PLoS ONE: honokiol Forbedrer Paclitaxel Virkning hos multiresistent human Cancer Model gennem induktion af apoptose

Abstrakte

Modstand mod kemoterapi fortsat en stor hindring i kræftbehandling. Denne undersøgelse havde til formål at evaluere den molekylære mekanisme og effekt af honokiol inducere apoptose og forbedre paclitaxel kemoterapi i prækliniske multiresistente (MDR) kræftmodeller, herunder afstamning-afledte humane MDR (KB-8-5, KB-C1, KB-V1) og deres forældres drug følsomme KB-3-1 kræft cellelinjer.

In vitro

analyser viste, at honokiol effektivt inhiberede proliferation i KB-3-1-celler og MDR-derivater (IC

50 spænder 3,35 ± 0,13 ug /ml til 2,77 ± 0,22 ug /ml), trods deres signifikante forskelle i respons til paclitaxel (IC

50 spænder 1,66 ± 0,09 ng /ml til 6560,9 ± 439,52 ng /ml). Honokiol inducerede mitokondrier-afhængige og død receptor-medieret apoptose i MDR KB-celler, der var forbundet med inhibering af EGFR-STAT3 signalering og nedregulering af STAT3 målgener. Kombineret behandling med honokiol og paclitaxel synergistisk augmented cytotoksicitet i MDR KB celler sammenlignet med behandling med enten agent alene

in vitro

. Vigtigt er det, den kombinerede behandling hæmmes betydeligt

in vivo

vækst i KB-8-5 tumorer i en subkutan model. Tumorvæv fra kombinationsgruppen udviste en signifikant inhibering af Ki-67-ekspression og en stigning i TUNEL-positive celler i sammenligning med kontrolgruppen. Disse resultater tyder på, at målrette multiresistens hjælp honokiol i kombination med kemoterapi narkotika kan give nye terapeutiske muligheder

Henvisning:. Wang X, Beitler JJ, Wang H, Lee MJ, Huang W, Koenig L, et al. (2014) honokiol Forbedrer Paclitaxel Virkning hos multiresistent human Cancer Model gennem induktion af apoptose. PLoS ONE 9 (2): e86369. doi: 10,1371 /journal.pone.0086369

Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget 2 oktober, 2013; Accepteret: 8. december 2013; Publiceret: 25 feb 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Cancer Institute (NCI) gennem en hoved- og halscancer SPORE award (P50CA128613), P30 CA138292, og AR47901. D.M.S., J.J.B., og Z.G.C. vil også gerne anerkende Georgia Cancer Coalition for støtte. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. A.R.M. Ruhul Amin øjeblikket er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Hyung Ju C. Shin øjeblikket er ansat af en kommerciel virksomhed Quest Diagnostics, Atlanta. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kemoterapi er stadig en af ​​de store behandlingsmuligheder for mange typer af kræft, men en betydelig procentdel af patienterne udvikler resistens under forløbet af kemoterapi, og uundgåeligt fremskridt uden hærdning [1], [2]. På trods af de bemærkelsesværdige fremskridt i udvikling af lægemidler, har paclitaxel med sin brede anticancer spektrum størknede afbrydelse af mikrotubulusdynamik som en af ​​de mest effektive anticancer strategier i brug i dag. Imidlertid har fremkomsten af ​​narkotika-resistente kræftceller stærkt begrænset sin kliniske effekt. Det er derfor bydende nødvendigt at udvikle nye strategier til at reducere eller overvinde kemoresistens i kræft. Forskellige tilgange til fremme chemoresponse i kemoterapi kræft modeller er blevet undersøgt, herunder dem, der kombinerer naturlige produkter eller forbindelser med paclitaxel eller andre standard kemoterapi reagenser.

honokiol er en naturlig bestanddel isoleret fra barken af ​​magnolia træ [2], [3], som traditionelt har været anvendt til behandling af angstrelaterede lidelser og fordøjelsesproblemer [2], [4]. Interessant, honokiol også udstillet potente anticancer aktiviteter [5], [6], [7] og yderligere forbedrede konventionelle kemoterapier i en række prækliniske modeller af kræft hos mennesker, herunder kronisk lymfatisk leukæmi [3], prostatakræft [8] og myelomatose [9]. Disse relativt vidtrækkende anticancer evner og favorabel sikkerhedsprofil gør honokiol et attraktivt supplement terapi at øge konventionel kemoterapi i kliniske omgivelser.

