PLoS ONE: Cancer Progression medieret af Horizontal Gene Transfer i en in vivo Model

Abstrakt

Det er kendt, at kræft skrider frem ved vertikal genoverførsel, men dette paradigme ignorerer, at DNA cirkulerer i højere organismer, og at det er biologisk aktivt ved dens optagelse af recipientceller. Her bekræfter vi tidligere observationer på evnen af ​​cellefri DNA til at inducere

in vitro

celletransformation og tumorigenese ved at behandle NIH3T3 recipient murine celler med serum fra patienter coloncancer og supernatanten af ​​SW480 humane cancerceller. Cell transformation og tumorigenese af modtagende celler ikke forekomme, hvis serum og supernatanter blev tømt af DNA. Det er også påvist, at horisontal cancer progression medieret af cirkulerende DNA sker via sin optagelse af recipientceller i en

in vivo

model, hvor immunkompetente rotter udsat for kolon carcinogenese med 1,2-dimethylhydrazin havde øget hyppighed af colon tumorer når injiceret i dorsum med humane SW480 coloncarcinomceller som en kilde til cirkulerende onkogent DNA, der kan kompenseres ved at behandle disse dyr med DNase i og proteaser. Selvom bidraget fra andre end DNA for dette fænomen forekommer biologisk aktive molekyler ikke kan udelukkes, vores resultater støtter det faktum, at kræftceller udsender i kredsløbet biologisk aktive DNA at fremme tumor progression. Yderligere udforskning af den vandrette tumorprogression fænomen medieret af cirkulerende DNA er klart behov for at afgøre, om dens manipulation kunne have en rolle i behandlingen af ​​kræft

Henvisning:. Trejo-Becerril C, Pérez-Cárdenas E, Taja-Chayeb L , Anker P, Herrera-Goepfert R, Medina-Velázquez LA, et al. (2012) Cancer Progression medieret af Horizontal Gene Transfer i en

In Vivo

Model. PLoS ONE 7 (12): e52754. doi: 10,1371 /journal.pone.0052754

Redaktør: Brian Lichty, McMaster University, Canada

Modtaget: 23, 2012; Accepteret: 20. november 2012; Udgivet: December 28, 2012 |

Copyright: © 2012 Trejo-Becerril et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af CONACYT giver 34.649-M, 50.699 og fra PAPIIT UNAM IN214902. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesse. Medforfatter Phillipe Anker er tilknyttet OncoXL. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Den nuværende paradigme i kræft progression er, at det forekommer via lodret genoverførsel; dette betyder, at afkom af initiering tumorcelle arve de genetiske og epigenetiske ændringer, der fører til tumorudvikling. Denne model er imidlertid overser, at horisontal eller lateral overførsel af DNA forbinder og former næsten alle levende ting [1], og at der inden for en organisme, cirkulerende DNA, såsom exosomer der indeholder transkriptionelt aktiv mRNA og microRNA, potentielt kan fungere som en endokrin eller parakrin messenger, i stand til at påvirke funktionaliteten af ​​modtagernes celler [2]. Følgelig er det blevet foreslået, at cellefri DNA (cirkulerende DNA) kunne deltage i udviklingen af ​​metastaser via “passive” transfektion-lignende optagelse af sådanne nukleinsyrer ved modtagelige celler [3]. I 1994, Anker et al., Først påvist, at supernatanten af ​​dyrkede coloncancercellelinie SW480 kunne omdanne modtagende udødelige murine NIH3T3-celler, som giver muterede human

K-ras

[4]. Transformation af disse recipientceller ved plasma fra patienter med tyktarmskræft er blevet rapporteret såvel [5].

