Abstrakte
Den store betydning af svinebestanden og dens lighed i anatomi, fysiologi, stofskifte, og genetik til mennesker gør det en ideel platform til at udvikle en genetisk defineret, stor dyremodel for kræft. Til dette formål har vi skabt en transgen “oncopig” line kodning Cre rekombinase inducerbare svin transgener koder KRAS
G12D og TP53
R167H, der repræsenterer et almindeligt muteret onkogen og tumor suppressor i humane kræftformer, hhv. Behandling af celler, der stammer fra disse oncopigs med adenovirus kodning Cre (AdCre) førte til KRAS
G12D og TP53
R167H udtryk, der gjorde cellerne omdannes i kultur og tumorigen når indpodet i immunkompromitterede mus. Endelig injektion af AdCre direkte i disse oncopigs ført til en hurtig og reproducerbar tumorudvikling af mesenchymal oprindelse. Transgene dyr, der modtog AdGFP (grønt fluorescerende protein) havde ikke nogen tumormasse dannelse eller ændret histopatologi. Denne oncopig linie kunne således tjene som en genetisk plastisk model for potentielt et bredt spektrum af kræft, samtidig med at kontrollere for tidsmæssig eller rumlig tilblivelse, hvilket skulle vise sig uvurderlig for undersøgelser, der tidligere hæmmes af manglen på en stor dyremodel for kræft.
Henvisning: Schook LB, Collares TV, Hu W, Liang Y, Rodrigues FM, Rund LA, et al. (2015) En Genetisk Svin Model of Cancer. PLoS ONE 10 (7): e0128864. doi: 10,1371 /journal.pone.0128864
Academic Redaktør: Wilfried A. Kues, Friedrich-Loeffler-Institut, TYSKLAND
Modtaget: 15. december, 2014 Accepteret: 3 maj 2015; Udgivet: Juli 1, 2015
Copyright: © 2015 Schook et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir- og fuld RNA-seq data er tilgængelige på ArrayExpress databasen (www.ebi.ac.uk/arrayexpress) under tiltrædelsen nummer E-mtab-3382
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af følgende: China Scholarship Rådet (CSC): WH; Brasiliansk Scholarship Program “Videnskab uden Grænser” fremmes af National Counsel den teknologiske og videnskabelige udvikling (https://www.iie.org/Programs/Brazil-Scientific-Mobility): FMR, TVC og FKS; American Cancer Society (https://www.cancer.org/research/applyforaresearchgrant/) (ACS178898): YL; American Cancer Society (https://www.cancer.org/research/applyforaresearchgrant/) (ACS178898): CMC; I US National Institutes of Health (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm) (CA123031) og Edward Spiegel Fund af Lymphoma Foundation (https://www.lymphomafoundation.org/): CMC; United States Department of Agriculture (USDA) (https://www.csrees.usda.gov/) (AG 58-5438-2-307), De amerikanske National Institutes of Health (https://grants.nih.gov/tilskud /oer.htm) (CA 153.132), Edward William Jane Marr Gutgsell Foundation (https://provost.illinois.edu/about/chairs.html), og Cooperative Research Program for Landbrug Science Technology Development (https://www.csrees.usda.gov/)(PJ009103); Udvikling af Landdistrikterne Administration, Republikken Korea (https://www.rda.go.kr/foreign/eng/): LBS; og US National Institutes of Health (U42 OD011140): RSP. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
En stor dyremodel af kræft ville være gavnligt i indstillinger kræver størrelse, anatomi, stofskifte, eller genetik reflekterende af mennesker, såsom for studier af invasive billede-guidede teknologier, stråling onkologi, lægemiddelmetabolisme, kirurgisk uddannelse, teknologiske udvikling (f.eks forebyggende undersøgelser), for blot at nævne blot nogle få [1,2]. I denne henseende, grisen er en ideel stort dyr platform til at udvikle en sådan model. Disse er store pattedyr med lignende anatomi til mennesker [1,2]. Både deres basal stofskifte og deres xenosensor pregnan X receptor, der regulerer
CYP3A
udtryk, som er ansvarlig for metaboliseringen af halvdelen af alle receptpligtige lægemidler [3], er også meget lig mennesker [4,5]. Ligesom mennesker, grise kræver også flere genetiske ændringer for at udvikle kræft [6].
