PLoS ONE: site-specifik RNase A Aktivitet Blev dramatisk reduceret i Serum fra flere typer af kræft Patients

Abstrakt

Potente RNase aktiviteter blev fundet i serum fra pattedyr, men den fysiologiske funktion af RNaser var aldrig godt illustreret, hovedsagelig på grund af de advarsler i metoder til RNase aktivitet måling. Ingen af ​​de eksisterende metoder kan skelne mellem RNaser med forskellige mål specificiteter. En systematisk undersøgelse for nylig blev gennemført i vores laboratorium til at undersøge site-specificitet serum RNaser på dobbeltstrengede RNA-substrater, og fundet, at serum RNaser spalter dobbelt RNA’er overvejende ved 5′-U /A-3 ‘og 5’ -C /a-3 ‘dinukleotid sites på en måde nøje ligner RNase A. på grundlag af denne konstatering blev et FRET-assay udviklet i den nuværende undersøgelse for at måle denne stedspecifik serum RNase-aktivitet i humane prøver ved anvendelse af et dobbeltstrenget RNA-substrat . Vi viste, at fremgangsmåden har et dynamisk område på 10

-5 mg /ml- 10

-1 mg /ml under anvendelse af seriel fortynding af RNase A. sera af 303 kræftpatienter blev underkastet sammenligning med 128 raske kontrolpersoner , og det blev konstateret, at serum RNase aktiviteter visualiseret med dette stedspecifik dobbeltstrenget probe viste sig at blive reduceret betydeligt i patienter med gastrisk cancer, levercancer, pancreascancer, esophageal cancer, ovariecancer, cervikal cancer, blærecancer, nyrecancer og lungekræft, mens kun mindre ændringer blev fundet i bryst- og tyktarmskræft patienter. Dette er den første rapport ved hjælp dobbeltstrenget RNA som probe at kvantificere stedsspecifikke aktiviteter RNase A i en serum. Resultaterne viste, at RNase A kunne blive yderligere evalueret for at afgøre, om det kan fungere som en ny klasse af biomarkører for visse typer kræft

Henvisning:. Huang W, Zhao M, Wei N, Wang X, Cao H, du Q, et al. (2014) site-specifik RNase A Aktivitet Blev dramatisk reduceret i Serum fra flere typer af kræftpatienter. PLoS ONE 9 (5): e96490. doi: 10,1371 /journal.pone.0096490

Redaktør: Chandravanu Dash, Meharry Medical College, USA

Modtaget: November 19, 2013; Accepteret: April 8, 2014; Udgivet: 7. maj 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Beijing Natural Science Foundation (5132015), National Basic Research Program Kina (2011CBA01102), National High-tech R 0,001), mens serum RNase niveau af brystkræft og tyktarmskræft patienter ikke var meget signifikant forskellig fra den for raske individer

Resultater

design og karakterisering af en FRET Probe for Serum RNase Måling

et velkendt faktum i molekylær biologi er, at enkelt-strengede RNA er meget ustabil i de fleste tilfælde, især i tilstedeværelse af ribonucleaser. De hurtige nedbrydningsprocesser gør det for svært at overvåge nedbrydningsprocessen i realtid. Denne situation yderligere fører til vanskelighederne med at etablere kvantitative målinger af RNase-aktivitet.