Evnen af ​​genetisk materiale til at cirkulere i eukaryoter har været kendt siden 1948 [6], og at dette DNA kan være udgivet af bakterier og højere organismer og indgå recipientceller blev demonstreret af Anker og Stroun [7] – [9]. Disse fund førte til det koncept, at DNA kunne fungere som en budbringer [10] – [16]. Dette synspunkt er blevet støttet af den lethed, hvormed administreret bakterie- og eukaryote DNA kan cirkulere frit i hele dyre- og plantearter organer og i sin evne til at indtaste individuelle celler naturligt, hvor det kan finde i host cellekerner [12], [17] – [18]. Optagelsen af ​​cirkulerende DNA ved eukaryoter viser, at biologien af ​​de modtagende celler /organismer kunne modificeres, uanset om det er integreret eller ej [19] – [27]

Det er bemærkelsesværdigt, at en sådan DNA administration gør. kræver ingen særlige køretøjer, f.eks, liposomer, elektroporation, og gen-kanoner, for at hjælpe indrejse i celler, for at det at være biologisk aktiv. Hvor genetiske materiale cirkulerer og overførsler i somatiske celler i højere organismer er fortsat kontroversiel. Selvom dette ikke udelukker hinanden, har nogle forfattere demonstreret, at dette sker via optagelsen af ​​apoptotiske legemer [28], mens andre har karakteriseret cirkulerende DNA som et kompleks af DNA /RNA-lipoprotein betegnet “virtosome”, der spontant frigives af levende celler [29]. Her demonstrerer vi, at cirkulerende DNA er i stand til at køre vandret tumor progression i en immunkompetente colon-carcinogenese rotte model.

Materialer og metoder

cellelinier

SW480 (human tyktarmskræft cellelinje, der har punktmutationen Gly til Val ved kodon 12 i exon 1 i

K-ras Salg onkogen), HeLa (human cervical cancer cell line var positive for HPV-18), og NIH3T3 (mus udødeliggjort fibroblaster ) blev erhvervet fra American Type Culture Collection. Primær kultur af forhudsfibroblaster (BB1) blev afledt fra omskæring forhud af nyfødte dreng under skriftlig tilladelse fra sin far og bruges i den anden passage.

Supernatant Forberedelse

Når cellekulturer havde et sammenløb af 80% blev supernatanter opsamlet ved pipettering og renset for eventuelle resterende celler og cellerester ved centrifugering ved 400 ×

g

i 20 min (Biofuge primo R, Heraeus) og ledes gennem en 0,45-um filter ( Sartorius, 16555) for at fjerne potentielt kontaminerende celler. Portioner af hver supernatant prøver blev podet i en dyrkningskolbe og inkuberet ved 37 ° C i 120 timer for at verificere fravær af levende celler. Til DNA-analyse blev 50 ml af supernatanten opkoncentreret, først med et ultrafiltreringssystem med en 40 kDa-membran pore (Amicon, omrørt ultrafiltreringscelle, model 8010) og derefter med en hastighed vakuumanordning (Vacufuge Plus, Eppendorf) op til 10 ml. Den koncentrerede supernatant blev straks kryopræserveret ved -80 ° C.

enzymatisk nedbrydning af de Forarbejdede Supernatanter

Halvtreds ml af de forarbejdede supernatanter fra SW480 (SW) og NIH3T3 (NH) blev inddelt i 12,5 ml alikvoter og inkuberet med proteinase K og /eller DNAse I som følger: 1) SW + DNAse I; 2) SW + proteinase K; 3) SW + DNAse I + proteinase K, og 4) uden enzym. Kontrolsekvenserne fordøjelser var DMEM + 2% FBS + laksesperm-DNA, og b) DMEM + 2% FBS + laksesperm-DNA + DNAse I. Fordøjelse blev udført med 1,5 enheder (50 ug) af proteinase K per mg samlet protein indeholdt i supernatant i 60 minutter ved 37 ° C efterfulgt af inaktivering ved 80 ° C i 20 min. For DNAse I, enzymkoncentration var 12 enheder (3,6 Kunitz) pr 12 ug DNA-indholdet i supernatanten i 60 minutter ved 37 ° C og derefter inaktivering ved 65 ° C i 15 min. Spaltning med begge enzymer blev udført med den samme koncentration og gange, men fordøje først med proteinase K og derefter DNAse I. Efter enzymatisk fordøjelse blev supernatanten anvendt til “passiv” transfektion som angivet ovenfor. Nedbrydning af proteiner og /eller DNA blev verificeret ved gelelektroforese.