Overekspression af anti-apoptotiske proteiner er en underliggende mekanisme, der bidrager til erhvervelse af terapeutiske modstand, tilbagefald og metastaser. En voksende mængde beviser tyder på, at tre anti-apoptotiske proteiner, dvs. survivin, Mcl-1, og Bd-2, kan være direkte relateret til resistens i kræft [10], [11]. Inhibering af disse vigtige overlevelsesfaktorer har vist sig at udløse apoptose og sensibilisere cancerceller for lægemiddelbehandling [5] -. [11], hvilket denne fremgangsmåde kan lovende overvinde kemoresistens og forbedre kemoterapi ved cancer

Ved at anvende en serie af slægt-afledte KB humane skællede kræftcellelinjer som udviser distinkte følsomheder til paclitaxel behandling, demonstrerede vi, at honokiol effektivt kunne inducere apoptose i multiresistente (MDR) cancerceller. Mekanistiske undersøgelser viste, at honokiol hæmmer EGFR-STAT3 signalvejen, og undertrykker udtryk for survivin og andre overlevelse faktorer. Vi yderligere demonstreret den

in vivo

effekten af ​​honokiol i behandling MDR kræft og forbedre paclitaxel effektivitet.

Materialer og metoder

Cell Culture

KB- 3-1 og dens MDR derivat cellelinjer var generøst tilvejebragt af Dr. Michael M. Gottesman (NCI, NIH, Bethesda, MD) og er blevet karakteriseret tidligere [12]. KB-3-1-celler blev opretholdt i DMEM-medium tilsat 10% føtalt bovint serum. KB-8-5 og KB-C1-celler blev opretholdt i DMEM-medium tilsat 10% føtalt bovint serum og 0,01 og 1 ug /ml colchicin henholdsvis. KB-V1-celler blev opretholdt i DMEM-medium tilsat 10% føtalt bovint serum og 1 ug /ml vinblastin. For at eliminere virkningerne af colchicin eller vinblastin på eksperiment resultat, resistente celler blev dyrket i stoffri medium i en uge før forsøgene.

Cell Growth Assay

Celler blev podet ved en densitet på 5 x 10

3 celler pr brønd i 96-brønds plader i firling. Fireogtyve timer senere blev medikamenter tilsat i forskellige koncentrationsintervaller som enkelte midler eller i to-lægemiddelkombinationer og derefter inkuberet i 72 timer. Intervallet for honokiol var fra 0,625 til 20 ug /ml for alle fire cellelinier. For paclitaxel, koncentrationsintervallet var 0,19 til 97,5 ng /ml, 3,02 ng /ml til 3,12 pg /ml, 12.1 ng /ml til 25,0 pg /ml og 97,5 ng /ml til 100 ug /ml for KB-3-1 , KB-8-5, KB-C1, og KB-V1-celler, hhv. Cellevækstinhibering blev målt ved at bestemme celletætheden med sulforhodamin B-assay. Procentdelen af ​​inhibering blev bestemt ved sammenligning af celledensitet i lægemiddelbehandlede celler med den for de ubehandlede kontrolceller. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Apoptose Analyse

Apoptose blev analyseret i alle fire cellelinjer. Celler blev behandlet med honokiol, paclitaxel eller deres kombination som angivet i figurteksterne, trypsineret og vasket i koldt 1 × PBS. Cellerne blev resuspenderet i 1 × Annexin bindingspuffer (BD PharMingen), og derefter farvet med Annexin V-phycoerythrin (Annexin V-PE, BD PharMingen) og 7-AAD (BD PharMingen) i 15 minutter ved stuetemperatur. De farvede prøver blev målt ved anvendelse af en fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) kaliber bench-top flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR) blev anvendt til apoptose analyse. Forsøgene blev gentaget 3 gange uafhængigt af hinanden.

immunblotting

Tredive mikrogram protein fra helcelleekstrakterne eller cytoplasmiske og mitokondrielle fraktioner blev kvantificeret, separeret på SDS-PAGE geler og overført til nitrocellulosemembraner. Efter at være blevet blokeret med 5% fedtfri tørmælk i TBS-T puffer blev membranerne inkuberet med specifikke antistoffer natten over ved 4 ° C. Muse anti-β-actin-antistof (Trevigen, Gaithersburg, MD) blev anvendt som en prøve loading kontrol. Immunofarvede proteinbånd blev detekteret med et forøget kemiluminescens (Amersham, Buckinghamshire, UK). Forsøgene blev gentaget 3 gange.

