PLoS ONE: B7H1 Expression og Epithelial-To-Mesenchymale Transition fænotyper på kolorektal cancer Stem-Like Cells

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) kan invadere og metastaserer med epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) . Men hvordan de slipper immunovervågning er uklar. B7H1 er afgørende negativ co-stimulerende molekyle, men lidt information om, hvorvidt det fungerer i CSCS. Derfor bestemte vi udtryk for B7H1 og EMT-associerede markører i kolorektal cancer stamceller-lignende celler for at undersøge en mulig immunoevasion måde CSCS. Vi beriget CD133

+ kolorektal cancer celler, som manifesterede de CSCS-lignende egenskaber, såsom højere niveauer af andre stamcellemarkører Oct-4 og Sox-2, tumor sfære danner evne og mere tumorigene i NOD /SCID-mus. Disse CD133

+ celler besidder EMT genekspression profil, herunder højere niveau af Snail, Twist, vimentin, fibronektin og lavere E-cadherin. Desuden CD133

+ celler i både cellelinje og kolorektal cancer væv udtrykte høje negative co-stimulere molekyle B7H1. Endvidere har nogle B7H1

+ cancerceller viste også karakteristisk for EMT, hvilket indikerer EMT-celler kunne undslippe immunangreb under metastase. B7H1 udtryk og EMT fænotyper på CSCS indikerer en mulig immunoevasion måde

Henvisning:. Zhi Y, Mou Z, Chen J, han Y, Dong H, Fu X, et al. (2015) B7H1 Expression og Epithelial-To-Mesenchymale Transition fænotyper på kolorektal kræft Stem-lignende celler. PLoS ONE 10 (8): e0135528. doi: 10,1371 /journal.pone.0135528

Redaktør: Giuseppe Pirozzi, Istituto Nazionale Tumori, ITALIEN

Modtaget: Marts 8, 2015; Accepteret: 22 Juli 2015; Udgivet: 18 August, 2015

Copyright: © 2015 Zhi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (til ZM, nr 30.872.466), National Program på Key Basic Research Project (973 Program) Kina (til ZM, Nej 2010CB529404). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd og den anden hos kvinder [1], men fremskridt i anti-cancer terapi er blevet gjort limitedly i de sidste 50 år. Svigt i anti-cancer terapi tilskrives en subpopulation af cancerceller kaldet kræft stamceller (CSCS), som er de formodede kræft-initierende celler med egenskaber normale stamceller, såsom selvfornyelse, multipotency og ubegrænset spredning potentiale [ ,,,0],2]. Desuden er CSCS menes at være afgørende for lægemiddel-resistens [3]. Derfor antages det, at CSCS er “frø” af dannelse og vanskelig cancer at blive elimineret. Kolorektale CSCS er også blevet isoleret og karakteriseret baseret på CSCS markører, såsom CD133 [4-9]. Salg

CSCS spiller en afgørende rolle i cancer invasion og metastase. For at forstå, hvordan kræftceller metastaserer, er den rolle, epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) blevet grundigt undersøgt i det sidste årti. EMT giver invasive og metastatiske egenskaber, modstandsdygtighed over for behandlinger, og CSCS Fænotypers på kræftceller i forsøgsmodeller [10-15]. Cancerceller gennemgår EMT nedregulerer proteinerne forbundet med celleadhæsion, såsom E-cadherin, og opregulere proteiner udtrykt på mesenchymale celler, såsom vimentin, N-cadherin og fibronectin [13], og transkriptionsfaktorer, herunder

snail

,

Twist

, og

Slug

samt [16]. EMT letter også cancercelle overlevelse efter behandling med anti-cancer-lægemidler, der er målrettet mod receptorer på epitelceller [12, 17]. Hertil kommer, induktion af EMT i cancerceller med narkotika eller overekspression af EMT transkriptionsfaktorer resulterer i erhvervelse af mesenkymale egenskaber og i ekspression af stilk-cellemarkører [18-20]. På den anden side, cancerceller efter behandling med anti-cancer-lægemidler, som har vist sig at berige CSCS, manifestere de fænotyper og genekspression som EMT [21]. Disse resultater indikerer den tætte sammenhæng mellem CSCS og købet af EMT. Men et flertal af patologer stadig refraktære over for EMT teori, fordi endeligt bevis for EMT sker i humane tumorer mangler hidtil.