Serum og forberedelse

Sera blev udvundet fra blod af tre patienter med fremskreden kræft i tyktarmen og raske forsøgspersoner. Blod blev opnået fra perifer vene i to vakuumbeholderrør (Becton Dickinson, 368162) indeholdende koagel-aktivering additiv og en barriere gel for at isolere serum. Blodet blev holdt ved 4 ° C og behandles inden for 2 timer og centrifugeret ved 1000

× g

i 20 min (Biofuge Primo R, Heraeus) ved stuetemperatur; serum blev opsamlet og ført gennem et 0,45 um filter (Sartorius, 16555) for at fjerne celler. Blodprøver blev opnået med skriftlig tilladelse fra kilde patienter.

Passive Transfektion af Mouse NIH3T3 Celler

NIH3T3 celler -as modtager for omdannelsen assays- blev udsået i 24-brønds plader og udsat for menneskelig serum eller supernatanter SW480 (spaltet eller ikke) i et 01:01 forhold (DMEM med 2% FBS /serum eller supernatant) i 14 dage, forfriskende medierne hver 24 timer [4]. Efter 14 dages eksponering (kun syv dage i plader udsat for serum), blev cellerne dispergeret og opformeret under standardbetingelser. Derefter blev de eksponerede celler analyseres for tilstedeværelsen af ​​muteret humant

K-ras

sekvenser ved PCR, RT-PCR og sekvensering. Eksperimenter blev udført ved triplikater.

Aktiv transfektion (Lipofectamin)

En dag før transfektion NIH3T3-celler blev podet ved en densitet på 1 x 10

5 celler per brønd (seks brønde plader) i 500 pi vækstmedium uden antibiotika (DMEM). Transfektioner blev udført under anvendelse 5 ug DNA (enten genomisk DNA eller supernatant DNA fra SW480-celler plus 0,5 ug plasmid (pEGFP-CMV) Lipofectamine transfektioner blev udført efter producentens anvisninger (Invitrogen ™, LTX .. Plus Reagent) Celler blev inkuberet ved 37 ° C i 24 timer; mediet var opdateres og udvælgelsen G418 blev startet for at få stabile transfektanter

transformation assays

NIH3T3 der blev passivt transficeret blev anvendt til at udføre de transformation assays som kontrol.. vi bruges NIH3T3 celler udsat for serum fra en rask donor og til deres egen supernatant. de egenskaber, som anvendes som indikatorer for malign transformation var morfologiske ændringer (dannelse fokus), forankringsuafhængig vækst (vækst i blød agar), og tumorigenicitet [30] .

morfologisk analyse

transficerede NIH3T3 celler blev undersøgt for foci dannelse og talt under fase-kontrast mikroskopi.

vækst af celler i blød agar

foci blev isoleret fra plast dyrkningsplader og udvidet til blød agar analyse. Efter trypsinitation celler blev suspenderet i DMEM-medium indeholdende 0,3% ædelt agar og 15% FBS. Et lag af denne suspension blev udpladet på toppen af ​​et lag af medium indeholdende 0,7% agar uden serum. Celler blev udpladet ved en densitet på 5 x 10

5 celler pr 10 cm skål. Kolonier blev scoret efter 14 dages dyrkning (en koloni blev defineret som hvis de er indeholdt mindst 50 celler).

I

in vivo

Eksperimenter

tumorigenese assays blev udført i 6 -Uge gamle athymiske BALB /c (nu /nu) hunmus (Harlan Laboratories). I alle eksperimenter blev grupper på seks mus injiceret subkutant med 2 millioner celler suspenderet i 100 pi af FBS-frit DMEM. Tumorvækst blev overvåget i og registreret ugentligt. Tumorstørrelse blev målt med en elektronisk skydelære og størrelse-volumen estimeres ved hjælp af formlen a × b