Forskellig fra enkeltstrengede RNA, dobbelt-strenget RNA er generelt meget mere stabil. I en nylig undersøgelse profilering serum nedbrydning af dobbeltstrengede siRNA’er, fandt vi, at både lange og korte dobbeltstrengede RNA’er nedbrydes overvejende til to modtagelige steder, nemlig 5′-U /A-3 ‘og 5’-C /A -3 ‘dinukleotid sites [31]. Baseret på dette fund, vi spekuleret på, at dobbeltstrengede RNA’er kan anvendes som substrat til måling af serum RNase-aktivitet. Til dette formål blev en dobbeltstrenget RNA-sekvens udformet til at bære en enkelt 5’-C /A-3 ‘modtagelige site, som blev bekræftet i nedbrydning assay (figur 1A). RNase A er den fremherskende RNase i humant serum, som medierer nedbrydningsprocessen af ​​sådanne dsRNA’er (figur 1b). For at lette overvågningen af ​​nedbrydningsprocessen af ​​denne probe i realtid, blev et FRET-system designet ved at integrere en donor fluorescens FAM og en acceptor fluorescens TAMRA ved 5 ‘enden af ​​hver komponent RNA-strenge. Så længe RNA duplex holder intakt, de to endemærkede fluorescerende farvestoffer er tæt nok til at mediere energioverførsel fra donoren til acceptoren (figur 2A), hvilket fører til en maksimal emission ved 575 nm ved excitation ved 480 nm (figur 2B ). Når duplex nedbrydes, vil energioverførsel fra FAM til TAMRA afbrydes, og peak emission vil skifte fra 575 nm til 515 nm, under de samme excitation betingelser (figur 2B). Derfor måle ændringen af ​​spidsværdien for udsendelse ved 515 nm kan anvendes til at overvåge nedbrydningsprocessen af ​​duplex RNA og afspejler aktiviteten af ​​RNase i systemet (figur 2C).

A) Nedbrydning af en 1860 bp lange RNA duplex blev udført i RNase A. Nedbrydning fragmenter blev ekstraheret og sekventeret. Ved at tilpasse nedbrydningsprodukterne fragmenter med den oprindelige RNA-sekvens, blev spaltningssteder identificeret og præsenteret i form af forholdet for hver mulig dinukleotid site [31]. B) Duplex RNA-nedbrydning assay. Dual-mærket duplex RNA blev separat inkuberet med RNase A, blandingen af ​​RNase A og RNase A-inhibitor, human serum, blandingen af ​​humant serum og RNase A-inhibitor. Prøver blev opsamlet og køre i en denatureret PAGE-gel.

A) Skematisk illustration af FRET baseret RNase-. Duplex RNA (13 bp) blev dobbelt mærket med en fluorescein (FAM) som donor og tetramethylrhodamin (TAMRA) som acceptor i hver ende. B) Normaliseret fluorescensspektret for duplex RNA (13 bp) inkuberet med (grøn linje) eller uden (rød linje) RNase /serum ved 25 ° C i 15 minutter. C) Duplex RNA-nedbrydning assay måling i realtid. Duplex RNA blev annealet og inkuberet i annealing-buffer ved 25 ° C. RNase eller serum blev tilsat på tidspunktet angivet. Fluorescens af donoren (FAM) blev registreret i realtid (udfyldte prikker). Prøver på forskellige tidspunkter (fra venstre mod højre: 0 s, 10 s, 60 s, 180 s, 480 s) blev opsamlet og kørt i en denatureret PAGE gel (indsat). Fluorescens blev scannet på Typhoon viser den resterende mængde af fuld længde dsRNA.

Det er velkendt, at energioverførsel effekt afhænger hovedsageligt af afstanden og den relative orientering af donor og acceptor fluorescens i sonde [32]. På den ene side, en kort probe forøger energioverførselseffektiviteten i FRET, mens det på den anden side en længere probe har en højere smeltetemperatur og er mere stabil. RNA-duplexer af 8 og 13 bp blev undersøgt for at optimere længden af ​​substratet. Resultaterne viste, at 13-bp substrat, med sekvenser 5′-AUGAGCCUGAUUU-3 ‘/3′-UACUCGGACUAAA-5’, var optimal for FRET detektion. Dette RNA duplex blev derefter anvendt som reaktionssubstratet i undersøgelsen.