CSCS besidder iboende biologiske egenskaber til at danne tumor og kan invadere væv gennem EMT. Men det er uklart, at hvordan de unddrage sig immune overvågning til endelig overlevelse i immunkompetente værter. Immunoevasion kan hjælpe CSCS at overleve og derefter danne tumor [3]. Tidligere rapporter har antydet iboende forbindelser mellem immunsuppression og EMT som den snail-induceret EMT inducerede regulatoriske T-celler og forringede dendritiske celler [22]. Tilsammen vi hypotesen immunoevasion er vigtigt for CSCS der undergår EMT gennem paraneoplastisk betændelse region uden immun clearance og derefter gennemføre invasion og metastase. Men data er stadig sparsomme af immunoevasion mekanismer CSCS [3].

B7H1, en ligand af programmeret celledød 1 (PD-1), er blevet kendt som et afgørende co-stimulerende molekyle og spiller en vigtig rolle i induktionen og opretholdelsen af ​​perifer tolerance [23]. B7H1 opreguleres på betydelige former for cancerceller, som tilbyder negative signaler og fører til immunsuppression gennem PD-1-B7H1 interaktionen mellem cancerceller og T-celler [24, 25], hvilket resulterer i tumor-infiltrerende T-celler dysfunktion og Treg rekruttering [26] . Disse træk gør B7H1 blive et lovende mål for bekæmpelse af kræft. Ikke desto mindre er B7H1 udtryk på CSCS ikke kendt godt i kolorektal cancer. Således har vi opdaget B7H1 udtryk i kolorektal cancer i denne undersøgelse og viste B7H1 udtryk og EMT fænotyper på kolorektal cancer stamceller-lignende celler, som kan være mekanismer til CSCS at undslippe immun overvågning og invadere fjerne væv.

Materialer og Metoder

Etik erklæring

de menneskelige kolorektal cancer væv blev opnået fra Southwest Hospital under etiske protokoller er godkendt af den etiske komité i den tredje Military Medical University, Chongqing, Kina. Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke. Dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for tredje Military Medical University. Alle procedurer var i overensstemmelse med National Institute of Health Guide for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

Kræft væv og celler Linje

De humane kolorektale tumorer blev histopatologisk vurderet og klassificeret af tumor- Node-Metastase (TNM) iscenesættelse systemet (tabel 1). Den kolon cellelinie HT29-celler (Katalognummer: TCHu 103, købt den 29. maj, 2010 Fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) blev dyrket i McCoys 5A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Grand Island, NY, USA).

Magnetic cellesortering

HT29 celler blev høstet ved eksponentiel vækstfase med 0,25% trypsin ( indeholdt EDTA) derefter ordnet efter CD133 Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Tyskland) i henhold til instruktionerne producent. De døde celler blev fjernet ved Dead Cell Removal Kit (Miltenyi Biotec) før sorteringen. Den CD133

+ og CD133

– fraktioner indsamles særskilt og farvet med PE-konjugeret human CD133 /2 (293C3) antistof (Miltenyi Biotec). PE-konjugeret muse-IgG2b (Miltenyi Biotec) blev anvendt som isotypekontrolantistof. Cellen renhed blev vurderet ved flowcytometri (BD FACSCanto Ⅱ, San Jose, CA, USA).