In vivo

Anti-tumor effekt Assay

dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Emory University. KB-8-5-celler (5 x 10

5) injiceret s.c. i 4-5 uger gamle kvindelige nøgne mus (athymiske

nu /nu

, Taconic NY). Når tumorerne havde udviklet til omkring 100 mm

3, blev musene inddelt i fire grupper (n = 7 eller 8) på en måde for at minimere vægt og tumorstørrelse forskelle blandt grupperne: kontrolgruppe behandlet med 20% intralipid ( Baxter Healthcare), honokiol gruppe (1,0 mg /mus eller 50 mg /kg), paclitaxel gruppe (20 mg /kg), og honokiol (1,0 mg /mus eller 50 mg /kg) plus paclitaxel (20 mg /kg) kombination gruppe . Honokiol blev opløst i 100% ethanol og blandes med 20% intralipid i en 01:14 (v /v) -forhold. Honokiol blev administreret til musene 3 gange om ugen ved 1,0 mg /mus (eller 50 mg /kg) via intraperitoneal injektion. Paclitaxel blev administreret til musene en gang om ugen ved 20 mg /kg gennem halevenen injektion. Terapien blev fortsat i 4 uger. Kropsvægten og tumorstørrelse blev målt tre gange om ugen. Tumoren volumen blev beregnet ved hjælp af formlen:

V

=

//6 × større diameter × (mindre diameter) [13]. Musene blev aflivet 4 uger efter påbegyndelse af behandlingen. Tumor og organvæv (lever, hjerte, lunge, milt og nyre) blev opsamlet for H resultatet blev præsenteret som et gennemsnit forhold af positive celletal ud af det samlede antal celler.

Statistisk analyse

Den statistiske signifikans af behandling af celler i

in vitro

cytotoksicitet assay blev vurderet ved hjælp af Students

t

-test. For

in vivo

antitumorvirkning assay en log-lineær mixed model med tilfældige intercept blev anvendt til at sammenligne betydningen af ​​de gennemsnitlige tumorvolumener hos hver gruppe. Den statistiske signifikans af behandlingseffekt på mikrotubuli, apoptose og celleproliferation i xenograft tumorvæv blev vurderet ved hjælp af Kruskal-Wallis test (envejs ANOVA).

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant i alle analyser

Resultater

honokiol Reducerer Levedygtighed og fremkalder apoptose i Human MDR Cancer Cells

MDR cancer cellelinjer KB-8-5, KB-C1 og KB-V1 blev afledt fra deres stof-følsomme modstykke KB-3-1 celler, og er ofte blevet brugt som et klinisk relevant model i studiet af resistens [14] , [15]. Disse celler udviste distinkte følsomhed for paclitaxel behandling. Som vist i fig. 1a, 1b, IC

50 værdier i MDR-cellelinier (KB-8-5:26.73 ± 1,01 ng /ml, KB-C1:195.0 ± 11.11 ng /ml, og KB-V1:6560.0 ± 439,52 ng /ml) blev forhøjet med 16-, 117- og 4000-fold, når det blev sammenlignet med den parentale KB-3-1 cellelinie (1,66 ± 0,09 ng /ml). Overensstemmelse med deres fænotype, MDR-cellelinier væsentligt udtrykke den klassiske MDR markør P-glycoprotien (fig. 1b). Interessant, en 72 h-behandling med honokiol effektivt reducerede levedygtigheden af ​​MDR-celler (KB-8-5:3.22 ± 0,14 ug /ml, KB-C1:3.04 ± 0,30 ug /ml, KB-V1:2.77 ± 0,22 ug /ml), med IC