Optimering af assaysystemet

Til måling RNase aktivitet i systemet, fire mikroliter af 5 uM dual-mærket RNA-substrat var tilsat til 2 ml FRET buffer under konstant omrøring. Før du tilføjer RNase eller prøveemner, blev en baseline kurve optaget ved 480 nm excitation i ca. 30 sekunder, ved hjælp af en QuantaMaster 30 spektrofluorometer (Photon Technology International, Birmingham). Derefter RNase opløsning eller testprøver blev tilsat til reaktionssystemet, og fluorescensen blev registreret ved 515 nm med et interval på 3 sekunder i 15 minutter. Til dataanalyse blev baggrundsfluorescens subtraheres fra prøven fluorescens til opnåelse af en real-tid-kurven, for således at overvåge nedbrydningsprocessen i realtid under behandlingen (figur 2C). En ulineær regressionsmetode (single-eksponentiel ligning) blev anvendt til at tilpasse dataene og opnå den konstante K

obs af nedbrydningen reaktion (figur 3A).

A) Kvantificering af nedbrydning i FRET assay. FAM fluorescerende intensitet omdannes som nedbrydningsprocenten ved at definere bund og top fluorescensintensitet som 0% og 100%. Bunden er fluorescensintensiteten af ​​fuld længde dobbelt-mærket dsRNA; toppen er fluorescensintensiteten af ​​FAM-mærket enkeltstrenget RNA. Den bf

max blev defineret som 100%. Den fluorescerende udlæsning af prøver blev monteret på single-eksponentiel ligning (rød linje) for at opnå hastighedskonstanten K

obs. Procent nedbrydning på et givet tidspunkt blev beregnet som 100 x bf /AF

max. B) Nedbrydning af dual-mærket dsRNA på forskellige koncentration af RNase A, overvåget af FRET assay (fra bund til top: 10

-7 mg /ml, 10

-6 mg /ml, 10

– 5 mg /ml, 0,001 mg /ml, 0,003 mg /ml, 0,006 mg /ml, 0,01 mg /ml). C) Standard kurve af RNase A koncentration og K

obs. K

obs blev opnået som beskrevet i figur 3A. D) K

obs skiftende mønster under frysning-optøning behandling. K

obs bestemmes ud fra humane serumprøver nedfrosset i -80 ° C, og optøet i stuetemperatur fra 0 til 6 gange.

På en sådan måde, en standardkurve blev etableret ved at måle RNAse a aktivitet i seriefortyndede RNase a løsninger, i et koncentrationsinterval between10

-7 til 10

-1 pg /pl (figur 3C). For hver koncentration blev et kinetisk kurve registreres (figur 3A), og en reference kurve blev fremstillet ifølge den beregnede K

obs at beskrive forholdet mellem aktiviteten og koncentrationen af ​​RNase A. En simuleret kurve viste, at nedbrydningen aktivitet steg hurtigt, når RNase koncentrationen blev forøget (figur 3C). Resultaterne viste, at et lineært forhold over et bredt område af RNase A-koncentrationer fra 10

-7 til 10

-3 pg /pl. Efter tilsætning af RNase A 10

-7 pg /pl, fluorescerende signal intensitet steg 1000 A.U., signal støj forholdet var 2 gange. Detektionsgrænsen for FRET-assay var 10

-7 pg /pl. Når RNase-assayet blev udført med 1 × 10

-6 pg /pl RNase A, det fluorescerende signal intensitet steg fra 41000 A.U. til 58000 A.U., og støj i denne analyse var 500. signal støjforhold under 1 × 10

-6 pg /pl er 34 gange. Ifølge denne signal støjforhold, det detekterbare interval var så lav AS1 × 10

-6 pg /pl. Den ikke-lineær regression R

2 på 1 × 10

-6 pg /pl koncentration var 0,9856. Under koncentration på 1 × 10

-5 pg /pl, den ikke-lineære regression R

2 var 0,9945. På den anden side steg det fluorescerende signal intensitet fra 43000 A.U. til 78000 A.U., og signalet støj forholdet var 70 fold. Ifølge R

2 og signalet støjforhold, konkluderede vi, at koncentrationen vifte af RNaser, der let kan måles med denne metode bør være fra 1 × 10