At udvikle et svin model af kræft, valgte vi at rekapitulere disse mutationer mest almindeligt forekommende i human cancer. Tidligere havde vi vist, at menneskelige mutationer hvis dette er fastsat i genekspressionsstudier hjælp autologe svin fibroblaster resulterede i onkogener molekylært ligner den observeret hos mennesker, og med tilsvarende patologi [6]. I denne undersøgelse har vi målrettet
RAS
gen, som er muteret i en fjerdedel af alle menneskelige kræftformer, med
KRAS
isoform er den mest almindeligt muterede [7] giver en konstitutivt aktiv, onkogen protein [7], eksperimentelt inducerer cancer i mus [8] og humane celler [9], ud over at underliggende en række arvelige cancer syndromer [10]. Genet
TP53
er muteret i en tredjedel af menneskelige kræftformer [11] for at slå denne tumor undertrykkende vej, der ligeledes er kendt for at fremme kræft i både mus [12] og svin [13] genetiske modeller samt i humane celler [9], og er forbundet med cancer prædisposition Li-Fraumeni syndrom [14]. Mutationer i disse to gener forekommer i koncert i humane kræftformer (COSMIC) [15]. Desuden mus genetisk manipuleret til at undergå rekombination at konvertere deres vildtype
Kras
TP53
alleler til onkogen og dominant-negative eller nul versioner, henholdsvis hurtigt at udvikle aggressive kræftformer på de steder, rekombination [16,17]. Med hensyn til svin, både onkogen
Kras
dominant-negative
p53
bidrage til at fremme tumorigen konvertering af normale svin celler til en tumorigen tilstand [6], og grise manipuleret med en mutant TP53 allel er tilbøjelige til at udvikle lymfomer og osteogene tumorer [13]. Senest har en betinget aktiveret onkogene KRAS mutation hos svin blevet rapporteret [18]. Som sådan, valgte vi at ingeniør svin med inducerbar ekspression af disse almindeligt muterede og potente onkogen og tumorsuppressorgener.
Resultater
Oprettelse af oncopigs koder inducerbare onkogene KRAS og dominant-negative TP53
for at oprette en inducerbar svin model af kræft, som vi udtrykket “oncopig”, vi først klonede svin
KRAS
TP53
cDNA fra Duroc (2-14, TJ Tabasco), som blev anvendt til at sekventere svinets genom [19]. Steddirigeret mutagenese blev derefter anvendt til at indføre den onkogene G12D mutation i det porcine
KRAS
cDNA. Denne mutation blev valgt som en asparaginsyre substitution udgør over en tredjedel af mutationerne på G12 position i humane kræftformer [7] og indføre denne mutation i det endogene murine
Kras
gen fremmer tumorigenese [8,20] . Tilsvarende blev R167H mutation valgt som den humane ækvivalent (R175H) er almindeligt forekommende i humane cancere [11] samt cancer prædisposition Li-Fraumeni syndrom [14], og når den indføres i det endogene murine [12] eller porcin [ ,,,0],13]
TP53
gen, inducerer tumorer. Disse to cDNA’er blev derefter indført i en Cre-inducerbar vektor, hvilket gav en ekspressionskonstruktion indeholdende CAG promotor, efterfulgt af den førnævnte LSL sekvens,
KRAS
G12D
, et IRES-sekvens at give mulighed for bicistronisk udtryk,
TP53
R167H
og en poly a sekvens (figur 1a). Dette design giver mulighed for co-ekspression af både
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
i angiveligt nogen celler i gris ved forbigående infektion med AdCre, som i princippet bør tillade induktion af en bred vifte af kræft i specifikke væv steder og på et vilkårligt tidspunkt.
(
en
) Skematisk diagram af vektor-kodning Cre-inducerbare
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
. (
b
) PCR-analyse for tilstedeværelse af
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
i genomisk DNA isoleret fra den angivne klonede afkom.
