastaser, spredte vækst i 2D kultur mesenkymale markører) og HT29 (kolorektal adenocarcinom /colon; epiteliale øer i 2D kultur; epitelial markører ) blev analyseret [24]. Slående, for hver kræft typetestet, formidling i denne ZF xenograft assay signifikant korreleret med metastatisk kapacitet rapporteret i musemodeller og /eller karakteristika vides at være forbundet med kræft progression herunder differentiering markører eller epitelial versus spredte fænotype (figur 7A og B, figur S2 ). Disse data validere denne kortsigtede automatiseret bio-imaging-metoden, og vise, at det er et effektivt redskab til at forudsige aggressivitet af kræftceller i mere komplekse, langsigtede

in vivo

systemer.

( A) Scatter plot repræsentation af celle formidling tumor for indikeret prostata (

øvre

grafer), bryst (

midterste

), og kolorektale cancer cellelinjer (

lavere

grafer). Antallet af injicerede embryoner fra 2 biologiske replikater er indikeret. (B) MCD fastlægges ud fra data, der er repræsenteret i A. Data er præsenteret som middelværdi ± S.E.M. * P 0,05, *** p 0,001. (C) 6 dpi embryo injiceret med PC3 viser tumor foci byrde bestemmes ud fra segmenteret røde kanal (

venstre

), og repræsenteret som scatter plot (

rigtige

). (D) Automatiseret bestemmelse af region for udelukkelse af tumor foci omkring implantationsstedet og i området af intestinal udvikling (

venstre

), og den resterende tumor foci repræsenteret som scatter plot (

rigtige

). (E) MCD før (

sort og), og efter udelukkelse (

hvide søjler

) for det angivne prostata (

venstre

), bryst (

midterste

), og endetarmskræft linjer (

højre graf

). Fold forskel mellem dårligt og meget aggressive cellelinier er angivet. Data er præsenteret som middelværdi ± S.E.M. * P 0,05, *** p 0,001. (F) MCD efter udelukkelse for PC3 og MCF7 i flere uafhængige eksperimenter demonstrerer reproducerbarhed. Data er præsenteret som middelværdi ± S.E.M.

Omfattende ZF cellulær bevægelse finder sted i området af blommesækken, hvor intestinal udvikling sker inden for tidsrammen af ​​vores analyse [25]. Vi ønskede at udelukke enhver påvirkning af passiv migration af implanterede tumorceller på grund af denne udviklingsproces nær den primære implantation området. Derfor udvidede vi makroen med et yderligere trin, hvor alle tumor foci indenfor en firkant omfatter denne region blev udelukket fra analysen i en fordomsfri automatiseret måde (Figur 7C og D). Selv om dette kan føre til undervurdering af den kumulative parameter afstand, fandt vi, at denne udelukkelse skridt yderligere udvidet vinduet mellem den ikke-aggressive versus meget aggressive celletyper (figur 7E). Endvidere analyse af flere uafhængige eksperimenter under anvendelse PC3, BT474, og MCF7, vist, at denne metode er meget reproducerbar (figur 7F).

Vi udvidede analysen til en bredere panel af humane cancercellelinjer fra forskellige oprindelser, herunder prostata, bryst, lunge, colorektal, hud og bindevæv. Interessant, når disse linjer blev grupperet efter deres morfologi i 2D kultur og udtryk for epitel eller mesenkymale markører, der var en klar sammenhæng med høj udbredelse med en spredt fænotype (en bemærkelsesværdig undtagelse var HT1299, som ikke formidler effektivt); alle cellelinjer vokser som epiteliale øer havde meget lav udbredelse kapacitet (figur 8A; Tabel S1). Vi funktionelt testet rollen som en typisk markør af epitel fænotype, celle-celleadhæsion receptor E-cadherin. Til dette anvendte vi 4T1 muse brystcarcinomaceller, der besidder en mellemliggende fænotype, vokser som klynger af løst bundne celler i 2D og udtrykker E-cadherin samt nogle mesenchymale markører, såsom vimentin (figur 8B). E-cadherin blev stille resulterer i en fuldt spredt fænotype i 2D (figur 8B og C), og disse celler blev injiceret i ZF at bestemme udbredelsen kapacitet. Faktisk shRNA målrettet E-cadherin, men ikke styre shRNA stærkt øget udbredelse af 4T1 celler og den automatiske bio-imaging-metoden tilladt betydelig adskillelse mellem 4T1shCdh1 på den ene side og 4T1Wt og 4T1shCtr på den anden (figur 8D-F).

(a) MCD i et panel af humane cancercellelinjer fra forskellige oprindelser. Antallet af injicerede embryoner er angivet.

Hvide søjler

angiver cellelinjer viser en spredt fænotype i 2D cellekultur.

Sorte søjler

angiver cellelinjer vokser som epitel øer i 2D kultur.