2 × (π /6) = V (mm

3) (a = større diameter b = mindre diameter og V = volumen). I forsøg på at vurdere tumorigenese evne supernatant af HeLa-celler i umanipulerede dyr, blev 6 uger gamle athymiske BALB /c (nu /nu) hunmus også anvendes. Dyr blev injiceret dagligt ved intraperitoneal vej med 500 pi supernatant af HeLa-celler i 30 dage. På dag 31 blev dyrene aflivet. Athymiske Hsd: RH-

Foxn1

RNU

hunrotter og immunkompetente Hsd: Wistar hunrotter samt (Harlan Laboratories) blev injiceret med apoptotiske legemer fra HeLa-celler, som blev opnået efter eksponering høj dosis for 24 timer til cisplatin ved 75 uM. Fritstående celler blev høstet og centrifugerede skridt på 400 ×

g

i 10 min (Biofuge primo R, Heraeus) i PBS tre gange for at fjerne eventuelt resterende cisplatin. Injektioner af apoptotiske legemer blev gjort hver anden dag ved intravenøs injektion i halen i et totalt volumen på 100 pi normalt saltvand. Behandling varede i 60 dage. På dag 61 blev rotterne aflivet, og nekropsi udført til makroskopisk evaluering tumordannelse. Vigtige organer (lever, milt, nyre, lunge og uterus) blev forarbejdet til H ii) subkutan injektion af 1 x 10

6 SW480 celler (fortyndet i 100 pi normalt saltvand) i flanken dag 28 og 49 af DMH behandling; iii) colon kræftfremkaldende DMH ved intraperitoneal vej i 20 uger som rapporteret [31]; iv) regime af DMH plus SW480 celler; og v) som gruppe iv plus DNAse I /protease behandling, som bestod på DNAse I i en dosis på 2,3 mg /kg ved intramuskulær injektion og en blanding af proteaser (trypsin, chymotrypsin, og papain) ved intraperitoneal injektion i doser på 10 mg /kg, 10 mg /kg og 25 mg /kg henholdsvis som rapporteret i [32]. Både DNAse I og proteaser mix blev fortyndet i 100 pi normalt saltvand. Injektioner blev administreret dagligt undtagen weekenderne fra uge 4 til 12. Gruppe vi modtog DMH + DNAse I /proteaser. Efter evaluering med micro PET-CT (som beskrevet nedenfor), blev dyrene aflivet og obduceret 6 måneder efter endt de 20 ugers kræftfremkaldende (DMH)

For at vurdere skæbnen for humane SW480 celler injiceret i immunkompetente dyr Hsd.: Wistar 6 uger gamle hunrotter (Harlan Laboratories) blev subkutant injiceret med 10-millioner SW480 celler i flanken og aflivet på dag 1, 2, 3, 7 og 14 efter injektion for at fjerne injektionsstedet og forarbejdet til rutinemæssig H E histologisk analyse. Etiske godkendelser blev opnået fra Institutional Research Ethics Board og Animal Care udvalget.

Micro PET-CT

Tumor dannelse i dyrene blev overvåget ved hjælp af molekylær billeddannelse teknikker med en mikro PET-CT (Albira ARS, Oncovision) og

18F-FDG. Tumorovervågningssystem blev udført ved uge 15 og 24 efter behandlingens start (DMH). For at kvantificere tumor aktivitet, blev standard optagelse værdi (SUV) beregnet udnytte Albira systemet softwareværktøjer (Carestream Molecular Imaging, CT, USA). SUV er et kvantitativt værktøj til PET-CT-undersøgelser, der giver mulighed for bestemmelse af

18F-FDG-koncentration i en bestemt region af interesse (dvs. tumor aktivitet). Tumor tilstedeværelse blev defineret, da SUV (tumor /lever) forholdet var ≥1.5.