Normale porcine embryonale fibroblaster [21] blev transficeret med ovennævnte plasmid og stabilt transficeret celle kloner udvalgt i G418-suppleret medium. Genomisk DNA fra cellen kolonier blev brugt til at kontrollere tilstedeværelsen af begge transgener (
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
) ved PCR analyseret under anvendelse af primere specifikke for disse transkripter, og blev efterfølgende udvidet til kilden af kerner for kerneoverførsel. Kerner fra disse celler blev derefter isoleret og overført til tømte svin oocyter og embryogenese aktiveret, en proces kaldet somatisk cellekerneoverførsel (SCNT) [21]. I alt 100 sådanne embryoner blev overført til et surrogat so, der gav fire mandlige oncopig afkom (63-1, 63-2, 63-3, 63-4). PCR-analyse af isolerede genomiske DNA ved anvendelse af primere specifikke for disse transgener bekræftede stabil integration af
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
cDNA’erne (figur 1b).
Cre aktivering af
KRAS
G12D
og
TP53R167H
transgener i fibroblaster afledt af oncopigs er at omdanne
for at vurdere, om
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
transgener kunne være aktiveres for at fremme tumorgenese blev hudbiopsier isoleret fra ovennævnte fire oncopig afkom, og anvendes til at etablere fibroblastlinier. Disse individuelle cellelinjer fra transgene oncopigs blev inficeret med enten adenovirus koder markøren grøn fluorescens protein (AdGFP) eller adenovirus kodende Cre-rekombinase (AdCre), og den resulterende matchede par af inficerede kulturer blev analyseret for transformerede og tumorgene fænotyper. Som forventet, kun AdCre eksponerede celler udviste detekterbare niveauer af
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
mRNA, da vurderet ved RT-PCR (figur 2a). Derudover var der en klar forskel i morfologien af AdCre celler sammenlignet med kontrollen AdGFP celler. Specifikt, den tidligere tabt spindlen morfologi karakteristisk for enten de samme celler før AdCre infektion eller når de er inficeret med AdGFP kontrol virus, og i stedet var mindre, rundere meget mere løst fastgjort til pladen og ville danner spontant foci (fig 2
B
). Denne forskel varslede andre transformerede fænotyper. Specifikt FACS-analyse viste middelværdi cellecykluslængden af alle fire linjer blev forkortet fra 22 timer i AdGFP kontrolpopulation til 13 timer i AdCre populationen (figur 2c). AdCre celler også udviste en middeldiameter 2,8 gange forøgelse i cellemigrering af alle fire linjer i hele tidsforløbet af observation (figur 2d), som vurderet ved en ridse assay og gennemsnitligt produceret 143 kolonier når udpladet i blød agar sammenlignet med ingen kolonier påvist i de kontrol AdGFP celler (figur 2e). Vi konkluderede, at fibroblastlinier udviklede sig fra selvstændigt afledt
KRAS
G12D
/
TP53
R167H
oncopig kloner blev induceret til at være transformeret ved aktivering af ekspressionen af disse transgener efter Cre-rekombinase. AdGFP behandlede transgene celler opretholdt fænotyper svarende til dem observeret for ikke-transgene cellelinjer.
(
en
) RT-PCR-analyse af
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
mRNA ekspression i fibroblast cellelinjer fra hver af de 4 transgene kloner behandlet med AdCre eller AdGFP. (
b
) Sammenligning af cellemorfologi mellem AdCre og ubehandlede kontrol celler i kultur, farvet med H ** p-værdi ≤ 0,01)
Cre aktivering af
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
transgener i fibroblaster afledt af oncopigs er tumorigen
Opmuntret af udviklingen af transformerede fænotyper, vi næste vurderes, om AdCre kunne fremkalde de ovennævnte fibroblaster til at vokse i en tumorigen måde. Således blev AdCre behandlede celler afledt fra fire uafhængigt afledte transgene oncopigs injiceret i immunsvækkede hunmus og injektionsstedet monitoreres for udvikling af tumorer. Tydelige tumorer nåede 2000 mm
3 (den maksimale tilladte størrelse) mellem 32 og 63 dage efter injektion-med komplet penetrans dage (tabel 1). I modsætning hertil blev der ikke tumorer detekteret på de steder injiceret med celler fra de transgene oncopig celler behandlet med AdGFP over en periode på observation (Tabel 1) 130 dage. Vi konkluderer, at fibroblaster isoleret fra uafhængige
KRAS
G12D
/
TP53
R167H
oncopigs blev tilskyndet til at være tumorigen ved aktivering af ekspressionen af disse transgener efter Cre-rekombinase. De tumormasser, der følger af AdCre aktivering af celler fra transgene oncopigs (Fig 3) viste under både høj og lav forstørrelse tegn på fast tumor (Fig 3b) og var ikke resultatet af inflammation eller væskeansamlinger.