Tumordannende analyser i mus

NOD /LtSz-SCID /scid (NOD /SCID) mus (Købt fra Beijing Laboratory Animal Research center, Kina) blev avlet og opretholdt i Individual Ventileret Caging System under forhold godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for tredje Military Medical University. CD133

+ og CD133

– celler blev sorteret og optalt før podning. Cancer celler blev suspenderet i en 1: 1 blanding af medier og matrigel (BD Biosciences, Bedford, UK) og injiceret subkutant i flankerne på 4 mus (ca. 8-10 uger gamle). Hver flanke blev injiceret 1 x 10

4 celler. Væksten af ​​tumorer blev overvåget ugentligt og målte volumen efter længde × bredde × bredde /2. Alle mus blev aflivet efter 7 uger transplantation. De xenotransplantater blev fjernet, fikseret med 10% bufferet formalin, og farves med hæmatoxylin og eosin (HE)

Sphere dannelse assay

ordnet CD133

+ og CD133

. – celler blev dyrket i serumfrit medium (NS-A basalmedium, StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada) plus 10% NS-en mangedobling Supplements (human) (StemCell Technologies), epidermal vækstfaktor (EGF) (20 ng /ml) (StemCell Technologies), basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) (10 ng /mL) (StemCell Technologies) og heparin (2 ug /ml) (Invitrogen). Dyrkningsmediet blev udskiftet hver 3. dag. Billederne af kugler blev taget til fange efter 20 dage ved mikroskop og tælles tal under 100 × forstørrelse i tilfældige visuelle felter. Nogle kugler blev farvet med PE-konjugeret CD133 /2 (293C3) antistof (Milteny Biotect). Nogle tumor sfærer blev dissocieret ved Collagenase Type Ⅳ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og derefter dyrket i serumfrit medium som nævnt ovenfor for at bestemme, om kugler kunne danne igen.

RNA-ekstraktion, cDNA syntese, og Q-PCR

CD133

+ og CD133

– HT29 celler blev opsamlet henholdsvis og tilsat TriPure (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) for at ekstrahere RNA. 500 ng RNA for hver prøve blev omvendt transskriberet i en 20 ul reaktionsblanding (TOYOBO Bio-Technology, Shanghai, Kina). Ekspressionsniveauet af hvert gen blev bestemt ved real-time kvantitativ PCR (Q-PCR). Niveau af produktet blev bestemt ved SYBR Green (TAKARA Biotechnology, Dalian, Kina). Q-PCR blev udført ved Mx3000P qPCR-system (Agilent Technologies) med følgende program: indledende denaturering i 2 minutter ved 95 ° C efterfulgt 45 cykler af PCR (95 ° C i 10 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder, 72 ° C i 30 sekunder). Efter at en cyklus designet af Mx3000P software (95 ° C i 60 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder, 95 ° C i 30 sekunder) blev tilsat til smeltekurveanalyse. Primer sekvenser blev opført i tabel 2. Glyceraldehyd fosfat (GAPDH) blev anvendt som husholdning gen kontrol.

Immunfluorescensfarvning

De frosne sektioner af kræft væv blev farvet efter online protokol (https://www.ihcworld.com/_protocols/general_IHC/immunofl.htm). Antistoffer mod human CD133, B7H1, E-cadherin og vimentin blev anvendt til at bestemme ekspressionen af ​​EMT-markører på CD133 positive eller B7H1 positive celler. Tilsvarende blev antistoffer mod human CD133, B7H1 og EpCAM anvendes til at påvise CD133 og B7H1 udtryk på kræft væv. Detaljerne af antistoffer valg var opført i Tabel 3. Sekundære antistoffer blev indkøbt fra Beyotime Institute Biotechnology, Shanghai, Kina. Diamidino-phenyl-indol (DAPI) (Beyotime Biotechnology) blev anvendt til at farve kernen. Kontroller indbefattede: 1) Blank: bruges antistof fortyndingsbuffer (5% bovint serumalbumin i phosphat-puffer saltvand, pH 7,2) kun; 2) Negativ kontrol: bruges antistof fortyndingspuffer plus sekundære antistoffer; 3) Isotype antistofkontrol: bruges IgG fra antistofarter fortyndet ved hjælp af antistof fortynding buffer plus sekundære antistoffer. Kontroller blev anvendt for at undgå ikke-specifik fluorescens.

