PLoS ONE: Polarisering af tumor-associerede makrofager mod M2 Fænotype korrelerer med dårligt respons på Chemoradiation og til nedsat overlevelse i patienter med lokalt fremskreden Livmoderhalskræft Cancer

Abstrakt

Målsætning

vi undersøge den prognostiske rolle af forholdet forbehandling mellem type 1 (M1) og type 2 (M2) tumorassocierede makrofager (TAM’er) i lokalt fremskreden livmoderhalskræft (LACC) patienter behandlet med chemoradiation (CT /RT).

Metoder

84 konsekutive LACC patienter behandlet med cisplatin-baseret CT /RT for en total dosis på 50,0 Gy, efterfulgt af radikal kirurgi blev analyseret. Dobbelt-farvning immunhistokemi af CD163 /p-STAT, CD68 /pSTAT1, CD163 /c-MAF, og CD68 /c-MAF blev udført på tumor prøver udtaget på tidspunktet for diagnosen. TAM’er med CD163 + pSTAT1 + eller CD68 + pSTAT1 + blev defineret M1; CD163 + c-MAF + eller CD68 + c-MAF + defineret M2 fænotype. Antallet af M1 og M2-celler blev talt ved lav forstørrelse ved at evaluere i hvert enkelt tilfælde den samme tumor område. Forholdet mellem M1 og M2 (M1 /M2) blev endeligt opgjort.

Resultater

Hos diagnose, vi observerede en direkte sammenhæng mellem antallet af cirkulerende monocytter og TAM’er (p-værdi = 0,001). Patienter med højt M1 /​​M2 oplevede oftere komplet patologisk respons (ingen residual tumor) til CT /RT, i forhold til sager med lav M1 /​​M2 (55,0% vs 29,5%; p-værdi = 0,029). Ved multivariat analyse M1 /​​M2 (OR = 2,067; p-værdi = 0,037) opstået som selvstændig prædiktor for patologisk reaktion på CT /RT. Kvinder med høj M1 /​​M2 viste en længere 5-år Disease-fri (67,2% vs 44,3%, p-værdi = 0,019), og 5-år Samlet (69,3% vs. 46,9%; p-værdi = 0,037) overlevelse sammenlignet med tilfælde med lav M1 /​​M2. Tilstedeværelsen af ​​en høj M1 /​​M2-forholdet var uafhængigt associeret med en ugunstig overlevelse resultat i multivariat analyse.

Konklusioner

polarisering af TAMer mod en M2 fænotype, som afspejles i en lavere M1 /​​M2 ratio, er en selvstændig indikator for dårlig reaktion på CT /RT, og kortere overlevelse i LACC

Henvisning:. Petrillo M, Zannoni GF, Martinelli E, Pedone Anchora L, Ferrandina G, Tropeano G, et al. (2015) Polarisering af tumor-associerede makrofager mod M2 Fænotype korrelerer med dårligt respons på Chemoradiation og til nedsat overlevelse i patienter med lokalt fremskreden livmoderhalskræft. PLoS ONE 10 (9): e0136654. doi: 10,1371 /journal.pone.0136654

Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, ITALIEN

Modtaget: December 3, 2014 Accepteret: August 6, 2015; Udgivet: 3 September, 2015

Copyright: © 2015 Petrillo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af de relevante resultater på området for primær og sekundær forebyggelse, livmoderhalskræft stadig udgør den anden mest almindelige malignitet hos unge kvinder [1]. Selv i de udviklede lande, er andelen af ​​patienter med lokalt fremskreden sygdom forblev stabil i de sidste ti år [2]. Fra et terapeutisk synspunkt, har eksklusiv samtidig chemoradiation (CT /RT) blevet anerkendt som den standard behandling til patienter med lokalt fremskreden livmoderhalskræft (LACC) [3-8]. På den anden side har andre testpræparater strategier anvender færdiggørelse operation efter kemoterapi eller CT /RT også blevet undersøgt med det formål at forbedre overlevelsen [9-12]. Men uanset den strategi behandling vedtaget, ca. 30% af kvinder med LACC tilbagefald og dø af sygdommen.

Af disse grunde, i betragtning af den høje variabilitet på sigt af overlevelse udfald og reaktion på CT /RT, der er en stigende efterspørgsel af pålidelige prognostiske markører i stand til at hjælpe klinikere med at udvikle mere skræddersyede behandlingsmetoder.

i denne sammenhæng en øget forbehandling cirkulerende monocyt tæller er for nylig blevet anerkendt som en indikator for dårlig prognose hos patienter med planocellulært LACC [13]. Disse resultater tyder stærkt den relevante rolle i livmoderhalskræft progression af rekruttering og differentiering af cirkulerende monocytter i tumorassocierede makrofager (TAM’er). Endvidere er det velkendt, at TAM’er er en meget kompleks population bestående af to fænotyper, hver med specifikke funktioner i tumormikromiljøet [14]. Når det aktiveres af interferon-γ (IFN-γ) eller tumornekrosefaktor α (TNFa), type 1 (M1) TAM’er fremme inflammatoriske immunresponser ved at øge antigenpræsentation kapacitet og inducere Th1 immunitet gennem produktion af cytokiner, såsom IL12 [ ,,,0],15]. På den anden produktion af type 2 (M2) TAM’er af TGFp, PGE2 og immunosuppressive cytokiner IL-10 bidrager til en generel suppression af anti- tumor-aktiviteter [16,17]. På trods af disse interessante biologiske beviser, (M2) TAM’er i kvinder med LACC mangler at blive etableret den kliniske rolle af type 1 (M1), og type 2. Af disse grunde, her undersøger vi den prognostiske rolle M1 og M2 TAMer i en stor serie af LACC patienter indsendt til CT /RT efterfulgt af radikal kirurgi.