50 værdier svarende til dem i KB-3-1-celler (3,35 ± 0,13 ug /ml) (fig. 1c, 1d). Apoptose analyse viste endvidere, at honokiol apoptose på en tids- og dosisafhængig måde (fig. 1e). 24 timer efter honokiol behandling, var procentdelen af ​​apoptotiske KB-3-1-celler var 11,9 ± 3,9% (5 ug /ml honokiol), 32,9 ± 0,9% (10 ug /ml), og 47,1 ± 2,7% (15 ug /ml); procentdelen af ​​apoptotiske celler steg til 18,4 ± 2,1%, 51,5 ± 0,6%, og 65,3 ± 1,6%, henholdsvis efter en 48 h-behandling, som blev yderligere forøget ved 72 timer. Honokiol inducerede også en lignende grad af apoptose i andre MDR-celler, herunder KB-8-5, KB-C1 og KB-V1 (fig. 1e). For eksempel en 48-h behandling med 10 ug /ml honokiol resulterede i apoptose i 51,5% af KB-3-1-celler, 52,7% af KB-8-5-celler, 52,9% af KB-C1-celler og 67,6% af KB-V1-celler, hhv. Disse data er i overensstemmelse med levedygtighed assay (fig. 1c, 1d), og antyder, at honokiol er et potent cytotoksisk middel i KB-celler uanset deres forskellige paclitaxel følsomheder.

(a, b) væksthæmmende virkning paclitaxel og p-gp-ekspression i KB-3-1, KB-8-5, KB-C1- og KB-V1-celler. IC

50 værdier af paclitaxel i drug resistente KB-8-5 blev KB-C1 og KB-V1 celler steget med 16-, 117- og 4000-fold henholdsvis i forhold til forældrenes KB-3-1 celler . (C, d) væksthæmmende effekt af honokiol i KB-3-1, KB-8-5, KB-C1 og KB-V1 celler. IC

50 værdier af honokiol i lægemiddelresistent KB-8-5, KB-C1 og KB-V1-celler var den samme som i parentale KB-3-1-celler. (E) honokiol inducerer apoptose i KB-celler. KB-3-1 og KB-8-5-celler blev behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol i 24, 48 og 72 timer. KB-C1 og KB-V1-celler blev behandlet med honokiol i 48 timer. Apoptose blev målt ved annexin V-phycoerythrin-farvning. * Angiver statistisk signifikante p-værdier (*, versus kontrol, p 0,05; **, versus 5 mg /ml, p 0,05).

honokiol inducerer mitokondrierelateret og Død receptor (DR) – afhængige apoptose i humane cancerceller

Vi undersøgte mekanismen for honokiol-induceret apoptose i KB-celler. Som vist i fig. 2a-c, honokiol behandling inducerede kløvning af PARP og caspase-3 på en dosis- og tidsafhængig måde i alle de testede KB-celler, hvilket indikerer aktiveringen af ​​apoptotiske signaler. Western blot-analyser vist sig, at honokiol ikke kun inducerede frigivelse af cytochrom

c

i cytoplasmaet på en dosis-afhængig måde (Fig. 2d), men også øget ekspression af DR5 (fig. 2d), en overflade receptor for pro-apoptotiske ligander Apo2L /TRAIL. Taget sammen antyder disse data at honokiol samtidigt kunne aktivere mitokondrier-afhængig (intrinsisk) apoptose og DR-afhængig (extrinsic) apoptose i KB-celler.

(a) KB-3-1-celler og (b) KB -8-5 celler blev behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol til 24, 48 timer. Fuldlængde og spaltes PARP, spaltet caspase-3 og β-actin som et loading kontrol blev påvist ved immunoblotting ved anvendelse af hele cellelysater. (C) KB-C1 og KB-V1-celler blev behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol i 48 timer. Spaltet PARP blev påvist ved immunoblotting ved anvendelse af hele cellelysater. (D) Overpanel blev KB-8-5-celler behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol i 48 timer. Cytoplasmatiske og mitokondriske fraktioner blev separeret og immunblottet med cytochrom c (Cyto C) antistof. COX4 (a mitokondrie protein) blev anvendt til at vise effektiviteten af ​​celle fraktionering. Lower panel, blev KB-8-5-celler behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol i 24 og 48 timer. DR5 blev påvist ved immunoblotting ved anvendelse af hele cellelysater. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange, og repræsentative data præsenteres.

