PLoS ONE: antiapoptotiske Effekter af Lentiviral Vector Transduktion fremme øget Rituximab Tolerance i Kræft B-Cells

Abstrakte

Diffust storcellet B-celle lymfom (DLBCL) er kendetegnet ved stor genetisk og klinisk heterogenitet hvilket komplicerer prognostisk forudsigelse og påvirkninger behandlingseffekt. Den mest almindelige regime, R-CHOP, består af en kombination af anthracycline- og immuno-baserede lægemidler, herunder Rituximab. Det er fortsat undvigende, hvordan og i hvilket omfang genetisk variation påvirker respons og potentielle tolerance til R-CHOP. Derfor en bedre forståelse af mekanismer, der fører til narkotika tolerance i B-celler er afgørende, og modellering af genetiske indgreb direkte i B-celler er fundamental i sådanne undersøgelser. Lentivirus-baserede genvektorer er meget udbredt gen køretøjer, som i B-celler er et attraktivt alternativ til potentielt toksiske transfektions-baserede metoder. Her har vi undersøge brugen af ​​VSV-G-pseudotype lentivirusvektorer i B-celler til at udforske virkningen af ​​microRNA på tolerance over for rituximab. Især finder vi, at robust lentiviral transduktion af cancerøse B-cellelinier markant og specifikt forøger modstanden af ​​transducerede kimcenter B-celler (GCBs) til Rituximab. Selvom Rituximab virker delvist gennem komplement-medieret cellelyse, er forøget tolerance ikke opnået gennem virkningerne af lentiviral transduktion på celledød medieret af komplement. Snarere, reducerede niveauer af PARP1 og persistente høje niveauer af CD43 i Rituximab-behandlede GCBs demonstrerer antiapoptotiske virkninger af lentiviral transduktion, der kan interferere med resultatet og fortolkningen af ​​Rituximab tolerance. Vores resultater understreger, at forsigtighed bør udvises udnytte lentivirusvektorer i undersøgelser af tolerance over for lægemidler i DLBCL. Vigtigere er imidlertid vise vi muligheden for at bruge lentiviral gen levering platform i undersøgelser vedrørende virkningen af ​​specifikke microRNA på Rituximab lydhørhed

Henvisning:. Ranjbar B, Krogh LB, Laursen MB, Primo MN, Marques SC, Dybkær K, et al. (2016) antiapoptotiske Effekter af Lentiviral Vector Transduktion fremme øget Rituximab Tolerance i Kræft B-Cells. PLoS ONE 11 (4): e0153069. doi: 10,1371 /journal.pone.0153069

Redaktør: Kristy L. Richards, Cornell University, USA

Modtaget: November 24, 2015; Accepteret: 23. marts 2016 Udgivet: April 5, 2016

Copyright: © 2016 Ranjbar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Agnes og Poul Friis Fond; Aase og Ejnar Danielsens Fond; Frits, Georg og Marie Cecilie Gluds Legat; Else og Mogens Wedell-Wedellsborgs Fond; Civilingeniør Frode V. Nyegaard og Hustrus Fond; Arvid Nilssons Fond; Fabrikant Ejnar Willumsens Legat. Alle modtaget af J.G. Mikkelsen. Ph.d. mobilitet stipendium fra Aarhus Universitet modtaget af B. Ranjbar

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Diffust storcellet B-celle lymfom. (DLBCL) er den mest almindelige type af non-Hodgkin lymfom hos voksne med en 5-årig samlet overlevelse på 60%, der illustrerer, at nogle patienter er enten ikke reagerer på den aktuelle behandling eller udvikle resistens under behandlingen. DLBCL er både klinisk og molekylært en heterogen sygdom. Den største subtype er defineret som DLBCL, ikke andetsteds specificeret (DLBCL, NOS), som ved gen-ekspression profilering kan inddeles i følgende molekylære underklasser: (i) kimcenter B-celle (GCB) DLBCL og (ii) aktiveres B -celle (ABC) DLBCL, [1-3]. De to molekylære underklasser GCB og ABC afviger i signalvejen defekter, genetiske abnormiteter, og patogenese [1,4-6]. Overlevelse resultater adskiller sig også, som GCB patienter har en højere 5-års overlevelse på 69-79% i forhold til 52-53% for dem med ABC DLBCL når de behandles med en standard immun- og antracyklinbaseret multidrug kemoterapi, kendt som R -CHOP, bestående af Rituximab (R), cyclophosphamid (C), doxorubicin (H), vincristin (O), og prednison (P) [7]. Desuden udvikler ca. en tredjedel af DLBCL patienter recidiverende /refraktær sygdom. Således opdagelsen af ​​nye biologiske markører og terapeutiske midler samt strategier til at overvinde resistens er centrale udfordringer for at tilbyde forbedret behandling til DLBCL patienter.