Lignende tumorer (a) er udviklet fra alle AdCre cellelinjer og ingen tumorer udviklet fra AdGFP celle injektioner; Histologisk analyse (b) viste tumorerne at være tæt cellulær ikke indkapslet og infiltrativ neoplasme. 10x og indsæt 40X H . E Stain
tumorvæv omfattede ikke-indkapslede, tæt cellulære, og lokalt infiltrativ neoplasma. Neoplastiske celler blev arrangeret i ark og bundter understøttet af meget fine fibrovaskulær stroma. Individuelle neoplastiske celler var runde til spindeloid med mild til rigelige fibrillært til eosinofil cytoplasma. Kerner var single til flere, med runde til ovale form og indeholder enkelt fremtrædende nucleolus og spredt kromatin. Neoplastiske celler udviste moderat til markant anisocytose og anisokaryosis. Mitotiske tal spænder fra 3 til 8 per 10 høj effekt felter (HPF). Områder af nekrose blev spredt i tumoren. Neoplastiske celler havde invaderet omkringliggende væv, herunder skeletmuskel, epidermis, nyre og æggestok. Lille antal lymfocytter og sjældne neutrofiler blev spredt inden for tumorer.
Intramuskulær injektion af AdCre i oncopigs reproducerbart fremkalder tumorer på injektionsstedet
På baggrund af ovenstående observationer, vi næste testede, om eksponering af AdCre
in vivo
ville fremkalde tumorer på injektionsstedet i transgene oncopigs. Til dette formål blev gris 63-3 anvendes til at producere en kohorte af transgene kuld oncopigs til denne analyse. Pig 63-3 blev udvalgt efter DNA-sekvensanalyse indikerer, at transgene konstruktion blev indsat på et enkelt sted inden for intron 4 af den porcine CCDC-129-genet (coiled-coil domæne indeholdende 129) placeret på SSC18. Endvidere blev insertionen orienteret i en 3 ’til 5′ retning i forhold til kromosomet, og der var ingen tegn på en concactomer. Således ville onkogenet konstrukt (figur 1a) fra sender 63-3 blive arvet som et enkelt autosomalt gen.
Den første af disse, oncopig-1, blev administreret AdCre intramuskulært i venstre bagben. En tumor masse blev detekteret på dag 10 efter injektion, som var klart synlig ved ultralyd (tabel 2 og figur 4
en
og 4
d
). Ikke blot var denne svulst hurtigt etableret, men den voksede også hurtigt og nåede et volumen på 8 cm
2 inden for 20 dage. Patologisk analyse af H (G-i) H . E farvede sektioner viser tumoren og tilstødende normale væv (2x) med en indsat høj forstørrelse foto (20x)
Manglen på nogen påviselige ændringer injektionsstedet på d20 post-injektion er vist ved overfladen (a-c); i underliggende væv (d-f); eller ved histologisk undersøgelse (g-i).
Forskellige tumortyper kan induceres i oncopig baseret på injektionsstedet af AdCre
For at undersøge, om injektion af AdCre i andre væv kan føre til tumorer blev en testikel af oncopig-1 injiceret med AdCre. Igen blev en håndgribelig masse opdages 10 dage efter injektion, som hurtigt udviklede sig til en tumor (Fig 4
c
, 4
f
, 4
jeg
og tabel 2) . Histopatologi af denne tumor afslørede en dårligt differentieret tumor sandsynligvis køn ledningen stromal oprindelse. Ligeledes blev øret, mave og hals oncopig-3 injiceret subkutant med AdCre, hvilket igen førte til tumorer på alle tre steder med patologi sarkom med regional glat muskulatur differentiering (leiomyosarcoma) (Fig 4
b
, 4
e
, 4
h
og tabel 2). Således administrationen af AdCre reproducerbart induceret tumorigenese i transgene oncopigs på hvert injektionssted. Administrationen af AdGFP til yderligere oncopigs resulterede ikke i dannelsen af tumor masse eller patologi (figur 5).