HT29-celler farvningsprotokol var magen til cancervæv, men før at celler blev podet på poly-L-lysin (Sigma-Aldrich) forovertrækkes-dækglas, dyrket i McCoy ‘5A medium i 24 timer og derefter fikseret med Fiksering og Permeabilisering Solution (BD Biosciences).

efter farvning blev alle dias holdt i befugtede kamre væk fra lys ved 4 ° C indtil billedoptagelse.

billeder opsamling og ekspressionsanalyse

Alle konfokale billeder blev taget til fange af laser scanning konfokal fluorescens mikroskop (Leica TCS-SP5, Tyskland). Kontroller blev anvendt til at justere korrekt capture tilstand for at undgå ikke-specifik fluorescens interferens. Den samme markør i forskellige dias blev opdaget under de samme betingelser. Ekspressionsniveauer blev målt ved at tælle tilsvarende positive celler i tage billeder. Hver slide blev målt mere end 5 felter og tælles mindst 1000 celler.

Statistisk analyse

Forskellene i xenograft volumener, sfære numre og mRNA-ekspression niveau mellem CD133

+ og CD133

– celler blev analyseret ved Students

t

-test. En

s

-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant forskel. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS software (version 13.0).

Resultater

CD133

+ celler besidder mere tumorigent potentiale og tumor sfære danner evne

Som debatterne af CSCS markører stadig eksisterer [27, 28], kontrolleres vi kræft stamceller-lignende karakteristika sorterede CD133

+ celler først. CD133

+ og CD133

– HT29-celler blev indsamlet til at bestemme cellens tumorgenicitet. Procentdelen af ​​CD133

+ -celler var ca. 90% (Fig 1A). Ti tusinder af CD133

+ og CD133

– blev subkutant injiceret i de forskellige flanker af NOD /SCID-mus. Fra 5 uger efter injektion, tumorerne afledt af CD133

+ -celler begyndte at være signifikant større end dem, der er afledt af CD133

– celler (Fig 1B og 1C). Den CD133

+ celle xenografter viste ondartede histologi ligesom tyktarmskræft (Fig 1D), hvilket tyder på, at CD133

+ celler er mere tumorigene. Desuden sfære dannelse er en af ​​træk af CSCS [4], vi bestemt sfære dannelse af CD133

+ celler og fundet, at CD133

+ celler dannet betydeligt flere tumor sfærer end CD133

– celler i serum- dyrkningsmedium

in vitro

(fig 1E). Endvidere næsten alle celler i CD133

+ celler afledt tumor sfærer udtrykt højt CD133 (Fig 1F). Hertil kommer, efter celledissociering med collagenase, kunne cellerne danner tumor sfærer igen i serum-frit medium (Fig 1G), der angiver selvfornyelse kapacitet CD133

+ -celler. Samlet set har disse resultater viste, at CD133

+ celler besad CSCS-lignende egenskaber.

HT29 celler blev oprenset med CD133 magnetiske perler. Renheden af ​​CD133

+ -celler blev bestemt ved flowcytometri (A). 1 × 10

4 CD133

+ og CD133

– celler blev subkutant injiceret i de forskellige flanker af NOD /SCID-mus. Vækstkurve af xenotransplantattumorer i NOD /SCID-mus viser forskellige evne af tumorigenese i to subpopulationer (B). Kinetikken af ​​tumorstørrelse blev overvåget en gang om ugen (n = 4, middelværdi ± SD, **,

s

0,01) A repræsenterer mus er vist ved 7 uger efter inokulation (C). De dele af xenotransplantater (D) fra CD133

+ -celler (venstre, 200 × forstørrelse) og CD133

– celler (højre, 200 × forstørrelse) blev analyseret med hematoxylin og eosinfarve (bar = 100 um). CD133

+ celler viser meget mere magtfulde af kugle dannelse end CD133

– dem (E). De Histogrammet viser antal kugler, der stammer fra forskellige delpopulationer (**,

s

0,01). Tumor kugler udtrykker CD133 (F, top: neutral lys, nederst: fluorescens, rød, bar = 100 um). Efter dissociation, celler dannede kugler igen (G, nederst) i serum-frit dyrkningsmedium ligesom deres ældre generation (G, øverst) (bar = 100 um).