Rituximab er den første FDA-godkendte antistof, der skal bruges i behandling af DLBCL . Rituximab rettet mod CD20-molekyler på overfladen af ​​præ-B-celler og mere differentierede B-celle-stadier [8]. CD20 er et differentiering-specifikt celleoverfladeantigen, som er til stede på B-celleoverfladen fra tidlige stadier af B-celleudvikling til post-germinale modningstrin, men ikke på overfladen af ​​modne plasmaceller [8]. Molekylet er involveret i aktiveringen og proliferationen af ​​B-celler og menes at være en del af en celleoverflade kompleks involveret i calciumtransport selvom liganden for CD20 fortsat er ukendt [8]. Forskellige virkningsmekanismer er blevet beskrevet for Rituximab, herunder komplement-afhængig cellecytotoksicitet (CDC), antistof-afhængig cellemedieret cytotoksicitet (ADCC), og direkte induktion af celledød ved apoptose [8,9]. trods fordelene ved Rituximab, lægemiddelresistens dog fortsat en udfordring for effektiv og langvarig behandling. Adskillige mekanismer, der fører til Rituximab tolerance er blevet beskrevet; Disse omfatter nedregulering af CD20 udtryk [10-12], nedregulering af apoptose-involveret proteiner såsom Bak og Bax [13], og hæmning af P38 MAPK aktivitet [14], som for nylig gennemgået af Pérez-Callejo og kolleger [15]. Derudover microRNA (miRNA) menes at bidrage til lægemiddelrespons og potentiel modstand gennem deres kapacitet til at modulere ekspression af proteiner af centrale signaltransduktionsveje [16-18].

miRNA er små (omkring 20 nukleotider ) ikke-kodende RNA’er, post-transkriptionelt regulerer genekspression via RNA-interferens pathway [19]. Disse RNA-molekyler, udtrykt fra RNApolII- eller RNApolIII-transkriberede gener i genomet, behandles både i kernen og, efter nuklear eksport, i cytoplasmaet. Som en del af RNA-inducerede lyddæmpende kompleks (RISC), modne miRNA annealer til genkendelsessites i mål mRNA og mægle mRNA nedbrydning eller translationel undertrykkelse [20,21]. Samspillet mellem miRNA og mRNA er baseret på baseparring, men fuldstændig overensstemmelse mellem de to molekyler er ikke påkrævet for miRNA funktion. Derfor en enkelt miRNA har potentiale til at målrette og regulere mange forskellige mRNA’er, hvorimod et specifikt mRNA kan målrettes ved et sæt af forskellige miRNA. Dette skaber et netværk af gen regulatoriske interaktioner og foreslår, at miRNA spiller en buffer rolle i genregulering med nogle potentielle redundans mellem miRNA. I betragtning af disse aktiviteter, miRNA er kritiske spillere i mange cellulære og udviklingsmæssige veje og hjælpe med at regulere grundlæggende cellulære egenskaber, herunder differentiering, proliferation, apoptose, og homeostase. Det er velkendt, at miRNA regulering påvirker udviklingen af ​​kræft og progression [22], og miRNA kan tjene enten som tumorsuppressorer eller onkogener baseret på deres mål gen (er) at bistå i undertrykkelse, forfremmelse henholdsvis vækst kræft og progression [23 -26].