Diskussion
Grisen har mange egenskaber, der gør det til en ideel platform til at udvikle en genetisk defineret, stor dyremodel af cancer. Vi har nu rapporterer oprettelsen af en transgen oncopig linje koder for en Cre rekombinase inducerbar transgen kodning
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
, et almindeligt muteret onkogen [7] og tumor suppressor [11], henholdsvis i humane cancere. Denne undersøgelse er en udvidelse på vores tidligere arbejde [6], hvor vi viste, at mutationer i gener identificeret i humane studier når de indsættes i svin gener førte til onkogenese og patologi, der replikeres tumorer observeret klinisk.
validere svin kræft dyremodel er det bydende nødvendigt, at de resulterende tumormasserne valideres med, hvad der observeres i human medicin. Dette behov er blevet klart formuleret af Cardiff [22-24], hvor den neoplastiske progression ved hjælp af musen for brystkræft ved hjælp af humane mutationer undladt at replikere tumorer observeret i klinikken. Således er denne undersøgelse fokuserede på at påvise, at gensplejsede svin tumorer resulterer i histopatologiske fænotyper, der spænder fra signatur fænotyper til efterligne menneskelige kræftformer [24].
Således svine model blev valideret af påvisningen af, at afledte fibroblaster fra transgene oncopigs behandlet med AdCre demonstrerede aktivering af transgenet, der fører til alle
in vitro
kendetegnende for tumorer, herunder en transformeret celle morfologi, øget proliferation og migration, og evnen til vækst i en forankringsuafhængig måde. Efter aftale, disse celler var meget tumorgene når eksplanteret i immunsvækkede mus. Denne effekt var meget reproducerbar, argumenterer imod købet af en unik genetisk baggrund prædisponerende en cellelinje at blive forvandlet, da de samme fænotyper blev observeret i fibroblaster afledt af i alt fire individuelle oncopigs. Tilsammen understøtter disse data den konklusion, at den afledte oncopig fibroblaster er inducerbart tumorigene.
I overensstemmelse med evnen hos den afledte oncopig fibroblaster for at være tumorigen, en intramuskulær injektion af AdCre i transgene oncopigs resulteret i udviklingen af en mesenchymal tumor tyder på leiomyosarcoma på injektionsstedet. Igen, dette resultat var meget reproducerbar, overholdes ikke blot på et andet sted inden for den samme gris, men også i forskellige kuld oncopigs. Som leiomyosarcoma er af glat muskulatur oprindelse, formentlig disse tumorer opstået infektion af denne muskel type, måske i vaskulaturen eller piloerector muskler. AdCre injektion i testiklerne gav anledning til en differentieret tumor sandsynligvis af sex ledningen stromale oprindelse. Desuden hverken kontrol- ikke-transgene grise injiceret med AdCre eller de kontrol- oncopigs injiceret med AdGFP udviklet nogen tumor masse eller patologiske forandringer. Tilsammen understøtter disse data den konklusion, at aktivering af celler in vivo ved AdCre inducerer tumorigenese. Desuden er disse data tyder også på, at induktion af rekombination i andre væv,
vis-a-vis
levering af AdCre ved forskellige midler end foretaget her eller i fremtiden ved vævsbegrænset ekspression af et Cre transgen, kan føre til en masse andre kræftformer. Som sådan er denne ‘oncopig’ line giver en genetisk formbart model for potentielt et bredt spektrum af kræft, hvilket skulle vise sig uvurderlig for undersøgelser, der tidligere hæmmes af manglen på en stor dyremodel for kræft.
Materialer og metoder
Alle dyr arbejde blev udført i overensstemmelse med relevante nationale og internationale retningslinjer. Alle dyreforsøg og procedurer blev godkendt af University of Illinois Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC; Protokol numre 11221 for svin og 12170 for musestudier).