Tissue Forberedelse og Mikrodissektionsteknikker

De formalinfikserede, paraffinindlejrede colon tumorer (en af ​​hver gruppe) fra hver gruppe af DMH-behandlede rotter blev skåret i 5-um-tykke sektioner på en mikrotom med en disponibel klinge. For mikrodissektion blev snit afparaffineret i to skift af xylen i 10 min, rehydreret i 100% ethanol, 90% ethanol, og 70% ethanol i 5 minutter hver, farvet med hematoxylin og eosin (H

E6

(5 ‘gggggatccatggcgcgctttgaagatccaaca-3′, og 3’-ggggaattcttatacttgtgtttctctgcgtcg-5 ‘), 450 bp amplikon;

E7

(5′-cccgacgagccgaaccacaac-3 ‘, og 3′-gggatgcacaccacggacacac-5’), 300 bp amplikon; menneske

DHFR

(5′-agaaccaccacgaggagc-3 ‘, og 3′-acagaactgcctccgactatc-5’), 120 bp amplikon; human

actin

(5′-ggagtcctgtggcatccacg-3 ‘, og 3′-ctagaagcatttgcggtgga-5’), 320 bp amplikon. Menneskelig

RAB30

(5′-gtccattacccagagttactaccg-3 ‘, og 3′-gaccttgttgctggcatattgttc-5’), 130 bp amplikon;

Alu Yd6

(5′-gagatcgagaccacggtgaaa-3 ‘, og 3′-ttgctctgaggcagagttt-5’), 200 bp amplikon [33].

En indledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter blev efterfulgt af 40 cyklusser af amplifikation og en afsluttende forlængelsestrin 5 min ved 72 ° C, (

E6

,

E7

Alu Yd6

havde forlængelse tid i 30 sek ). De cykler inkluderet denaturering ved 94 ° C i 30 sek, 30 sek af annealing (60 ° C i

K-ras

og

RAB30

, 59 ° C i

actin

og

DHFR

, 57 ° C i

E6

E7

og 61 ° C i

Alu Yd6

), PCR reaktioner blev udført i en 2400 Thermalcycler (Applied Biosystems). Amplifikationsprodukterne blev verificeret ved agarosegelelektroforese. For rotte-specifik

LINE 1

sekvenser amplifikationen blev udført i 20 pi reaktioner indeholdende 100 ng af template DNA, 10 mmol /L Tris-HCI (pH 8,3), 40 mmol /L KCI, 1 mmol /L MgCl

2, 200 pmol /l af hver dNTP, 0,25 U Taq-polymerase (Applied Biosystems) og 1 pmol /l af hver primer specifik for rotte

LINE 1

(5′-aaatcagggactagacaaggctgc-3 ‘, og 3’-cccagccactttgctgaagttgt-5 ‘) [34]. Initial denaturering ved 94 ° C i 5 minutter blev efterfulgt af 40 cyklusser af amplifikation og en afsluttende forlængelsestrin (5 minutter ved 72 ° C). Amplifikationscykler bestod på denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 59 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 30 sekunder. PCR-reaktion blev udført på en 2400 Thermalcycler (Applied Biosystems). Amplifikationsprodukterne blev verificeret ved agarosegelelektroforese.

RT-PCR

I første-streng cDNA syntese 1-5 ug totalt RNA blev revers-transkriberet i en 20-pi reaktionsvolumen indeholdende 2 pi 10 x PCR-puffer, 50 ng af tilfældige hexamerer, 50 mM MgCl

2, 200 ng nM dNTP, 0,1 M DTT og 200 U revers transkriptase, (GeneAmp, Applied Biosystems) i 50 min ved 42 ° C. PCR-amplifikation af cDNA blev udført i en 20 pi reaktionsvolumen indeholdende 100 ng cDNA, 10 mmol /L Tris-HCI (pH 8,3), 40 mmol /L KCI, 1 mmol /l MgCl

2 (for

K -ras

v12 og

RAB30

), og 200 pmol /l af hver dNTP, 0,25 U Taq-polymerase (Applied Biosystems), og 1 pmol /l af hver primer er specifikt for humant

K-ras

V12 (5′-actgaatataaacttgtggtagttggacct-3 ‘, og 3′-caaatcacatttatttcctaccaggacct-5’), og for