CD133

+ HT29-celler udtrykker både stamceller-associerede og EMT-associerede molekyler

CSCS er de formodede kræft-initierende celler med egenskaber normale stamceller udtrykker pluripotens markører, såsom Sox-2 og Oct-4 [29-31] . For at bestemme om CD133

+ HT29-celler udtrykker også de stamcelle-associerede faktorer, transkriptionsniveauet af OLT-4 og Sox-2-ekspression blev målt. Som forventet blev to stamcellemarkører okt-4 og Sox-2 udtrykt markant højere i CD133

+ delpopulation (

s

0,05) end CD133

– celler (Fig 2A), som er i overensstemmelse med oktober-4 og Sox-2 overekspression i dårligt differentierede tumorer [32].

relative mRNA ekspressionsniveauer for stamcelle markører okt-4 og Sox-2 (A), EMT forbundet transkriptionsfaktorer Twist og snegl (B), og EMT markørerne E-cadherin, fibronectin og vimentin (C) blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR og normaliseret til GAPDH-ekspression. *,

s

0,05; **,

s.

0,01

Forrige undersøgelse viste, at EMT er involveret i omdannelsen af ​​fase tumorer tidligt i invasive maligniteter [33]. Interessant, akkumulering vidnesbyrd viser, at induktion af EMT fænotyper af forskellige faktorer inducerer også CSC-lignende celler [15]. Det er imidlertid ikke klart, om CSCS display EMT fænotyper. For at løse dette spørgsmål, blev opdaget ekspressionen af ​​EMT-associerede molekyler i HT29-celler, herunder transskription faktorer Sneglen og Twist, epitelial protein E-cadherin, mesenkymale markører vimentin og fibronektin. CD133

+ celler udtrykte betydeligt højere niveauer af Snail, Twist, vimentin og fibronektin end CD133

– celler (

s

0,05) (Fig 2B og 2C). Omvendt E-cadherin ekspression i CD133

+ celler var signifikant lavere (

p

0,05). (Fig 2C), hvilket indikerer CD133

+ celler manifesteret EMT-associerede karakteristika

CD133

+ celler i patientens væv vise EMT fænotyper

Selvom EMT bredt blev undersøgt

in vitro

, det centrale spørgsmål om EMT blev, at den direkte beviser for dette fænomen sker i menneskets cancervæv manglede. For at løse dette problem, blev ekspressionen af ​​CD133 og EMT-fænotypiske molekyler analyseret i humane kolorektale kræft væv. CD133 blev udtrykt dispersedly siden af ​​adenocarcinom reden (figur 3), men ikke i paraneoplastisk væv (S1 Fig). Interessant, fandt vi, at nogle CD133

+ celler udtrykte vimentin (Fig 3B), men ikke E-cadherin i 13/20 opdaget humane kolorektal cancer væv (Fig 3A). Ved farvning disse tre molekyler på den samme sektion, bekræftede vi en del af CD133

+ -celler i forskellige prøver (20% -40% i alt CD133

+ -celler) viste denne fænotype (Fig 3C). Det indikerede direkte beviser for, at nogle CD133

+ cancer stamceller-lignende celler havde EMT fænotyper i humane cancer væv.