honokiol Hæmmer EGFR-STAT3 Signaling i humane cancerceller

EGFR-STAT3 signalvejen spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​vækst og overlevelse i kræftceller. Vi undersøgte effekten af ​​honokiol på flere centrale elementer i EGFR-STAT3 signalvejen. KB-3-1 og KB-8-5-celler blev behandlet med honokiol (5 ug /ml) i 0,5, 1, og 2 timer. Western blot-analyse under anvendelse af totale cellelysater afslørede en markant reduceret phosphorylering af EGFR på Try1173, en indikator for aktiveret EGFR (fig. 3a). Vi undersøgte yderligere phosphorylering status STAT3 (Tyr705), Akt (Ser473), og ERK (Thr202 /Tyr204), tre kendte EGFR nedstrøms signalering komponenter. Interessant, honokiol behandling hurtigt hæmmet phosphorlylation af STAT3 og AKT, men havde ingen effekt på ERK fosforylering (fig. 3ab). For yderligere at undersøge, om ekspressionsniveauet af EGFR og dets nedstrøms målproteiner også inhiberes af honokiol behandling (5 ug /ml), behandlede vi cellerne i 24, 48 og 72 timer. Som vist i fig. 3CD, honokiol behandling inhiberede protein ekspression af EGFR, STAT3, ERK, og AKT i en tidsafhængig måde i KB-3-1 og KB-8-5-celler. Tilsvarende phosphorylering af disse proteiner blev nedsat ved honokiol behandling (fig. 3CD). Konsekvent, ekspressionsniveauerne af tre kendte STAT3 målgener, dvs. survivin, Bcl-2 og Mcl-1, blev drastisk reduceret efter honokiol behandling (fig. 3e).

KB-3-1 og KB- 8-5 celler blev behandlet med 5 ug /ml honokiol for kort tid (0,5, 1, eller 2 timer) eller lang tid (24, 48, eller 72 timer). Hele cellelysater blev immunoblottedes for de angivne proteiner. Virkningen af ​​honokiol på tidlige tidspunkter: (a) phosphorylering af EGFR og STAT3; (B) honokiol nedsætter phosphorylering af AKT og ERK. Virkningen af ​​honokiol på sene tidspunkter: (c) phosphorylering og ekspression af EGFR og STAT3; (D) phosphorylering og udtryk for AKT og ERK; (E) ekspression af survivin, Bcl-2, Mcl-1. (F) honokiol inhiberer EGFR-signalvejen og nedregulerer STAT3 målgener på en dosis-afhængig måde. KB-3-1 og KB-8-5-celler blev behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol i 48 timer. Hele cellelysater blev immunoblottedes for de angivne proteiner. (G) honokiol inhiberer EGFR-STAT3 vej hos KB-C1 og KB-V1-celler. KB-C1 og KB-V1-celler blev behandlet med 5, 10, 15 ug /ml honokiol i 48 timer. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange, og repræsentative data er præsenteret.

Vi undersøgte dernæst den dosisafhængige respons af EGFR-STAT3 signalering til honokiol behandling i KB-3-1 og KB-8 -5 celler. Som vist i fig. 3f, ekspression og phosphorylering af EGFR (Try1173) blev reduceret i nærvær af 5 eller 10 ug /ml honokiol (48 h), og blev yderligere reduceret ved en dosis på 15 ug /ml honokiol (fig. 3f). Konsekvent, ekspressionen og /eller phosphorylering af EGFR signalering nedstrøms komponenter, herunder ERK, Akt, STAT3, survivin, Bcl-2 og Mcl-1, blev også dramatisk inhiberet på en dosis-afhængig måde (Fig. 3f). En tilsvarende virkning af honokiol på EGFR-STAT3 signalering blev også observeret i både KB-C1 og KB-V1-celler (fig. 3g). Af særlig interesse, en RT-PCR-analyse viste, at honokiol hæmning af survivin udtryk kan indebære undertrykkelse af survivin transskription på mRNA niveau (figur S1).

honokiol Forbedrer in vitro Cytotoksicitet af paclitaxel i MDR Cancer Cells

Vi undersøgte, om inhibering af survivin, kunne Bcl-2 og Mcl-1 ved honokiol sensibiliserer MDR cancerceller til konventionel kemoterapi, såsom palictaxel. Som vist i fig. 4, 24-h behandling med enten honokiol (5 ug /ml) eller paclitaxel (450 ng /ml) resulterede i ≤20% af apoptose i KB-C1 celler, hvorimod kombineret behandling med både honokiol og paclitaxel resulterede i ca. 30% apoptose . Desuden ved 48 h og 72 h tidspunkter, den kombinerede behandling mere effektivt induceret apoptose (76% og 86%, henholdsvis) i KB-C1 celler end enten enkelt middel (≤25%) eller kontrol køretøj. Konsekvent, den kombinerede behandling var mere effektiv til at inducere apoptose end både enkelt middel i MDR KB-8-5 og KB-V1-celler (fig. 4). Brug af KB-8-5-celler som et eksempel, en kombination index (CI) assay bekræftede den synergistiske virkning af kombineret behandling med honokiol og paclitaxel reducere levedygtigheden af ​​MDR cancerceller (tabel S1).