RAB30

(5’gtccattacccagagttactaccg-3 ‘, og 3 ‘-gaccttgttgctggcatattgttc-5’). Initial denaturering ved 94 ° C i 5 min blev efterfulgt af 40 cyklusser af amplifikation og en afsluttende forlængelsestrin (5 min ved 72 ° C). Cyklerne omfattede denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 58 ° C (

K-ras

V12), og ved 56 ° C (

RAB30

) i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 30 sek. Størrelsen af ​​amplikoner og sekvensen af ​​primerne anvendt til PCR for

K-ras

V12 er 357 bp, og efter

RAB30

, 130 bp. PCR-reaktionen blev udført på en 2400 Thermalcycler (Applied Biosystems). Opformeringsprodukterne blev udsat for elektroforese på en 3% agarosegel.

DNA-sekventering

For at bekræfte oprindelsen af ​​den forstærkede sekvens (human eller murine), blev PCR-produkterne sekventeret. PCR amplikoner blev oprenset ved anvendelse isopropanol udfældning og derefter sekventeret i både fremad og bagud fra mindst to uafhængige amplifikationsprodukter. Oprenset DNA blev fortyndet og cyklus-sekventeret ved anvendelse af ABI BigDye Terminator Kit v3.1 (ABI, Foster City, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. Sekventeringsreaktioner blev elektroforesebehandlet i en ABI3100 genetisk analysator. Elektroferogrammer blev analyseret i både sense- og antisense retninger. De opnåede sekvenser blev sammenlignet med referencen

Kras

sekvens (GenBank DQ893829) og

RAB30

sekvens (GenBank NM_014488).

Southern Blot

mærket SW480 genomisk DNA blev hybridiseret til de følgende cellelinier: SW480 (positiv kontrol); NIH3T3 (negativ kontrol), og en pulje af

K-ras

positive cellekloner afledt fra NIH3T3 udsat for humant serum fra en patient med tyktarmskræft. Ti ug høj molekylvægt genomisk DNA af hver DNA-prøve blev fordøjet med

Hind III

(New England Biolabs). DNA-fragmenterne blev separeret ved elektroforese i en 0,8% agarosegel, denatureres, og overført til nylonmembran (Amersham). Hybridisering blev udført i en opløsning af BM Kemiluminiscens Blotting Kit (Roche Applied Science) indeholdende DNA-proben (100 ng /ml) i 20 timer ved 42 ° C. Blottene blev vasket under høj-stringens i 0,1 x SSC, 0,1% SDS i 90 minutter ved 65 ° C, inkuberes i streptavidin i 30 minutter ved stuetemperatur, placeret på Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Sciences), og eksponeret i 60 sek.

SNP Array Hybridisering og DNA Copy Number Analyse

DNA fra forældrenes SW480 celler, DNA isoleret fra supernatanten af ​​SW480 celler, og genomisk DNA fra SB1 celler (NIH3T3 passivt forvandlet af SW480 supernatant) blev hybridiseret på 500K Affymetrix genotypebestemmelse arrayet sat til DNA kopital analyse efter fabrikantens protokol. Analyse blev udført ved anvendelse af DNA-kopital rørledningen i Partek Genomics Suite software. Alle prøver blev sammenlignet med en almindelig normal menneskelig DNA-kopi nummer henvisning baseline.

FISH

interfase kerner og metafase kromosomer de transfekterede NIH3T3 celler (SB1) blev analyseret i standard cytogenetiske præparater, som tidligere beskrevet [35], med en konsensussekvens af human indflettet gentagelser. Den menneskelige Cot DNA-proben (som er placentale DNA, der er overvejende 50-300 bp i størrelse og beriget for repetitive DNA-sekvenser, såsom

Alu

Kpnl

familiemedlemmer) var mærket ved nick translation med digoxigenin-11-dUTP (Roche) ved hjælp af DIG-Nick Translation Mix (Roche) og påvist ved anvendelse af et fluorokromkonjugerede antidigoxigenin-antistof. Et hundrede kerner blev mikroskopisk analyseret