Udtrykket af CD133 (rød), E-cadherin (grøn) (A) eller CD133 (rød) og vimentin (grøn) (B) eller CD133 (rød), E-cadherin (grøn) og vimentin (blå) (C) blev bestemt ved hjælp af immunfluorescens-farvning. De nucleuses blev farvet med DAPI (A, B: blå; C: grå). Det er vist en repræsentant for kolon moderat differentieret adenocarcinom, T3N0M0. (Bar = 20 um)

Co-ekspressionen af ​​B7H1 og CD133 i HT29 cellelinje og kolorektal cancer væv

For at undersøge mekanismen hvordan CSCS undslippe immun overvågning, B7H1 ekspression blev bestemt i HT29 cellelinje og kolorektal cancer væv. Vi fandt, at co-ekspression af B7H1 og CD133 var allestedsnærværende i HT29-celler (Fig 4A). For yderligere at bestemme B7H1 udtryk i patientens væv, blev kolorektal cancer væv indsamlet. EpCAM, et luminal epithelial markering, blev anvendt til at skelne kræft reder og stromal region [34]. Vi fandt, at B7H1 primært blev udtrykt i cancerceller i mere end halvdelen (11/20) af kolorektal cancer væv (tabel 4). Mere interessant, omkring 50% af CD133 udtrykkende cancerceller udtrykte B7H1 (Fig 4B og 4C, tabel 4). Desuden B7H1 og CD133 var altid co-udtrykkes i EpCAM

+ -celler (fig 4B og 4C). Det indikerer CD133

+ CSCS kan slippe immun overvågning ved at udtrykke hæmmende molekyle B7H1.

Udtrykket af CD133 (rød) og B7H1 (grøn) i HT29-celler (A) (Bar = 20 pm), og ekspression af EpCAM (blå), CD133 (rød) og B7H1 (grøn) i colorektale cancervæv (b) (Bar = 50 um) blev bestemt ved immunfluorescensfarvning. De nucleuses blev farvet med DAPI (grå). Rektanglet område i billedet er forstørret (C) og viser en typisk co-ekspression af CD133 og B7H1 (angivet med pile). Det er vist et repræsentativt rektal moderat differentieret adenocarcinom, T3N0M0.

B7H1 udtrykker celler vise EMT fænotyper i kolorektale væv

Vi fandt, at B7H1 blev udtrykt på CD133

+ -celler og kan spille en rolle i immunoevasion af cancer stamceller-lignende celler. Det ville være interessant at vide, om B7H1 udtryk er relateret til EMT. For at løse dette direkte, B7H1 udtryk i EMT fænotypiske celler blev bestemt i 11 humane kolorektale cancer prøver, hvor CD133 var co-udtrykt med B7H1. Svarende til tidligere undersøgelser [35], blev B7H1 udtrykt på cancerceller, især på kanten af ​​cancer (Fig 5). I disse tilfælde, især hvor det så ud tumor spirende, fandt vi, at 20% -40% af B7H1expressing cancerceller nedreguleret E-cadherin (fig 5A). Endvidere 10% -25% af B7H1

+ cancerceller udtrykte vimentin, en mesenchymal markør (Fig 5B), eksisterer der angiver EMT fænotype i visse B7H1

+ celler. Tilsammen er det foreslået, at overekspression af B7H1 kan være en af ​​immunoevasive mekanismer ikke kun for CD133

+ CSCS, men også for forbigående EMT fænotypiske kræftceller.

udtryk for B7H1 (grøn) og E- cadherin (rød) (A) eller B7H1 (grøn) og vimentin (rød) (B) blev bestemt ved hjælp af immunfluorescens-farvning. En af B7H1 udtrykkende celler er angivet med en pil. De nucleuses blev farvet med DAPI (blå). Det er vist en repræsentant for kolon moderat differentieret adenocarcinom, T3N0M0. (Bar = 20 um)

Diskussion

CSCS anses for at være den “frø” af kræft og kan beriges ved celle sortering baseret på nogle specifikke overflademarkører. Selvom markører for CSCS stadig diskuteres, cancerceller, der udtrykker visse specifikke molekyler vise CSCS-lignende egenskaber [9]. CD133 er en af ​​markører for hæmatopoietiske stamceller og anses for at være en CSCS markør i kolorektal cancer [5-7, 27, 28, 36]. I denne undersøgelse CD133

+ celler havde CSCS-lignende egenskaber ved at vise evne kugle formgivning og tumorgenicitet, der udtrykker højere niveauer af stamceller markører okt-4 og Sox-2, som blev overudtrykt i dårligt differentierede tumorer [29, 31] . Desuden er disse celler manifesteret EMT genekspressionsprofil, som var blevet betragtet som en vigtig ejendommelighed linker til CSCS [15].