-5 til 0,1 pg /pl.

for yderligere at validere dette analysesystem blev RNase aktiviteter målt for humane serumprøver, der har gennemgået gentagne gange frysning-optøning behandling. Ved nedfrysning prøverne ved -80 ° C og optøning på is i flere tidspunkter blev RNase aktiviteter prøverne målt ved anvendelse af aktuelle FRET metode. Det blev konstateret, at RNase kunne overleve flere frysning-optøning cyklusser uden tab af aktivitet, hvilket indikerer den nuværende metode kan bruges til frosne kliniske prøver (figur 3D).

Måling Serum RNase aktivitet i kræftpatienter

Brug denne FRET-baserede målinger af RNase-aktivitet, blev et sæt humane serumprøver undersøges, herunder 55 raske individer og 34 kræftpatienter, der dækker nogle almindelige kræftformer. Standardkurven ovenfor beskrevne, blev anvendt til at beregne de relative serum RNase koncentrationer af humane serumprøver, og derefter den relative RNase koncentrationen af ​​kræftpatienter blev sammenlignet med den for de sunde individer (gennemsnit af normale kontroller arbitrært var sat til 100%). Resultaterne viste, at serum RNase niveauer signifikant nedreguleret for alle 7 former for kræft typer (Figur 4).

Serum RNase aktiviteter blev bestemt for raske personer samt 4 gastrisk kræftpatienter, 5 kolon kræftpatienter , 5 lunge kræftpatienter, 5 esophageal kræftpatienter, 5 nyre kræftpatienter, 5 livmoder kræftpatienter og 5 bugspytkirtlen kræftpatienter. RNase koncentrationen af ​​hver serumprøve blev beregnet ved standardkurven og K

obs opnået fra enkelt-eksponentiel ligning. Den relative serum RNase aktivitet af hver kræftpatient blev kvantificeret ved at normalisere kræftpatient serumkoncentration med den gennemsnitlige koncentration af sunde individers serumprøver.

For at bekræfte disse observationer, yderligere serumprøver blev indsamlet fra patienter med brystcancer, mavecancer, coloncancer, levercancer, pancreascancer, esophageal cancer, ovariecancer, cervikal cancer, blærecancer, nyrecancer og lungekræft, ved en prøvestørrelse på 303 kræftpatienter i alt. Vurdering af disse prøver udviste en nedregulering af serum RNase niveauer i gastrisk cancer, levercancer, pancreascancer, esophageal cancer, ovariecancer, cervikal cancer, blærecancer, nyrecancer og lungecancer (tabel S1). Der blev ikke observeret tydelige ændringer i serum RNase niveauer for brystkræftpatienter og tyktarmskræft patienter. Disse resultater understøttes i høj grad vores tidligere observationer. Den gastrisk cancer, levercancer, pancreascancer, esophageal cancer, ovariecancer, cervikal cancer, blærecancer, nyrecancer og lungekræft patientgrupper afveg fra sundt gruppe med en P-værdi mindre end 0,001. Til sammenligning er P-værdi for brystkræft gruppe var kun 0,0619, hvilket viser ingen åbenlyse forskel fra kontrolgruppen (figur 5). Samlet set viser disse data viste, at nedregulering af serum RNase-aktivitet er et generelt fænomen i mange almindelige cancertyper. Denne observation antydede et potentiale for stedsspecifik RNase som en almindelige kræftform biomarkør.

Serum RNase niveauer blev kvantificeret for raske personer samt 37 livmoderhalskræft patienter, 37 esophageal kræftpatienter, 37 nyre kræftpatienter, 24 lunge kræftpatienter, 10 blære cancer patienter, 21 pancreas cancer patienter, 23 æggestok kræftpatienter, 32 leverkræft patienter, 27 mavekræft patienter, 31 tyktarmskræft patienter, og 24 brystkræftpatienter (for flere detaljer om data se tabel S1).