FISH analyse af histologiske snit af kolon tumorer i rotter blev udført som følger:. Snit blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret i graduerede ethanol-serien. Objektglassene blev forbehandlet med 0,2 M HCI, 8% natriumthiocyanat og 0,5% pepsin. Bagefter, rød-fluorescein-mærket

ALU

menneske (FISHBright, kreatech bioteknologi) og grøn-fluorescein-mærket

LINE 1

rotte (FISHBright, kreatech Biotechnology) sonder tilsat samtidigt; objektglassene dækket med dækglas og forseglet med gummi cement. Snit blev denatureret og hybridiseret i en Hybridizer (Life Technologies) ved 37 ° C natten over. Gummi cement og dækglassene blev fjernet, og snit blev vasket stringent anvendelse af SSC: 2 x SSC i 30 minutter ved stuetemperatur, 0,4 x SSC /0,3% NP40 i 5 minutter ved 75 ° C, og 2 x SSC /0,1% NP40 i 4 minutter ved stuetemperatur. Kerner blev modfarvet ved anvendelse af 4 ‘, 6’-diamino-2-phenylindol (DAPI) i en koncentration på 0,1-ug /ml i antifade (Vector Laboratories). Analyser blev udført ved hjælp af en Zeiss Axioplan fluorescens mikroskop (Zeiss) interface med den CytoVision systemet (Applied Imaging).

Resultater

Ekstracellulære DNA Forvandler udødeliggjort murine celler associeret med DNA Transfer

Cell-kultursupernatanter af humane maligne cellelinier SW480 og HeLa (dyrket i DMEM med 2% FBS), samt serum af de tre avancerede ubehandlet colon cancerpatienter og to raske kontroller blev ryddet af levedygtige celler og cellerester ved centrifugering og filtrering (0,45 um filter). Den DNA ekstraheret fra disse kilder, (SW480 og HeLa-supernatanter) var PCR-positive for mutant menneske

K-ras på

codon 12 og

E6

og

E7

onkogener henholdsvis. De tre serumprøver for kræft kolon patienter nærede den

K-ras

mutation i codon 12, som også blev bevist i DNA ekstraheret fra deres paraffinindlejrede primære tumorer. Disse materielle (supernatanter og serum af patienter med tyktarmskræft og raske kontrolpersoner var PCR positive for konstitutiv menneske

DHFR

og

actin

gener (ikke vist). Serum DNA-koncentrationer i serum var 2,04, 0,66 og 0,93 mg /ml for patienter og 0,28 og 0,178 mg /ml til raske personer. Supernatanter fra fem uafhængige cellekulturer af SW480, der blev truffet på 80% celle sammenløb, havde en gennemsnitlig koncentration på 0,1875 ± 0,007 mg /ml. “pasive” transfektioner med supernatanter eller sera blev udført som følger: 0,5 ml (serum eller supernatant indeholdende 1.815 ug eller 0,09 ug henholdsvis) blev tilsat til 0,5 ml medium (01:01 forhold) af dyrkede modtagende murine udødelige celler NIH3T3 (som blev bevist murine ved cytogenetisk analyse og ved fraværet af gentagne human

Alu Yd6

ved PCR, ikke vist) i 24-brønds mikrotiterplader. Medium plus serum eller supernatant blev ændret dagligt i 7 eller 14 dage (kortere tid for serum på grund af den begrænset mængde), således, celler blev udsat dagligt til 1.815 ug DNA indeholdt i serummet eller 0,09 ug DNA indeholdt i supernatanten DNA. På dag 8 eller 15, antallet af transformation foci af modtagerens NIH3T3-celler i plast og kolonidannelse i agar var overvældende overlegen til både serum og supernatant (sammenlignet med kontrolgruppen (NIH3T3-celler udsat for deres egen supernatant og normalt serum). blandt etablerede transformerede kloner, 11 af 27 udsat for SW480 og 5/9 (udsat for serum fra patienten med cancer) havde de

K-ras

mutation som bevist ved PCR under anvendelse af primere specifikke for amplifikation human