Global miRNA udtryk profilering undersøgelser har afsløret forskellige miRNA signaturer til forskellige DLBCL undergrupper, tyder på, at B-celle kræft kan klassificeres på grundlag af miRNA udtryk profiler [27]. Givet sådanne forskelle i miRNA signatur, kan specifikke delmængder af miRNA identificeres som potentielle prognostiske og prædiktive biomarkører for sygdomsprogression og behandling hhv. Som et eksempel blev høj ekspression af MIR-155 findes i et klinisk datasæt at være forbundet med svigt af R-CHOP behandlingen [27]. En nylig systematisk undersøgelse af undersøgelser, der fokuserer på miRNA udtryk i DLBCL identificeret i alt 30 miRNA forbundet med patientens resultat [28]. Især har kun et relativt lille antal miRNA blevet identificeret i flere uafhængige undersøgelser, støtter tanken om, at afvigelser kan forekomme på grund af den ekstreme reglernes kompleksitet og tilstedeværelsen af ​​stort set uidentificerede netværk af samarbejdende miRNA. Det har endvidere vist, at MIR-224 kan påvirke Rituximab effektivitet via regulering af mål-genet, der koder CD59, hvilket indikerer plausible roller miRNA i udviklingen af ​​resistens over for Rituximab [29]. En nylig undersøgelse foreslået, at miR-199a og miR-497 årsag øget følsomhed over for Rituximab og andre kemoterapeutika, der bidrager til forbedret samlet overlevelse i DLBCL [30].

Global analyser af kliniske prøver ved hjælp array-baserede teknologier eller næste generations sekventering er stærke tilgange, som har ført til identifikation af molekylære prædiktorer, herunder miRNA, af DLBCL overlevelse og prognose [31,32]. Det er afgørende, dog at modellere miRNA funktion i B-celler og etablere en platform for at studere miRNA netværk og deres betydning for lægemiddelrespons og udvikling af potentielle lægemiddel tolerance. Molekylær manipulation i B-celler kompliceres af den kendsgerning, at disse celler er vanskelige at transficere med plasmid-DNA og syntetiseret eller

in vitro

-transcribed RNA og at transfektion ved kemisk behandling eller elektroporering kan ledsages af betydelig toksicitet og celledød. Virus-baseret genoverførsel repræsenterer imidlertid en alternativ strategi til at modellere miRNA funktion i B-celler. I denne undersøgelse undersøgte vi brug af vesikulær stomatitis-virus glycoprotein G (VSV-G) -pseudotyped lentivirale vektorer i B-celler til undersøgelse af virkningen af ​​miRNA af følsomheden af ​​cancerøse B-celler til Rituximab. Især viser vi, at transduktion af GCB-type B-celler med standard lentivirusvektorer fører til øget tolerance over Rituximab, og at anti-apoptotiske faktorer induceres ved behandling af cellerne med lentivirusvektorer. På trods af disse effekter af lentiviral vektor transduktion af B-celler, demonstrerer vi muligheden for dette gen levering platform i undersøgelser vedrørende betydningen af ​​specifikke miRNA i forhold til Rituximab lydhørhed.

Materialer og metoder

cellelinjer

Seks DLBCL cellelinier blev anvendt til dosis-respons-assays. NU-DHL-1 og SU-DHL-5 blev indkøbt fra DSMZ (tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer). Farage [33], OCI-Ly-7 [34], RIVA [35], og SU-DHL-8 [36] blev venligst stillet til rådighed af Dr. Jose A. Martinez-Climent (Molecular Oncology Laboratory, University of Navarra, Pamplona , Spanien). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C med 5% CO

2. DLBCL linier blev podet i RPMI1640 (Lonza, Basel, Schweiz) suppleret med 10% FBS, 1% glutamin og 1% penicillin /streptomycin. HEK-293T-celler blev podet i DMEM (Lonza, Basel, Schweiz) indeholdende 5% FBS og 1% penicillin /streptomycin. Identiteten af ​​cellelinier blev bekræftet ved DNA-stregkoder, som tidligere beskrevet [37].

Vector byggeri

En standard lentivirale miRNA ekspressionsvektor (PLV /miRCS-PE), bærer en miRNA kloningssted (miRCS) til indføring af PCR-amplificerede miRNA sekvenser, blev skabt ved kloning af U1 ekspressionskassetten indeholdende et internt kloningssite (U1-MCS-U1terminator) ind lentivirusvektoren plasmid PLV /PGK-eGFP [38], indeholder som PGK-eGFP (PE) ekspressionskassette. At tillade indsættelse af NotI-spaltede fragmenter nedstrøms for U1 promotoren blev et Bsp120I restriktionssted indføres mellem U1 promotor og U1 terminatoren. Genomiske DNA sekvenser der koder for de forskellige undersøgte miRNA blev PCR-amplificeret fra human genomisk DNA isoleret fra HeLa-celler og klonet ind Bsp120I-spaltet PLV /miRCS-PE. Studerede miRNA og primerne anvendt til PCR-amplifikation er fastsat i S1 tabel.