Grå stænger

angiver cellelinjer med mellemliggende /blandet epitel /mesenkymale egenskaber. (B) 4T1 brystkræftceller vokser som øer af løst knyttet spindel-formede celler (

venstre

) og helt spredt vækst 4T1 celler efter E-cadherin dæmpning (

rigtige

). (C) E-cadherin overfladeekspression ved FACS. (D) Scatter plot repræsentation af angivne 4T1 varianter. Antallet af injicerede embryoner fra 2 uafhængige eksperimenter er vist. (E) Repræsentative billeder af embryoner injiceret med angivne 4T1 varianter. (F) MCD fastlægges ud fra data, der er repræsenteret i D. Data er præsenteret i forhold til vildtype 4T1 som middelværdi ± S.E.M. ** P 0,01. Scale bar er 200 um i E.

Alt i alt, en kortsigtet medium gennemløb fuldautomatisk hel-organisme bio-imaging model er udviklet, der adskiller med gode reproducerbarhed kræft celletyper, der vokser som øer eller har epitel markører eller har vist sig at være dårligt aggressive i musemodeller fra cellelinier, der er spredt eller har flere mesenkymale characterisitics eller vides at metastaserer i mus. Den er kompatibel med RNAi til identifikation af regulatorer af formidling kræftcelle og tillader skift fra lav opløsning hurtig billedbehandling til høj opløsning detaljeret analyse for at studere virkninger på tumor celle egenskaber eller tumor celle-vært interaktioner.

Diskussion

Her udviklede vi en kortsigtet

in vivo

ZF xenograft assay, der er kompatibel med automatiseret billeddannelse i plader med 96 brønde og koblet til fuldautomatisk analyse af spredning af tumorceller. Dette assay er den første automatiseret hele organismen Bioimaging assay i et hvirveldyr, der giver mulighed for at studere aspekter af cancer progression. Vores resultater viser, at dette assay nøje afspejler de opnåede resultater i dyrere og meget lavere throughput assays, såsom gnavere xenografter

ZF xenograftmodel tidligere er blevet anvendt til kræft migration undersøgelser [5] -. [9]. Der er begrænsninger for denne model, herunder potentielle forskelle i værten mikromiljø og behovet for at arbejde ved temperaturer, der er kompatible med overlevelse og migrering af mammale celler, mens på samme tid er gunstigt for normal ZF fysiologi. Ikke desto mindre har vi modificeret eksperimentelle betingelser, således at adfærden af ​​et stort panel af humane cancercellelinjer fra forskellige oprindelser ligner kendt adfærd i gnavermodeller. Desuden er vores arbejde giver denne model med automatisering i billedbehandling og billedanalyse samt med den statistiske effekt, der kræves til anvendelse i screening procedurer.

Vi leverer proof-of-principle for en sådan anvendelighed ved at teste en kendt regulator af kræftcelle migration. Ved hjælp af et panel af cellelinier viser vi, at denne imaging platform kan skelne mellem celletyper med flere epiteliale egenskaber eller vokser i øer versus dem med flere mesenkymale egenskaber eller vise en spredt fænotype). Vi kombinerer derefter analysen med RNAi til tavshed celle-celleadhæsionsmolekyle, E-cadherin. Vi hurtigt indhente data fra -90 dyr pr forsøgsgruppe i to biologiske replikater støtter hæmmende rolle E-cadherin i formidling kræft.

Tilsammen kan det relativt hurtigt medium gennemløb assay anvendes som en første

in vivo

analyse platform i målet opdagelse pipeline. Det giver automatisering og statistisk styrke til at identificere de hits fra store in vitro RNAi screening indsats, der berettiger mere tids- og penge-forbrugende studier i musemodeller. Fremtidige retninger vil omfatte indarbejdelse af tilsvarende automatiseret analyse af induktion af tumorangiogenese og tumorcelleproliferation at fange flere aspekter af cancer progression inden for denne bio-imaging-analysen.

Materialer og metoder

Cellelinjer og ZF håndtering

Alle menneskelige kræftceller blev opnået fra ATCC og dyrket i henhold til den medfølgende protokol. ZF og embryoner blevet rejst, iscenesat og vedligeholdt i henhold til standardprocedurer i overensstemmelse med de lokale regler for dyrevelfærd. Det transgene ZF linje Tg (fli1: EGFP), der udtrykker EGFP i endotelceller i vildtype eller “Casper” baggrund, blev opretholdt i overensstemmelse med standardprotokoller (https://ZFIN.org). PC3-mCherry celler blev genereret ved hjælp af en pCMV-mCherry-bc-puro-Kl201 lentiviral vektor (leveret af Dr. R. C. Hoeben, Leiden University Medical Center, Leiden NL). 4T1-shCdh1 og 4T1-shCtr celler blev genereret ved lentiviral transduktion hjælp TRC shRNA konstruktioner (Sigma)

Implantation procedure

Pattedyrceller blev mærket med lipofile fluorescerende celle tracker (CM-Dii;. Excitation maksimalt 553 nm, varenummer C7000,. Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Den mærkede Cellesuspensionen blev fyldt i borosilikatglas kanylerne (1 mm O.D. × 0,78 mm I.D .; Harvard Apparatus) og intrayolk injektioner blev udført ved anvendelse af en pneumatisk Pico pumpe og en manipulator (WPI). Dechorionated 2 dage efter befrugtning ZF embryoer blev bedøvet med 0,003% tricaine (Sigma) og anbragt på en 10 cm petriskål coatet med 1% agarose. Ved at styre indsprøjtningstryk og varigheden af ​​antallet af injicerede celler blev sat til -100 pr embryo som bestemt ved standard celletælling af injektion dråber. Injicerede embryoner blev holdt i æg vand ved 34 ° C og fikseret 6 dpi med 4% paraformaldehyd.