(a ) KB-8-5, (b) KB-C1, og (c) KB-V1-celler blev behandlet med 5 ug /ml honokiol, paclitaxel (15 ng /ml for KB-8-5, 450 ng /ml for KB-C1, og 6 ug /ml for KB-V1), eller kombinationen af ​​to lægemidler i de angivne koncentrationer i 24, 48 og 72 timer. Apoptose blev målt. * Angiver statistisk signifikante p-værdier (*, kombination versus honokiol, p 0,05, **, kombination versus paclitaxel, p 0,05). Alle forsøg blev gentaget tre gange.

Western blot-analyse endvidere fundet, at den kombinerede behandling med honokiol og paclitaxel var mere effektiv end enten alene inducere kløvning af caspase-3, PARP middel og frigivelse af cytochrom

c

fra mitokondrier i KB-8-5-celler (fig. 5a, 5b). En 48-h behandling med honokiol alene eller kombinationen af ​​honokiol og paclitaxel faldt ekspressionen og phosphorylering af EGFR, samt andre centrale EGFR-STAT3 signaling komponenter, herunder STAT3, p-STAT3 (Tyr705), ERK, p-ERK ( Thr202 /Tyr204), Akt og p-Akt (Ser473). Proteinet ekspression af survivin, Bcl-2 og Mcl-1 blev også markant reduceret ved behandling med honokiol eller kombinationen af ​​honokiol og paclitaxel. Interessant imidlertid behandling med paclitaxel alene havde ikke signifikant effekt på disse signaler komponenter eller målgener af EGFR-STAT3 pathway (fig. 5c).

(a) honokiol forbedrer paclitaxel inducerede PARP og caspase- 3 spaltning i KB-8-5-celler. Cellerne blev behandlet med 5 ug /ml honokiol, 15 ng /ml paclitaxel eller kombinationen af ​​de to lægemidler i 24, 48 og 72 timer. Fuldlængde og spaltes PARP, spaltet caspase-3 og β-actin som et loading kontrol blev påvist ved immunoblotting ved anvendelse af hele cellelysater. (B) honokiol forbedrer paclitaxel induceret frigivelse af cytochrom

c

i cytoplasmaet i KB-8-5 celler. Cellerne blev behandlet med 5 ug /ml honokiol, 15 ng /ml af paclitaxel eller kombinationen i 48 timer. Cytoplasmatiske og mitokondriske fraktioner blev separeret og immunblottet med cytochrom c (Cyto C) antistof. COX4 (a mitokondrie protein) blev anvendt til at vise effektiviteten af ​​celle fraktionering. (C) honokiol inhiberer EGFR-STAT3 signalvejen og nedregulerer STAT3 målgenekspression i KB-8-5-celler. Cellerne blev behandlet med 5 ug /ml honokiol, 15 ng /ml af paclitaxel eller kombinationen i 48 timer. Hele cellelysater blev immunoblottedes for de angivne proteiner. (D) Paclitaxel inducerer mikrotubulus polymerisation i KB-8-5-celler. Lægemiddelinduceret stabilisering af mikrotubuli, hvilket fremgår af en stigning i mikrotubulus polymermasse resulterer i bundling blev observeret efter behandling med både paclitaxel og kombinationen; dog honokiol alene var ikke effektivt til stabilisering mikrotubulus (forstørrelse 400x). Cellerne blev behandlet med 5 ug /ml honokiol, 15 ng /ml af paclitaxel eller kombinationen i 24 timer. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange, og repræsentative data er præsenteret.