Analyse af miRNA-funktion

For funktionelle studier af de klonede miRNA varianter, individuelle målsekvenser blev fusioneret til Rluc reporter genet ved indsættelse af annealede oligonukleotider indeholdende målsekvensen ind i Notl /Xhol-fordøjet psiCHECK-2-vektoren (Promega, Madison, WI, USA), som tidligere beskrevet [39]. Funktionalitet af klonede miRNA blev kontrolleret i HEK-293T-celler co-transficeret med psiCHECK-2-afledt plasmid og PLV /miRCS-PE-afledte plasmid, der koder den relevante miRNA bruger Dual luciferase assay (Promega, Madison, WI, USA) i overensstemmelse med producentens protokol.

lentivirus produktion og transduktion

at producere lentivirale vektorer, HEK-293T-celler blev udpladet i 10 ml DMEM i en densitet på 4 x 10

6 pr 10 cm fad. Den næste dag blev cellerne transficeret med lentiviral emballage plasmider (13,0 pg pIntg, 3,75 mikrogram pMD2G, 3,0 ug pRSV-Rev og 13,0 pg PLV /miR [nummer]-PE). Mediet blev skiftet efter 24 timer. 48 timer efter transfektion blev supernatanten opsamlet og ultra-centrifugeret gennem en saccharosepude. Virusudbyttet blev vurderet ved anvendelse af et p24-ELISA-kit (XpressBio, Frederick, MD, USA), og mængden af ​​virus i forskellige vektor præparationer var normaliseret baseret på niveauet af p24-protein. Cancerøse B-celler blev podet ved en densitet på 3 x 10

4 /ml i 2 ml RPMI1640. Celler blev transduceret den følgende dag under anvendelse af lige mængder af virus baseret på p24-målinger. Transduktionen Effekten blev målt ved anvendelse af flowcytometri (LSRFortessa, BD Bioscience, San Diego, CA, USA).

Rituximab cytotoksicitet assay

For at undersøge virkningerne af de forskellige miRNA på følsomhed over for behandling med Rituximab blev transducerede celler opsamlet, vasket og podet ved 3 x 10

5 /ml i 0,8 ml RPMI1640, 72 timer efter transduktion. Celler blev behandlet den næste dag med Rituximab i en dosis svarende til GI50 for Rituximab eller det samme volumen af ​​natriumchlorid buffer. Et volumen på 200 pi poolet humant AB-serum (HS) (Innovative Research, Novy, MI, USA) blev tilsat til pladerne. Otteogfyrre timer efter lægemiddelbehandling blev cellerne talt direkte af trypanblåt (som levedygtighed markør) ekskluderingsmetode anvendelse af Neubauer kammer (0,0025 mm

2) og farvet parallelt med BrdU (BD Bioscience, San Diego, CA , USA) til måling af proliferationshastigheden. Til nogle eksperimenter blev komplementproteiner inaktiveret human serum (INH’er) ved opvarmning ved 56 ° C i 30 minutter.

Flowcytometri

Celler blev opsamlet, vasket og farvet i 30 minutter med fixable nær IR-dead levedygtighed cellemarkør (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ifølge fabrikantens protokol. Cellerne blev derefter vasket og fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 minutter og analyseret for levedygtighed og GFP-ekspression. For CD43 og CD20-analyse blev celler opsamlet, vasket og farvet med APC-konjugeret anti-CD43 (BD ​​Bioscience, San Diego, CA, USA) og APC-konjugeret anti-CD20 (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) separat i 30 minutter ved 4 ° C i mørke og derefter fast 15 minutter med 4% paraformaldehyd. At måle hastigheden af ​​apoptose blev celler opsamlet, vasket, permeabiliseret og farvet med PE-konjugeret anti-Spaltet PARP1 (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) ifølge producentens protokol. For at måle proliferationshastighed blev celler inkuberet med BrdU i 55 minutter og derefter opsamlet, vasket to gange, og permeabiliseret og farvet med APC-konjugeret anti-BrdU (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) ifølge producentens protokol. Kvantificering af GFP, levedygtighed, CD43 og CD20-ekspression, kløvet PARP1, og BrdU-positive celler blev vurderet med et flowcytometer (LSRFortessa, BD Bioscience, San Diego, CA, USA) og analyseres data ved brug FlowJo_V10 software.