Automatiseret mikroskopi og høj opløsning billeddannelse

Faste embryoer blev manuelt klædt i 96 brønd glasbund plader (materiale no.655892; Greiner) med hver brønd indeholder et enkelt foster. Dette blev let gjort i 5 min per plade. Billedoptagelse blev udført ved anvendelse af et Nikon Eclipse Ti CLSM, der integrerer avanceret optik, fluorescensdetektion og scanning hardware i en enkelt platform styres af EZ C1 software. 488 og 561 nm laser lys blev brugt til at ophidse Tg (fli1: EGFP) embryoner og DiI- positive tumorceller. Serial sagittale (laterale) sektioner blev fanget 6 dpi i en automatiseret måde (14 × 30 um) med en Plan Apo 4X Nikon tør mål med 0,2 NA og 20 WD. For tre dimensionelle billeder 0,5 um trin Z stakke (1024 × 1024 brændpunktsflader, 50-74 um i dybden) blev erhvervet ved hjælp af 40 × Nikon tør plan fluor mål med 0,75 NA og 0,66 WD.

Billedanalyse software

automatiseret billede forbehandling, automatiseret analyse og 3D-rekonstruktion og overfladegengivelse blev udført af Image-Pro Plus-baseret software fra Media Cybernetics.

Udvidet dybdeskarphed

den software anvendt Z-stack farvebilleder fra konfokalmikroskop. De opnåede grå billeder var pseudo farvet med grønt for GFP og rød for CM-Dil mærkede tumorceller. En makro blev bygget, der bruger begge kanaler til batch behandling af alle billeder i en mappe. Først fra Z-stakken en enkelt, i fokus, sammensat billede blev foretaget. Pixels i Z-stakken blev analyseret. For hver position blev pixel fra flyet med den største varians eller lokal kontrast valgt. Denne pixel blev derefter brugt til det endelige sammensatte billede.

Automatiseret orientering af embryonerne (figur 2)

For billedanalyse, skal alle fostre har samme orientering. Til dette blev en makro udviklet hvor billederne blev ændret, således at alle embryoner blev horisontalt orienteret, med hovedet mod højre og blommesækken mod bunden af ​​billedet

Automatiseret vandrette justering:. Farven billede blev omdannet til en grå værdi billedet for at give en kombination af GFP og røde kanaler. Den embryo blev derefter segmenteret hjælp middelværdi intensitet histogram værdi og minimum og maksimum område filter. Derefter blev en retning værdi den segmenterede objekt bestemmes, som blev anvendt til opnåelse af embryoet vandret

Automatiseret horisontal orientering:. X-positionen værdien af ​​tyngdepunktet blev bestemt ud fra den grå kombineret GFP og røde kanaler. Hvis denne værdi var placeret venstre fra midten af ​​tyngdepunkt, blev billedet vendt vandret. I alle tilfælde er denne billede billeder, hvor lederen af ​​embryonet blev orienteret til højre

Automatiseret lodret orientering:. Fra de ydre vandrette positioner, det punkt liggende på X-aksen ved 75% afstand fra yderste venstre af embryo skitse blev bestemt. På denne X-positionen Y-aksen blev udtaget fra top til bund konturer. Et rektangel blev trukket fra -20 til +20 pixels horisontalt fra den beregnede 75% punkt og vertikalt 80 pixels over midten af ​​den øvre Y-aksen. Et andet rektangel blev trukket med identiske vandrette parametre og vertikalt 80 pixels under midten af ​​den nedre Y-aksen. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet i den røde kanal blev bestemt for begge rektangler. Hvis intensitet var højere i den øvre rektangel forhold til den nedre rektangel, blev billedet vippet lodret. Den samme procedure kunne udføres ved hjælp af GFP-kanal i hvilket tilfælde billeder blev vendt, hvis intensitet var højere i den nederste rektangel. Visuel inspektion viste, at denne procedure, i alle tilfælde resulterede i billeder, hvor blommesækken blev orienteret mod bunden af ​​billedet.

Automatiseret beregning af injektionen positionen af ​​Cy3-mærkede celler Salg

First den venstre og længst til højre X positioner af embryo skitse blev bestemt. Ud fra disse X positioner, blev et punkt liggende ved 75% fra den yderste venstre bestemt. Derefter fra denne X-positionen de øverste og nederste Y positionerne blev bestemt. Efterfølgende disse Y positionerne et punkt liggende på 75% fra den øverste Y-position blev bestemt, der blev udpeget som den vilkårlige injektion punkt.