Kloning og sekventering af svin
KRAS
og
TP53
gener i TOPO shuttlevektor
TJ Tabasco porcin knoglemarvsceller blev isoleret og frosset ved -80 ° C. Totalt RNA blev ekstraheret fra disse celler med RNeasy mini kit (QIAGEN, CA), 1 ug hvoraf blev revers transkriberet til cDNA med QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN, CA). Ensembl genom browser blev anvendt til at designe PCR primer sekvenser til forstærkning af svin-specifikke
KRAS
(ENSSSCG00000000561) og
TP53
gener (ENSSSCT00000019534). De fremadrettede og reverse primer sekvenser for
KRAS
var 5′-CTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT-3 ‘og 5′-TTACATAATTATACACTTTGTCTTTGA-3’. PCR termisk cyklisering betingelser for
KRAS
amplifikation var 94 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 3 minutter, og 65 ° C i 1 min med en endelig 72 ° C trin i 10 min. De fremadrettet og revers primer sekvenser anvendt til
TP53
var 5′-TGCAATGGCGGAGTCGCAG-3 ‘og 5′-TCAGTCTGAGTCAGGTCCTTC-3’. PCR termisk cyklisering var 94 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sekunder, og 68 ° C i 1 min med en endelig 72 ° C trin i 10 min.
ACTB
blev anvendt som en endogen kontrol. De fremadrettede og reverse primer sekvenser anvendt var 5′-GACATCCGCAAGGACCTCTA-3 ‘og 5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’. De anvendte PCR-betingelser var de samme som for
TP53
. PCR amplificeret
KRAS
TP53
cDNA’er blev derefter klonet i pCR2.1-TOPO-vektorer under anvendelse af TOPO TA kloning kittet ifølge producentens instruktioner (Invitrogen, CA) og cDNA’erne bekræftet at have 100% nukleotid identitet overfor porcint
KRAS
TP53
(https://useast.ensembl.org/index.html).
site-directed mutagenese af
KRAS
TP53
cDNA
QuikChange steddirigeret mutagenese kit (Stratagene, CA) blev anvendt til at indføre ændringer i nukleotidsekvensen svarende til G12D mutation i det klonede porcine
KRAS
cDNA og R167H mutation i den klonede svin
TP53
cDNA. De anvendte primere til at generere G12D mutation i
KRAS
var 5′-TGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAG-3 ‘og 5′-CTCTTGCCTACGCCATCAGCTCCAACTACCA-3’. De anvendte primere til at generere R167H mutation i
TP53
var 5′-GAGGTGGTGAGGCACTGTCCCCACCAT-3 ‘og 5′-ATGGTGGGGACAGTGCCTCACCACCTC-3’. Mutationer blev bekræftet ved sekventering.
Kloning af
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
cDNA i pIRES vektor
den førnævnte
KRAS
G12D
cDNA blev PCR-amplificeret med primere 5′-CTAGCTAGCTAGCTGCTGAAAATGACTGAATAT-3 ‘og 5′-CCGCTCGAGCGGTTACATAATTATACAC-3’ i 30 cykler ved 94 ° C i 1 min, 94 ° C i 30 sek, 60 ° C i 1 min, og 68 ° C i 1 min, og den resulterende fragment klonet ind i Nhel og Xhol-stederne i pIRES (Clontech, CA ). Den førnævnte
TP53
R167H
cDNA blev PCR-amplificeret med primerne 5′-ACGCGTGGACGTCTTGGCCATATGCAATGGAGGA3 ‘og 5′-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCAGTCTGAGTCAGGTCC-3’ i 30 cykler ved 94 ° C i 1 min, 94 ° C i 30 sek, 65 ° C i 1 min, og 68 ° C i 1 min, og den resulterende fragment klonet ind i
Sal
i og
Ikke
jeg lokaliteter af pIRES indeholdende
KRAS
G12D
cDNA. cDNA sekvenser af
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
blev bekræftet korrekt i den resulterende vektor ved sekventering.
Kloning CAG promotor i en loxP-STOP (polyA) -loxP indeholdende vektor
pkw15 plasmid indeholdende CAG promotoren og pkw13 plasmid indeholdende loxP-STOP (polyA) -loxP blev anvendt til vektoren konstruktion. En KAG promotor blev isoleret ved Spel /Mfel fordøjelse og klonet ind i pkw13 plasmidet ved Spel /EcoRI kloning sites.