Kvantificering af mRNA-niveauer af qPCR

Celler blev høstet, vasket og lyseret 48 timer efter Rituximab behandling. Totalt RNA blev oprenset under anvendelse Mirvana miRNA Isolation Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ifølge fabrikantens protokol. Ekspressionen af ​​CD43 blev målt ved primere og probe (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) i henhold til fabrikantens protokol under anvendelse af Light Cycler 480 (Roche, Basel, Schweiz). Niveauet af ekspression blev normaliseret til ekspressionen af ​​RPLP0.

Statistisk analyse

Students t-test (tohalet) parrede og uparrede blev udført. Alle forsøg, herunder narkotika assays og gen og protein udtryk analyse blev udført tre gange i biologiske tre eksemplarer.

Resultater

Effektiv lentiviral transduktion af B-cellerne i GCB- og ABC-lignende oprindelse

for at undersøge virkningerne af miRNA udtryk på Rituximab respons i svære at transficere DLBCL cellelinier, vi først genereret en lentiviral vektor konstruktion, PLV /miRCS-PE, med to ekspressionskassetter tillader samtidig udtryk for (i) en miRNA af interesse udtrykkes fra humane U1 lille nukleare RNA (snRNA) promotor og (ii) EGFP reporter gen drevet af en phosphoglyceratkinase (PGK) promoteren (figur 1a). Brug udtryk for eGFP som markør for vellykket genafgivelse, bestemte vi transduktion på upconcentrated LV /miRCS-PE i alt seks kræft B-cellelinier af DLBCL oprindelse. To af disse cellelinjer var refraktære over for transduktion af VSV-G-pseudotype lentivirale vektorer, men de resterende cellelinjer viste robust niveauer af lentiviral transduktion (S1a Fig). Desuden levedygtigheden af ​​celler efter transduktion var tæt på 100% for alle cellelinjer (S1b Fig). Baseret på denne screening for cellelinjer, som var til modtagelige for lentiviral transduktion, vi fokuseret på de to GCB-lignende cellelinjer OCI-Ly-7 og SU-DHL-5 og de to ABC-lignende cellelinjer Riva og NU-DHL- 1. Som bestemt ved flowcytometrianalyse, disse fire B-cellelinjer blev alle positive for CD20-ekspression på celleoverfladen (S2 Fig). For disse cellelinier udførte vi yderligere transduktionseksperimenter og bekræftet effektiv genafgivelse ved fluorescensmikroskopi (fig 1b). Derfor niveauer af transduktion bestemmes ved flowcytometri varierede fra 57 ± 3% i Riva celler til 78 ± 2,5% i SU-DHL-5-celler (repræsentativt udtryk profiler vist i figur 1c). Det skal også bemærkes, at morfologien af ​​disse fire cellelinjer afveg på en måde, der var uafhængig af lentiviral behandling. Derfor både OCI-Ly-7 og SU-DHL-5 celler dannet klynger af celler med større celle aggregater, især tydeligt i OCI-Ly-7 kulturer, mens hverken RIVA eller NU-DHL-1 celler viste enhver tendens til at klynge.

(a) en lentiviral vektor, blev PLV /mIR-PE konstrueret til samtidigt at udtrykke et specifikt miRNA (fra en U1-promotor) og eGFP (fra et PGK-promotor). Den lilla boks (markeret ‘T’) angiver U1 terminator sekvens, der afslutter transskription af miRNA indsat i BSp120I webstedet. Lys grå felter illustrerer elementer (R, U5, og AU3) af de lange terminale repeats af den lentivirale vektor. CMV (lysegrå pil) viser promotoren anvendes til at drive ekspression af vektoren RNA i vektor-producerende celler. Transduktionseffektivitet af vektoren blev analyseret ved (b) fluorescens mikroskopi og (c) flowcytometrianalyse i forskellige ondartede B-cellelinier. Omfanget af de mikroskop billeder er angivet med den røde bjælke repræsenterer en længde på 0,1 mm på alle billeder.