Vores resultater af CSCS-lignende træk af CD133

+ -celler var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [5-7]. I modsætning er der nogle andre resultater viste, at CD133-negative celler besad CSCS-lignende egenskaber i stedet [27, 28]. For eksempel blev en CD133 negativ cellelinie (NANK) etableret fra xenotransplantater, der stammer fra friske kirurgiske prøver af human colon primær og dens æggestokkene metastatiske cancervæv transplanteret ind NOD /SCID-mus [28]. NANK celler besad CSCS-lignende karakteristika såsom kugle dannelse og tumorgenicitet i NOD /SCID-mus. Sammenlignet med vores undersøgelse, kan det konstateres, at oprindelsen af ​​kræftceller var helt anderledes, hvilket kan forstyrre den ensartede resultater. Desuden NANK celler afveg fra deres oprindelige kræft så godt, som det CD133 og CD44 blev udtrykt i original kræft, men snarere svagt i NANK. Det synes derfor, at denne kontrast indebærer kompleks af kræft i stedet fejltagelser forskningsmetoder. Selvom det ikke er streng nok til at bruge CD133 alene til at identificere CSCS, er det bekræftet, at CSCS blev beriget i CD133

+ delpopulation og gjorde det vise CSCS-lignende funktioner. Det er interessant og værdifuldt at udforske de træk af denne delpopulation.

CD133

+ kolorektal cancer celler i både celle linje og kræft væv manifesteret karakteristika gjorde dem specielle og nemmere at invadere og metastaserer. I denne undersøgelse fandt vi, at CD133

+ HT29-celler viste EMT fænotyper og co-udtrykte B7H1, indikerer CSCS kan udtrykke B7H1 at unddrage sig immune overvågning, når de invaderer gennem EMT. Svarende til HT29-celler, CD133 ekspressionsniveauet i kolorektal cancer væv var variabel i forskellige celler. Tidligere undersøgelser har vist, at CD133 blev udtrykt på cancerceller, men ikke haemocytes [4, 5] og de fleste carcinomceller udtrykte en membran glycoprotein EpCAM [34], der betragtes som en af ​​CSC markører i flere carcinoma typer [37] .Vi fandt, at CD133 blev udtrykt på EpCAM

+ celler (fig 4), hvilket indikerer de CD133 udtrykkende celler er kolorektale cancerceller. Selvom EMT er angivet som karakteristisk for CSCS, om der er iboende forbindelse mellem dem forbliver uklart. I tidligere undersøgelser, kunne CSCS-lignende celler dannes ved induceret EMT aktivering i cellelinier eller musemodel [19, 38]. Således troede vi, at lignende fænomen kan eksistere i kolorektal cancer. I den aktuelle eksperiment blev konfokalt mikroskop anvendt til at detektere forskellige markører ekspression i cancere, som kunne observere flere proteiner ekspression i hver celle samtidigt. Som forventet, fandt vi, at CD133

+ celler i humane kolorektale cancer væv havde EMT fænotyper, nedregulere E-cadherin og opregulering vimentin. Dette fænomen skete i en del af CD133-positive celler, som kan være optaget af den grund, at EMT var en dynamisk kurs og svært at fange kontakten. Tilsammen vores resultater tyder den direkte sammenhæng mellem CSCS og EMT i kolorektal cancer væv.