K-ras

. Ligeledes 8/24 kloner udsat for HeLa var PCR-positive for

E6

E7

HPV onkogener. tumorigenese analyser i

nu /nu

hunmus udviste større og hurtigere voksende tumorer fra en pulje af kloner “passiv” transficeret med supernatanten af ​​SW480 (SB1 pool) og tyktarm-cancer serum (CCPS) sammenlignet med forældrekontrol SW480-celler (+ Ctr), med murine NIH3T3 udsat til normal serum (NS), samt med forældrenes NIH3T3 (-Ctr) (fig. 1 A, B). Disse resultater bekræfter tidligere observationer om den transformerende evne af supernatanten af ​​SW480-celler, såvel som de af plasma fra patienter med kræft [4], [5]. Southern hybridisering af disse NIH3T3-transformerede pools af kloner (SB1 pool) mod genomisk DNA fra SW480 celler viste klare hybridiseringssignaler, hvilket bekræfter den horisontale overførsel af humant DNA til modtager murine celler (fig. 1 C). Endvidere FISH-analyse af passivt transformerede murine celler (SB1) udsendte positive signaler for humane repetitive sekvenser (fig. 1 D), hvilket bekræfter, at celletransformation var forbundet med DNA-overførsel.

Tumorvækst i nøgne mus fra ” passivt “transformerede celler. Hurtigere og blev observeret højere tumorvækst i SB1 pool og CCPS pool (NIH3T3 udsat for supernatant af SW480-celler og til serum fra en patient med coloncancer, henholdsvis). SW480-celler blev anvendt som positiv kontrol, hvorimod NIH3T3 og NIH3T3 udsat for normalt serum viste i det væsentlige ingen vækst. B. Repræsentative billeder af tumorer i mus fra hver gruppe. C. Southern blot hybridisering af SB1 og CCPS puljer af celler mod genomisk DNA af SW480 celler. Lane SW480 celler er den positive kontrol og NIH3T3, den negativ. En klar hybridisering signal kun observeret i SB1 og CCPS baner. D. FISH-analyse af repetitive humane sekvenser. Positive kontrol er humane lymfocytter og murine celler negativ kontrol. SB1 celler viser stærkt signal. E. Tumor vækst er den samme i NIH3T3 aktivt transficeret med genomisk DNA fra SW480-celler (Neo-Geno) og aktivt transficerede DNA ekstraheret fra supernatant af SW480-celler i sammenligning med ingen vækst i NIH3T3 (-Crt) og transficeret med den tomme-vektoren kun . Positiv kontrol, SW480 celler.

For at demonstrere at det transformerende evne af supernatanten bor i DNA, 5 ug af oprenset DNA fra SW480 supernatanten blev cotransficeret med en eukaryot pneo vektor under anvendelse af lipofectamin (aktiv transfektion). Flere genetecin-resistente kloner blev etableret. En pulje af disse kloner var i stand til at danne tumorer i

nu /nu

hunmus (fig. 1 E). Omvendt “passiv” transfektion under anvendelse af 5 ug af oprenset DNA (ekstraheret fra celle-kultursupernatant) og tilsat dagligt i 14 dage til NIH3T3-celler) var ikke i stand til at transformere NIH3T3-celler og heller ikke overføre DNA-sekvenser i recipientceller (som vurderet ved PCR af mutant menneske

K-ras

og

Alu Yd6

, ikke vist).

DNA-forarmet Supernatant ikke Transform udødeliggjort murine celler

Det har vist, at celle-frit DNA cirkulerer som et kompleks af DNA /RNA-lipoprotein (virtosome), der spontant frigives af levende celler [29] og dette kompleks kunne beskytte DNA mod at blive nedbrudt af cirkulerende nukleaser. For at undersøge dette, blev frisk supernatant af SW480-celler eksponeret for DNAse I, for proteinase K, og til begge, og derefter blev DNA blev ekstraheret og elektroforesebehandlet. Resultaterne viste, at DNAse I undlod at fordøje DNA fuldt. Ligeledes eksponering af supernatanten for proteinase K kun mildt fordøjet DNA. Fig. Fig. Fig.