Øget tolerance til Rituximab i GCB-lignende celler behandlet med lentivirusvektorer

med henblik på udnyttelse lentiviral levering i studier af Rituximab tolerance i B-celler, satte vi os først at identificere cellulære virkninger af lentiviral vektor-transduktion. I en standard lægemiddelrespons Assay (DRA) (forsøgsopstilling vist i S3 Fig), skal udragende vi transducerede celler til Rituximab i nærvær af humant serum (HS) 72 timer efter transduktion med LV /miRCS-PE og måles effekten af ​​Rituximab behandling efter yderligere 48 timer ved at tælle antallet af celler eller analyse mærkning med BrdU som et mål for celleproliferation. I begyndelsen blev OCI-Ly-7 og Riva-celler behandlet med stigende doser af Rituximab, svarende til GI50 (den lægemiddelkoncentration der forårsager 50% inhibering af cellevækst), TGI (den lægemiddelkoncentration der forårsager total vækstinhibering) og 2 × TGI.

for OCI-Ly-7 celler vi observeret, at celler transduceret med standard ekspressionsvektor, LV /miRCS-PE, viste øget resistens over for alle doser af rituximab (bestemt ved celletælling og BrdU proliferationsassays) i forhold til celler, der ikke blev behandlet med en lentiviral vektor (fig 2a og 2b, venstre paneler). Sådan forbedret tolerance kunne ikke identificeres i transducerede RIVA celler (fig 2A og 2B, højre paneler). Behandling af de to celletyper med Doxorubicin viste ingen effekt på stoffet tolerance efter lentiviral transduktion (figur 2c og S4A Fig), hvilket tyder på, at den inducerede tolerance i OCI-Ly-7 celler var specifik for Rituximab. Ved hjælp af en Rituximab koncentration svarende til den GI50, vi udførte Rituximab tolerance i alle fire cellelinjer (OCL-Ly-7, SU-DHL-5, Riva, og NU-DHL-1 celler) og fandt de samme effekter af transduktion med LV /miRCS-PE i de to GCB-lignende cellelinjer, mens tolerancen til Rituximab var upåvirket i de to ABC-lignende cellelinier (figur 2d og s4b fig), hvilket tyder på, at den inducerede tolerance var specifik for GCB-lignende DLBCL celle linjer. Parallelt hermed direkte celletælling af transducerede OCL-LY-7 og SU-DHL-5-celler viste et fald i proliferationshastighed (fig 2e), som blev støttet af analyse af BrdU-inkorporering (S4C Fig), hvilket illustrerer, at Rituximab tolerance var ikke et resultat af øget celleproliferation i de lentivirally transducerede celler.

celler blev behandlet med Rituximab (RTX) 72 timer efter lentiviral vector transduktion. Celleproliferation blev målt 48 timer efter Rituximab behandling under anvendelse af (a) Trypan Blue-farvning og direkte celletælling og (b) BrdU-assay og flowcytometri-analyse. (C) manglende effekt af doxorubicin som vist ved måling af celleproliferation 48 timer efter behandling med lægemidlet. (D) lentivirus-medieret stigning af tolerance overfor Rituximab i GCB-Like DLBCL cellelinier (OCI-Ly-7, SU-DHL-5), men ikke i ABC-lignende celler. (E) Nedsættelse af celleproliferation i OCI-Ly-7 og SU-DHL-5-celler behandlet med lentivirusvektorer. blev bestemt antal celler efter 96 timers inkubation. NTC, nontranduced celler; LVTC, lentivirale vektor-transducerede celler. Stjerner angiver signifikansniveau som følger: *:

s

value≤0.05, **:

s

value≤0.01, ***:

s

value≤0.001.