Paclitaxel udøver sin antitumorvirkning ved at binde til tubulin inde i lumen af ​​det mikrotubulære, hvilket resulterer i mikrotubulus-polymerisation, stabilisering og afbrydelse af mikrotubulus dynamik, der forårsager mitosestandsning og apoptose i prolifererende celler. For at undersøge om honokiol kan forbedre paclitaxel induceret mikrotubuli polymerisering og stabilisering, vi undersøgte effekten af ​​hver behandling på mikrotubuli i KB-8-5 og KB-C1 celler. Lægemiddelinduceret stabilisering af tumorcellerne ‘interfaseceller mikrotubuli, hvilket fremgår af en stigning i mikrotubulus polymermasse resulterer i bundling, blev observeret efter behandling med både paclitaxel og kombinationen; dog honokiol alene var ikke effektive i dannelsen af ​​bundter mikrotubulus (fig. 5d). Tilsammen indikerer disse data, at honokiol forbedrer

in vitro

cytotoksicitet af paclitaxel i MDR cancere, kan være gennem inhibering af EGFR-STAT3 overlevelse signalering.

honokiol Forbedrer in vivo-effektivitet af Paclitaxel i MDR cancer xenotransplantattumorer

Vi evaluerede antitumorvirkningen af ​​honokiol, paclitaxel, og deres kombination i behandling MDR cancer i KB-8-5 xenograftmodel. Behandlingen blev fortsat i 4 uger. Som vist i fig. 6a, i en dosis på 20 mg /kg en gang om ugen, en 4-ugers injektion af paclitaxel alene ikke signifikant inhiberer væksten af ​​KB-8-5 subkutane tumorer, sammenlignet med vehikelkontrollen (p = 0,917). Behandling med honokiol alene (50 mg /kg, 3 gange om ugen, via i.p.) svagt undertrykt tumorvækst, selvom forskellen ikke var signifikant (p = 0,194) (fig. 6a). I modsætning hertil kombinationsbehandlingen inhiberede dramatisk væksten af ​​KB-8-5 tumorer, sammenlignet med alle andre grupper (vs. kontrol: p 0,0001; vs. honokiol: p = 0,036; vs. paclitaxel: p = 0,004). Den gennemsnitlige tumor volumen i hver behandlingsgruppe ved endepunkt var 2585.4 ± 510,0 mm

3 (kontrol), 1810.2 ± 483,2 mm

3 (honokiol), 2591.3 ± 726,2 mm

3 (paclitaxel) og 573,9 ± 146.1mm3 (kombination). Repræsentative mus fra hver gruppe er vist i (Fig. 6c). Disse resultater indikerer, at honokiol væsentlig grad kan potensere antitumoraktiviteten af ​​paclitaxel i MDR cancer xenotransplantattumorer.

(a) tumorvækst af KB-8-5 xenotransplantater blev inhiberet signifikant i kombinationen behandlede gruppe sammenlignet med den kontrol (p 0,0001), honokiol (p = 0,0356) og paclitaxel (p = 0,004) behandlede grupper. Tumorvolumener i honokiol (p = 0,1942) behandlede gruppe og paclitaxel (p = 0,9165) behandlede gruppe viste ingen signifikant forskel sammenlignet med kontrol. (b) Kropsvægt af mus i alle grupper. Legemsvægten af ​​mus i alle fire grupper var ens. (C) repræsentative mus fra hver gruppe. (D) Histopatologisk analyse af større organer (lever, milt, nyre, hjerte og lunge) fra kontrol- og kombination behandlingsgruppe. (e) Virkninger af kombinationsbehandling af honokiol og paclitaxel på celledeling, proliferation og apoptose in vivo. Paraffinindlejrede vævssnit fra forskellige behandlingsgrupper blev immunfarvet med anti-KI-67 for celleproliferation, og TUNEL-farvning til påvisning af apoptotiske celler. Apoptotiske celler er vist med grønt; DNA modfarvet med DAPI i blå (forstørrelse 200x).

Vi evaluerede den systemiske toksicitet honokiol, paclitaxel og kombinationen behandling i KB-8-5 xenograftmodel. Sammenlignet med kontrolgruppen, legemsvægten af ​​mus i alle tre behandlingsgrupper var ens, hvilket indikerer en ubetydelig toksicitet under de testede betingelser (Fig. 6b). Konsekvent, histopatologiske analyser fandt ikke nogen betydelig vævsskade i de store organer (herunder lever, milt, nyre, hjerte og lunger) indsamlet fra enhver behandlingsgruppe, herunder kombinationsbehandlingen (fig. 6d).