Konstruktion af den inducerbare
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
oncopig ekspressionsvektor
KRAS
G12D
–
TP53
R167H
-pIRES vektor blev fordøjet med Pvul og NheI, og det resulterende
KRAS
G12D
-IRES-
TP53
R167H
-polyA fragmenter var geloprenset og klonet ind CAG-LSL-pkw13 vektorer på Pacl /Nhel sites. cDNA sekvenser af
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
i den endelige vektor blev bekræftet korrekt i den resulterende vektor af sekventering
Generation af føtale fibroblast stammer
Mandlige føtale fibroblaster celler (FFC’er) Ved fra Minnesota minigris (NSRRC: 0005). blev indsamlet som beskrevet [25] med visse modifikationer. Kort fortalt, efter fjernelse af hoved og indvolde blev fosteret hakket og fordøjet individuelt i 20 ml fordøjelse medier (Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 15% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS), 200 enheder /ml collagenase og 25 enheder /ml DNasel) i 4-5 timer ved 38,5 ° C og 5% CO
2 i luft. Fordøjede celler blev vasket med DMEM suppleret med 15% FBS (Hyclone, Logan, UT) og 10 ug /ml gentamicin, dyrket natten over, og derefter opsamlet og nedfrosset ved -80 ° C i FBS suppleret med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) ( v /v) og opbevaret i flydende nitrogen.
Produktion af transgene celler Salg
Tidlig passage nummer FFC’er (P1-2) blev dyrket i celledyrkningsmedium (DMEM suppleret med 15% (v /v) FBS, 2,5 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor og 10 ug /ml gentamicin) natten over og dyrket til 75-85% konfluens. Medier blev udskiftet 4 timer før transfektion. FFC’er blev vasket i 1-2 minutter med phosphatbufret saltvand (PBS; Invitrogen) og høstet med 0,05% trypsin-EDTA (Invitrogen; 1 ml pr 75 cm
2 kolbe). Celler blev resuspenderet i celledyrkningsmedium, pelleteret ved 600 x g i 10 min, resuspenderet i 10 ml Opti-MEM (Invitrogen), og derefter kvantificeret under anvendelse af et hæmocytometer og repelleteres. Celler blev resuspenderet i transfektion media (75% cytosalts [120 mMKCl, 0,15 mM CaCI
2, 10 mM K
2HPO4; pH 7,6, 5 mM MgCl
2] [26] og 25% Opti-MEM [Gibco BRL, Grand Island, NY]). Cellekoncentrationen blev indstillet til 1 x 10
6 celler /ml og 200 pi celler blev co-transficeret ved elektroporering med lineariseret mutant
KRAS
TP53
konstruktion indeholdende en Neo selekterbar casette (2 ug). Elektroporering anvendes tre på hinanden følgende 250 V, 1-ms firkantbølgepulserne administreres gennem en BTX ECM 2001 (BTX, San Diego, CA) i en 2 mm hul kuvette. Efter elektroporering blev celler udpladet i en 100 mm skål ved 3.000 celler pr skål i cellekulturmedium. Efter 36 timer blev celler udvalgt ved tilsætning af geneticin (G418; 400 ug /ml) i 10-14 dage, indtil dannelsen af cellekolonier. Genomisk DNA fra de cellekolonier blev anvendt til at verificere tilstedeværelsen af begge transgener ved PCR. Disse celler blev derefter opbevaret i flydende nitrogen indtil anvendelse som donorceller til SCNT.
oocytmodning, SCNT, og embryo genopbygning
Fibroblastceller identificeret til at have integration af transgenerne (
KRAS
TP53
) blev anvendt som donorceller til SCNT i tømte oocytter efterfulgt af elektrisk fusion og aktivering som tidligere beskrevet [27]. I blev modtaget korte, cumulus-oocyt celle-komplekser (p-pille) i fase I modning medium fra ART Inc. (Madison, WI) ca. 24 timer efter høst. COC’er blev derefter dyrket i frisk fase II modning medium for i alt 40 timer i en fugtig atmosfære af 5% CO
2 ved 38,5 ° C. Fase I og II medium blev leveret af ART Inc. Expanded p-piller blev derefter vortexblandet i 0,1% hyaluronidase i Hepes-pufret Tyrodes medium indeholdende 0,01% PVA i 4 minutter for at fjerne cumulusceller.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.