Lentiviral vektor-induceret Rituximab tolerance indebærer ikke komplement-medieret cellelyse

for at undersøge rollen af ​​komplement-medieret cellelysis for den øgede Rituximab tolerance i lentivirally transduceret GCB-lignende celler, vi analyserede svar på GI50 doser af Rituximab i overværelse af HS og supplere-inaktiveret humant serum (INH’erne). Vi først dyrkede OCI-Ly-7 og Riva celler, transduceret med LV /miRCS-PE i overværelse af INH’erne og HS. For OCI-Ly-7-celler, fandt vi reduceret tolerance over for Rituximab i nærvær af komplement (celler dyrket med HS) i forhold til celler dyrket i fravær af komplement (celler dyrket med INH’er), som målt ved at tælle celler (Fig 3a, venstre panel). I modsætning hertil blev reaktionen på Rituximab ikke påvirket af komplement i Riva celler (Fig 3a, højre panel). Disse resultater blev støttet ved at måle inkorporeringen af ​​BrdU (S5a Fig). Derfor celledød induceret af Rituximab behandling af OCI-Ly-7 forekom delvist gennem mekanismer, der involverer komplement-afhængig cytotoksicitet (CDC).

(a) Øget tolerance over for Rituximab (RTX) i GCB-lignende celler i nærvær af supplement i forhold til celler dyrket i fravær af komplement. Behandling af celler med varmeinaktiveret humant serum (INH’er) viste, at den apoptotiske virkning af Rituximab var uafhængig af komplementsystemet i Riva (ABC-lignende) celler, men ikke i OCI-Ly-7 (GCB-lignende) celler. (B) Relativ overlevelsesraten for Rituximab-behandlede celler dyrket i human serum (HS) og INH’er var ikke forskellig mellem nontransduced og lentivirally transducerede celler. Antallet af OCI-Ly-7 og SU-DHL-5-celler blev bestemt med og uden lentiviral transduktion i fravær eller nærvær af aktivt komplement. For både GCB-lignende cellelinier (OCI-Ly-7, SU-DHL-5) den relative stigning i Rituximab tolerance var ens i NTC og LVTC grupper viser, at beskyttende virkninger af lentiviral transduktion ikke indebar virkninger på CDC. Lys grå og skraverede søjler angiver celleantal målt i nærvær af HS og i nærvær af INH’erne hhv. Det absolutte antal celler blev kvantificeret ved trypan blå-udelukkelse farvestof fremgangsmåde efter behandling med Rituximab og normaliseret til antallet af ubehandlede celler. Det relative antal celler blev anvendt som en vækstinhibering indeks viser forholdet mellem behandlede celler i forhold til den ubehandlede kontrol.

Dernæst satte sig for at teste, om den beskyttende virkning af lentiviral transduktion i GCB-lignende celler involveret virkninger på CDC. Til dette formål blev antallet af OCI-Ly-7 og SU-DHL-5-celler bestemmes med og uden lentiviral transduktion i fravær eller nærvær af aktivt komplement. For begge cellelinier, observerede vi øget tolerance over Rituximab af celler behandlet med lentivirusvektorer er uafhængige af tilstedeværelsen af ​​komplement. Derfor har den relative overlevelse rituximab-behandlede celler dyrket i HS og INH’erne ikke variere mellem nontransduced og lentivirally transducerede celler (Fig 3b), som blev bekræftet af BrdU inkorporering målinger (S5b Fig). Dette støtter den opfattelse, at de beskyttende virkninger af lentiviral transduktion ikke indebar komplement-medieret cellelyse.

Lentiviral vektor transduktion inducerer anti-apoptotiske virkninger i GCB-lignende celler

Dernæst vi rettet, om de beskyttende virkninger af lentiviral transduktion blev associeret med en ændret apoptotisk respons. Brug af spaltet PARP1 som et mål for apoptose sats, fandt vi, at antallet af spaltede PARP1-positive apoptotiske celler i fravær af Rituximab og HS faldt fra 1,4 ± 0,15% i nontransduced celler til 0,7 ± 0,1% i OCI-Ly-7 celler, som blev transduceret med den lentivirale vektor (figur 4a). Denne anti-apoptotiske virkning af lentiviral transduktion var signifikant også i OCI-Ly-7 og SU-DHL-5-celler behandlet med Rituximab (figur 4b), hvilket viser, at celledødsveje blev påvirket under lentiviral vector levering. Især, men vi testede anti-apoptotiske kapacitet lentiviral transduktion som reaktion på en række apoptose-inducerende stimuli (actinomycin D, Camptothecin, cyclohexamid, dexamethason, og etoposid) og fundet forøget celletal kun i transducerede OCI-Ly-7 udsat for Rituximab (fig 4c), hvilket antyder, at de observerede anti-apoptotiske virkninger var specifikke for Rituximab. Sammenfattende lentiviral transduktion forstyrrer mekanismer apoptose, som er specielt udløst af Rituximab.