Vi yderligere udført IHC-analyse for at undersøge

in vivo

effekt af hver behandling på ekspressionen af ​​generelle tumor biomarkører. Den kombinerede behandling reducerede signifikant vævet niveau af Ki-67 i KB-8-5 tumorer (procent af Ki-67 positive celler: 3,84 ± 1,10), når sammenlignet med den i kontrolgruppen (11,96 ± 2,86; p 0,001) , honokiol gruppe (7,18 ± 2,07; p = 0,027), eller paclitaxel gruppe (11.68 ± 1.82; p 0,001) (figur 6e.). Konsekvent, TUNEL-assay viste en signifikant stigning i apoptotiske tumorceller i tumorvæv fra kombinationsgruppen (7,07 ± 2,11) sammenlignet med den i kontrolgruppen (1,64 ± 0,17; p 0,001), honokiol gruppe (5,45 ± 1,19; P 0,05) og paclitaxel gruppe (3,97 ± 3,58; P = 0,08) (fig 6e).. Disse resultater indikerer, at honokiol kunne sensibilisere MDR cancerceller til paclitaxel gennem induktion af apoptose.

Diskussion

På trods af en vis succes med forbigående styre de kliniske symptomer på kræft med kemoterapi, en betydelig procentdel af patienterne udvikle “multilægemiddelresistens” eller MDR, og uundgåeligt fremskridt med ingen helbredelse. Det haster med at udvikle nye strategier for at overvinde MDR og forbedre effekten af ​​kemoterapi. I denne undersøgelse undersøgte vi potentielle anvendelighed af den naturlige forbindelse honokiol i behandlingen af ​​kemoterapi cancer ved anvendelse prækliniske modeller. Vi viste, at honokiol effektivt kunne inducere celledød i kræftceller uanset deres modstand mod kemoterapi narkotika paclitaxel. Betydeligt, honokiol markant øgede

in vivo

effekt af paclitaxel i inhibering af væksten af ​​MDR cancer i en xenograft model. Vi yderligere forudsat molekylære dokumentation for, at honokiol induceret apoptose og øget kemoterapi gennem hæmning af EGFR-STAT3 signalering og nedregulering af flere overlevelse faktorer, herunder survivin, Bcl-2 og Mcl-1. Disse observationer indikerer, at honokiol kunne være lovende i sensibiliserende kræftceller til kemoterapi og forbedre paclitaxel effekt i kliniske omgivelser.

EGFR overekspression har været tæt forbundet med tumor progression, terapeutisk modstand og dårlig klinisk resultat i hoved og hals kræft og andre kræftformer [16], [17], [18], [19]. Den EGFR signalvejen, herunder sine mange downstream veje, såsom PI3K /AKT, ERK1 /2, JAK /STAT3 og mTOR /NF-KB, spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​spredning, overlevelse, migration og kemoresistens i kræftceller. EGFR-signalering, derfor bliver aktivt forfølges som en lovende mål til at udvikle lægemidler til resistente og tilbagevendende hoved- og halscancer og anden kræftform ved hjælp af små molekyle inhibitorer og antistoffer [20], [21]. I denne undersøgelse har vi vist, at honokiol faldt både phosphorylering og ekspression af EGFR, hvilket antyder en inhibering af EGFR-signalering, der er konsistent med tidligere undersøgelser [5]. Som forventet blev det udtryk og aktivitet af flere vigtige komponenter af EGFR-signalering, herunder AKT, ERK og STAT3, også hæmmet i kemoterapi KB celler efter honokiol behandling. En nylig undersøgelse rapporterede, at honokiol nedregulerer varmechokprotein (HSP) 90 i brystcancerceller [22]. HSP90 og andre chaperoneproteiner såsom HSP70 og Hsp40 regulere EGFR nedbrydning. Afbrydelse af HSP70 /HSP90-foldning cyklus fører til ubiquitinylation og nedbrydning af EGFR [23] [24]. Derfor er det muligt, at honokiol fremmer EGFR nedbrydning og inhiberer EGFR signalering gennem en HSP90-afhængig mekanisme.

Adskillige STAT3 målgener, såsom survivin, Bcl-2 og Mcl-1, har centrale roller i reguleringen overleve i cancerceller, og deres overekspression er blevet ofte knyttet til resistens over for behandling (stråling eller kemoterapi), aggressiv tumor adfærd og forkortet overlevelse i mange cancertyper [5] – [11].