Der var 32 leverkræft testet, den gennemsnitlige relative aktivitet sammenlignet med normal kontrol var 32,9%, med P 0,0001. Ud af de 32 prøver, kun 1 prøve faldt i kontrol aktivitetsområdet. Syvogtyve gastrisk cancer patienters serum blev testet, var den gennemsnitlige relative aktivitet var 38,8%, med P 0,001. Der var 24 lungekræftpatienter ‘serum blev testet, den gennemsnitlige relative aktivitet var 29,1%, P 0,0001. Tredive syv esophageal cancer patienters serum og 35 livmoderhalskræft patienternes serum, blev 37 nyrekræft patienternes serum og 21 pancreascancer testet og har vist at have en 21,1% med P 0,0001, 20,2% med P 0,0001, 27,6% med P 0,0001 hhv. Der var 23 ovariecancer patienters sera blev målt, den relative aktivitet af ovariecancer var 28,6%, med P 0,0001, og et tilfælde blev faldet i reguleringsområdet. For blærekræft vi også observeret et særligt tilfælde, der faldt i det normale område, mens den gennemsnitlige relative aktivitet var 29,5%, med P 0,0001. Den brystkræft ikke deler den samme nedreguleret RNase mønster med alle de andre 10 typer af kræft, den relative aktivitet for brystkræft var 61,4%, lidt lavere end de normale individer, men statistisk analyse foreslog en sådan forskel er måske ikke signifikant (P = 0,0619). En lignende situation opstod med patienter tyktarmskræft studerede med den gennemsnitlige relative RNase A-aktivitet på 54,5% og P. 0,05

Ingen Forskel i Serum RNase Niveauer mellem patienter med primær og metastatisk tyktarmskræft

RNase niveauer blev yderligere undersøgt i patienter primære og metastatiske coloncancer, for at undersøge, om de udbredte værdier af RNase aktiviteter i serum fra patienter med coloncancer skyldtes blanding af faser, og om der kan anvendes RNase-aktivitet forskelle at diskriminere forskellige stadier af denne cancer. Serumprøver blev indsamlet fra primære og metastase patienter tyktarmskræft for hvem metastase stadier blev bestemt ved undersøgelse af væv biopsi. Serumprøver fra ti patienter med lymfe-node metastaser og 10 uden metastaser blev opsamlet og analyseret under anvendelse af FRET RNase-. Resultaterne viste ingen forskel mellem de to grupper (figur 6).

Disse rom RNase aktiviteter på 10 primære patienter med tyktarmskræft og 10 metastaser kolon kræftpatienter blev kvantificeret ved FRET assay.

Discussion

en korrelation mellem serum RNase niveauer og kræft i bugspytkirtlen blev først rapporteret af Reddi i 1976. ved hjælp af en optisk metode, de målte niveauet af serum RNase ved at kvantificere dens aktivitet på poly-C-RNA, et ikke- specifik RNase substrat [19]. I slutningen af ​​1970’erne og begyndelsen af ​​1980’erne, blev radioimmunoanalyse implementeret i RNase måling [24], [25], og i nogle undersøgelser E. coli tRNA blev anvendt til at erstatte poly-C som assay substrat [26], disse forbedringer forbedre målenøjagtighed på RNase. Adskillige undersøgelser er blevet udført for at undersøge serum RNase niveauer hos patienter med ondartet karcinom, benign tumor, ryger, nyresvigt, og i særligt patienter med pancreatitis og pancreascancer. Disse undersøgelser viste dog et blandet billede [22], [24]. Selvom Funakushi og Kemmer grupper rapporterede om øget serum RNase niveauer hos patienter med både kræft i bugspytkirtlen og pancreatitis [21], [26], Reddi og Warshaw grupper fundet imidlertid, at RNase niveauet steg kun i bugspytkirtlen kræftpatienter [19], [22], mens serum RNase niveauer af pancreatitis patienter var på et lignende niveau som raske kontrolpersoner [19], [22]. Mitsuhashi og Kurihara grupper på den anden side, fandt, at serum RNase niveauer relateret kun med alderen, rygning samt nogle andre fysiologiske indeks, herunder blod urea nitrogen og albumin indhold [25]. Desuden er en nylig undersøgelse rapporteret forhøjede serum RNase niveauer hos patienter med juvenil diabetes mellitus [33]. Endnu en anden rapport vist, at RNase 1 har ændret ekspressionsniveau af microarray og western blotting metode under gastrisk cancerudvikling [34].