(a) Reduceret apoptose sats lentivirally transduceret versus ikke-transducerede OCI-Ly-7 celle. (B) Nedsat niveau af apoptose i transducerede celler i forhold til nontransduced celler eksponeret for Rituximab i 48 timer. (C) Analyse af potentielle anti-apoptotiske kapacitet lentiviral transduktion som reaktion på en række apoptose-inducerende stimuli, herunder Rituximab (RTX) i OCI-Ly-7-celler. Det relative antal celler blev anvendt som en vækstinhibering indeks viser forholdet mellem behandlede celler i forhold til den ubehandlede kontrol.

Vedvarende ekspression af CD43 i lentivirally transducerede GCB-lignende celler behandlet med Rituximab

Tab af ekspression af overfladeprotein CD43, udtrykkes primært i lymfocytter, er forbundet med indledende stadier af apoptose i polymorfonukleære celler [40]. Reduktion af niveauet af CD43 kan derfor tjene som en markør for celler, der undergår tidlige trin i apoptose. Ifølge en befolkning på OCI-LY-7 celler udsat for Rituximab, viste øget niveauer af spaltet PARP1 i celler med lavere niveauer af CD43, mens celler med højere CD43-ekspression havde lavere niveauer af kløvet PARP1 (figur 5a). Derfor celler med en lavere CD43 ekspressionsprofil viste højere niveau af apoptose. Interessant, bemærkede vi, at apoptose (spaltede PARP1) sats for lavt-udtrykkende CD43-celler (defineret ved forholdet mellem 3. og 4. kvartal i figur 5a) var identisk for de to grupper (0,18 for både NTC og LVTC), viser et konstant niveau af apoptose i celler med lav ekspression af CD43. Celler transduceret med lentivirusvektorer var overvejende positive for CD43 og hastigheden af ​​apoptose, målt ved hjælp af celler med mistet ekspressionen af ​​CD43 eller forhøjet indhold af kløvet PARP1, blev markant reduceret (figur 5a og 5b). Vi fulgte derefter ekspressionen af ​​CD43 i OCI-Ly-7-celler over tid efter Rituximab behandling og viste et gradvist tab af CD43-ekspression i ikke-transducerede celler. Celler, der blev transduceret med lentivirale vektorer var i stand til at modstå tab af CD43-ekspression som vist ved flowcytometri (fig 5c) og bekræftet på RNA-niveau ved qPCR 48 timer efter Rituximab behandling (figur 5d). Afslutningsvis disse resultater tyder på, at anti-apoptotiske virkninger bidrage til øget tolerance over for Rituximab af lentivirally transducerede celler.

(a) Reduceret apoptose i transducerede OCI-LY-7 celler 8 timer efter Rituximab behandling, målt ved analyse af CD43-ekspression og kløvet PARP1 i NTC og LVTC. (B) Reduktion af CD43-ekspression i OCI-Ly-7 celler 48 timer efter Rituximab behandling. Histogrammet plot illustrerer antallet af CD43-positive celler i nontransduced celler (NTC), i lentivirally transducerede celler (LVTC), og i en negativ kontrol cellelinie. (C) Tab af CD43 som reaktion på Rituximab behandling er blokeret af lentiviral transduktion af OCI-Ly-7 celler. (D) Bekræftelse af vedligeholdte CD43 ekspressionsniveauer i celler transduceret med lentivirusvektorer og efterfølgende udsat for Rituximab. Analyse af CD43 genekspression blev udført ved hjælp af qPCR på total RNA isoleret fra NTC og LVTC.

Udnyttelse lentiviral transduktion til analyse af virkningen af ​​miRNA på Rituximab tolerance

Lentivirale vektorer er unikke værktøjer til at levere gener effektivt i B-celler og dermed også attraktiv, i studier af miRNA-funktion. I betragtning af den virkning lentiviral transduktion på celledød og tolerance GCB-lignende celler til Rituximab, var det uklart, om virkningen af ​​leveringen værktøjet selv vil forstyrre studier af gener, herunder miRNA-kodende gener, der påvirker tolerance over lægemidlet.