CSCS har iboende biologiske egenskaber til at danne tumor og kan metastaserer gennem EMT. Det ville være interessant at bestemme, hvordan de omgå immun overvågning til endelig overlevelse, især i immunkompetente værter. B7H1 er en afgørende negativ co-stimulerende molekyle, der fører til immunoevasion i kræft. B7H1 udtryk på CD133

+ kræftceller indikerer, at B7H1 kan spille en rolle i CSCS. Senest kliniske forsøg viste, at blokerende PD-1-B7H1 pathway resulterer i relativ god prognose i anticancerterapi og B7H1 ekspression i cancervæv er forbundet med udfaldet af behandlingen [39]. Baseret på hvad vi fundet her, kan denne bemærkelsesværdige resultat være relateret til at kontrollere CSCS ved at målrette PD-1-B7H1 vej. B7H1 betragtes som en bedre mål end en anden negativ co-stimulerende molekyle, CTLA-4, fordi fordelingen af ​​B7H1 /PD-1 aksen er inden tumor mikromiljø mere selektivt [40, 41]. Vores resultater tyder på, at målrette B7H1 kan skade den “prime synderen” af kræft, kræft stamceller, i kolorektal cancer. Desuden er nogle B7H1

+ manifesterede EMT-lignende fænotype, antyder den potentielle tilslutning af immunoevasion og EMT. I transgene mus model, var det blevet bevist, at opregulering af B7-H1 hud epitelceller fremmes EMT og accelererer carcinogenese [42], hvilket var i overensstemmelse med vores fund, at B7H1 udtrykker kræftceller havde EMT fænotyper i kolorektal cancer væv.

samlet set viste vores resultater B7H1 udtryk og EMT fænotyper i CD133

+ celler, med angivelse af de potentielle mekanismer for CSCS at undslippe immun overvågning og invadere fjerne væv. Selvom nogle undersøgelser tvivl om CD133 for CSCS ‘markering, vores resultater antyder, at i CD133

+ subpopulationen et afsnit af celler har kendetegn hjælper celler invadere og danne metastaser, især hvori åbenbare EMT fænotyper og udtrykke B7H1. Sådan en lille del af kræftceller har stærke tumorigenicitet og kunne invadere og metastaserer uden immun angreb, der kan lukke de teoretiske CSCS i funktionelle aspekter. Det er dog stadig uklart, om EMT og B7H1 ekspression af CSCS er to uafhængige begivenheder eller reguleres af den samme signalvej samtidigt. Det blev vist, mTOR signal og hypoxi-inducerbar faktor -1α, hvilket var en vigtig faktor for at inducere EMT, reguleret CD133 ekspression i cancerceller [43], hvilket indikerer, at CD133 ekspression og EMT fænotyper var relateret til hypoxi og kan reguleres af mTOR signal. Endvidere blev B7H1 reguleret af PTEN gennem PI3K /AKT /mTOR signalering i pancreascancer [44]. Disse undersøgelser tydede på, at mTOR signalering kan være involveret i forholdet mellem EMT og immun unddragelse i CSCS. Derefter forsøger vi at finde ud af den pågældende med EMT og immunevasion i CSCS i yderligere undersøgelse vigtig vej, som kan være en afgørende mål i kræftbehandling.

Støtte Information

S1 Fig. CD133 er næppe udtrykkes i paraneplastic væv.

Immunofluorescens af frosne sektion af tyktarmskræft prøve viser, at der er en region af relativ normal ved siden cancer reder, hvor CD133 (rød) er snarere svagere (venstre) end i cancer reden (højre) . DAPI (grå) blev anvendt til at farve nukleare. Det er vist en repræsentant for kolon moderat differentieret adenocarcinom, T3N0M0. (Bar = 50 um)

doi: 10,1371 /journal.pone.0135528.s001

(TIF)

Tak

Vi takker Dr. Yongwen Chen for indsigtsfulde kommentarer, Prof. Lieping Chen for B7H1 antistof og Wei Sun og Liting Wang for fremragende teknisk bistand til billedsamling af laser scanning konfokal fluorescens mikroskop.