Disse uoverensstemmelser kan skyldes kompleksiteten af ​​Reddi s assay, f.eks reaktionen terminering trin eller stoffet rensningstrin. I disse analyser blev reaktionssystemer lad på is i et stykke tid, før høj dosis af HClO

4 blev sat til at stoppe fordøjelsen. Men i vores undersøgelse, blev det bemærket, at isbad behandling ikke helt kunne afskaffe RNase aktivitet. Yderligere, rensning af ufordøjet polynukleotid kunne være endnu et skridt af komplikationer for Reddi s assay. I dette trin en simpel centrifugering blev anvendt til at fjerne di-nukleotid og tri-nukleotid resulterede fra RNase-spaltning. Denne fremgangsmåde imidlertid også kan også fjerne nogle længere polynukleotider, der ikke var helt fordøjet, fører derfor til overvurderet aktivitet af serum RNase.

Et FRET assay blev anvendt i vores undersøgelse til at registrere fluorescensintensiteten i realtid, for at undgå reaktionen afslutning processen og oprensningstrin. Optagelse fluorescenssignalet ændringer i realtid, og ved anvendelse af et FRET-probe, der kun har én RNase A spaltningssted, tilsyneladende muliggjorde en nøjagtig beregning af K

obs til reaktionen.

I den foreliggende undersøgelse, en FRET-baseret metode blev etableret for at måle serum RNase niveauer konsekvent med en høj følsomhed til at opdage så lavt som 1 × 10

-7 pg /pl RNase. I denne undersøgelse blev udførelsen af ​​spektrofluorometeret systematisk optimeret ved hjælp af Raman spektrum af vand. Dette viste sig at forbedre kvaliteten af ​​målingen og reproducerbarhed mellem tests. Ved at anvende et 2 ml volumen, var vi faktisk i stand til at måle serum RNase niveau uden seriel fortynding, således undgås potentiel afvigelse forårsaget af en 1000 tid fortynding i andre protokoller.

genopdagelse af RNA verden har trukket mere og mere vægt på en række forskellige RNaser fungerer i RNA modifikation og metabolisme. Således en pålidelig metode til RNaser En afsløring kan være plausibel for sådanne undersøgelser. FRET assay etableret i den foreliggende undersøgelse er ikke kun begrænset til RNase måling i serumprøver, men kan også anvendes i mange andre kliniske tests og videnskabelige analyser. Med fortolkning af resultaterne, såsom observeret fald i RNaser En aktivitet i serum af visse typer kræftpatienter behøver et gran af forsigtighed skal træffes, som vi ikke tager medicin af forskellige patienter i betragtning, og der er behov for at om nogen medicin kan hæmme RNase A-aktivitet. Iscenesættelse af patienter udsat for serum RNase måling er naturligvis en af ​​de vigtigste faktorer til at overveje, før indføring RNase som en potentiel biomarkør, og derfor bør testes flere patienter med stadie kræft tidligt at spore den indledende påvisning af fald i RNase A-aktivitet .

Materialer og metoder

Menneskelig Prøvetagning og etiske retningslinjer

Denne undersøgelse har fulgt Helsinki-deklarationen, og udført i henhold til de principper, der er godkendt af den etiske gennemgang bestyrelser Kræftens hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina). Skriftligt informeret samtykke blev fastsatte prøvetagning og efterfølgende analyse. I alt blev 431 serumprøver indsamlet fra raske individer og cancerpatienter og analyseret i undersøgelsen. Kendetegnene for kræftpatient blev beskrevet i tabel 1. sera blev opbevaret ved -80 ° C efter opsamling.

oligonukleotidsyntese og Forberedelse

To komplementære og fluoroforen-mærkede RNA oligonukleotider med sekvenser af 5′-FAM-AUGAGCCUGAUUU og 5′-TAMRA-AAAUCAGGCUCAU blev syntetiseret og oprenset ved TAKARA (Dalian, Kina). Koncentrationer af RNA-oligonukleotidet blev bestemt ved måling af absorptionen ved 260 nm under anvendelse af en NanoDrop spektrofotometer. Ekstinktionskoefficienten blev også målt ved 260 nm, hvilket resulterer i 140.860 L /(mol * cm) for FAM-mærkede RNA-oligonukleotidet og 156.900 L /(mol * cm) til TAMRA-mærkede RNA-oligonukleotidet. De to komplementære RNA-oligonukleotider blev blandet i en annealing-buffer (5 mM Tris-HCl, pH = 7,6, 10 mM NaCl) ved en koncentration på 5 uM. Blandingen blev inkuberet ved 95 ° C i 5 minutter i et termisk cyklusapparat, og derefter blev temperaturen faldt med 5 ° C for hver 5 minutter for at tillade duplex-dannelse. De resulterende duplexer blev kontrolleret i en 20% polyacrylamidgel og visualiseret ved SYBR Gold-farvning (Molecular Probes, Eugene, OR, USA).

FRET Assay Salg

Fluorescensmålinger blev udført i FRET-buffer (0,01 M Tris-HCI, pH 7,4, 0,002 MgCl

2), under anvendelse af en QuantaMaster 30 spektrofluorometer (Photon Technology International, Birmingham).

I 2 ml FRET puffer, 10 nM RNA duplex blev tilsat under konstant omrøring. Excitationsbølgelængden blev sat til 480 nm, og emissionsspektret signal blev målt mellem 500 og 650 nm. En stigning i fluorescensemission ved 515 nm angiver forløbet af RNA-spaltningen. Et eksempel på data indsamlet er vist i figur 2C.

I data normalisering, en intakt 13 bp siRNA blev analyseret som en duplex kontrol, og en helt spaltet siRNA var inkluderet som en nedbrydning kontrol. FAM fluorescensintensiteter blev konverteret som nedbrydningsprocenten ved at definere nederste og øverste fluorescerende intensiteter som 0% og 100%. Normaliseringen metode blev nævnt i figur 3. Fluorescerende aflæsninger blev monteret på single-eksponentiel ligning (rød linje) for at opnå hastighedskonstanten K

obs. Procent nedbrydning på et givet tidspunkt blev beregnet som 100 × bf /bf

max (figur 3A).

For at sikre RNase-fri tilstand, vi indstille excitationsbølgelængden på 480 nm, og undersøgte emission mellem 500 til 650 nm af intakte substrater. Intakt substrat viser lavt signal ved 515 nm og højt signal ved 575 nm, mens nedbrudte produkter resulterer i forhøjet signaler ved 515 nm.

Ifølge beskrivelsen ovenfor, når den dobbelte mærkede 13 bp siRNA i 2 ml FRET buffer blandet med RNase en opløsning eller serumprøver, ville fluorescensen af ​​FAM øges. Ændringen af ​​fluorescens blev overvåget over tid med excitationsbølgelængde indstillet ved 480 nm og emission ved 515 nm. For single-omsætning kinetik analyse, hastighedskonstanten k

obs og amplitude af maksimal nedbrydning F

max blev udledt ved at tilpasse de eksperimentelle data til enkelt-eksponentiel ligning:.

Identification af RNase spaltningssites

for at lokalisere RNase spaltningssteder blev dsRNA nedbrydningsprodukter udvundet og klonet bruger som indkøbscenter RNA gelekstraheringskit og kloning kit fra TaKaRa (Kyoto, Japan).