Patienter og metoder

Patienter og behandling

Mellem marts 2009 og december 2011 har 84 kvinder med LACC blevet indlagt (at) til Gynækologisk onkologi Units of Catholic University of Rome. De klinisk-patologiske karakteristika af studiepopulation er blevet sammenfattet i tabel 1. Alle patienter indgår i undersøgelsen viste: biopsi-verificeret cervixcancer (fase IIB-IVA), ingen tegn på sygdom uden bækkenet, Eastern Cooperative Oncology Group performance status 2, tilstrækkelig nyre- og leverfunktion, ingen forudgående kræft end basalcellekræft. Alle patienter underskrev en skriftligt informeret samtykke accepterer at forelægges alle de beskrevne procedurer, og for deres kliniske data, der skal prospektivt indsamlet og analyseret for videnskabelig formål. Undersøgelsen har modtaget godkendelse af Etisk Komité Katolske Universitet Det Hellige Hjertes. Forbehandling arbejde op inkluderet samling af sygehistorie, klinisk undersøgelse, bryst radiografi, abdominopelvic magnetisk resonans imaging (MRI), komplet blodtælling og måling af lever- og nyrefunktion, cystoskopi og proctoscopy i tilfælde af klinisk mistanke om blære og /eller endetarmen invasion. Resultaterne af monocyt blodtælling udføres på tidspunktet for forbehandlingen oparbejdning blev hentet og analyseret i den foreliggende undersøgelse. Neoadjuverende CT /RT blev administreret som følger: hele pelvic bestråling i 25 fraktioner (2,0 Gy /dag, i uge 1-2, 5-6, 9, i alt 50 Gy) i kombination med cisplatin (20 mg /m

2 , 2-h intravenøs infusion) og 5-fluorouracil (1.000 mg /m

2, 24-timers kontinuerlig intravenøs infusion), både på dag 1-4, hver 4. uge, i 3 cyklusser [18]. Alle sager blev indsendt syv /otte uger efter afslutningen af ​​samtidig CT /RT til radikal hysterektomi og bækken ± aorta lymphadenectomy. Efter operationen blev patienterne forelagt rutinemæssige opfølgning procedurer. Patologisk reaktion på CT /RT blev defineret: komplet i mangel af resterende tumor efter behandling (pr0), mikroskopisk (pR1) i tilstedeværelse af kun mikroskopisk tumor foci (maks ≤3 mm dimension), og makroskopisk (pR2), når vi observerede vedholdenhed af resterende tumor . 3 mm i maksimal dimension [19]

immunhistokemisk Vurdering af TAM’er

Som nylig offentliggjort, vi brugte udtryk for pSTAT1, og c-MAF i sammenhæng med CD68 eller CD163 at karakterisere

in situ

polarisering af TAM’er [20]. Især blev M1 fænotype defineres som den samtidige ekspression af pstat og CD68, eller pstat og CD163; mens TAM’er med M2 fænotype blev identificeret ved hjælp af kombinationen af ​​c-MAF og CD68, eller c-MAF og CD163 [20].

Dobbelt farvning immunhistokemi af CD163 /pSTAT1, CD68 /pstat, CD163 /c-MAF , CD68 /c-MAF blev udført på formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) livmoderhalskræft prøver udtaget på tidspunktet for diagnosen, før starten af ​​CT /RT. Tre um paraffin vævssnit monteret på poly-L-lysin- coatede slides og tørret ved 37 ° C natten over blev anvendt. Sektioner blev taget formular FFPE områder viser en homogen og stor fordeling af kræft væv, der dækker næsten hele dias. Glassene blev deparaffinised i xilene og re-hydreret konventionelt, blev den endogene peroxidase blokeret med 3% H

2O

2 i H

2O i 5 min. Antigen hentning procedure blev udført ved mikrobølgeovn opvarmning i EDTA pH 8 (2 gange i 4 min.). For at reducere ikke-specifik binding blev snittene inkuberet med 20% normalt gedeserum i 30 minutter ved stuetemperatur. Celler, der udtrykker CD163 eller CD68, blev identificeret efter 1h inkubation ved stuetemperatur ved anvendelse af det monoklonale anti-humant CD163-antistof (1:50; clone10D6, BIOCARE), og det monoklonale antihumant CD68-antistof (1:50; klon PG-M1, DAKO), henholdsvis . Detektion blev udført ved anvendelse af et mærket polymer En Vision-muse + System-HRP (DAKO, Carpinteria, CA, USA), 30 minutter ved stuetemperatur. Diaminobenzidin blev anvendt som et chromogen (DAB-substrat System, DAKO). Efterfølgende blev objektglassene vasket (TBS1X Ph7,5) i 5 minutter, og passende fortyndet c-MAF (polyklonale antihuman C-MAF; 01:50; Santa Cruz) eller pSTAT1 (polyklonale antihumane antistoffer pstat; 01:50; Santa Cruz) blev inkuberet natten over ved 4 ° C. Påvisning blev opnået ved anvendelse af en mærket polymer En Vision-kanin + System-AP (DAKO, Carpinteria, CA, USA), 30 minutter ved stuetemperatur. Fast Red blev anvendt som et chromogen (UCS diagnostisk srl). Snit blev modfarvet med hæmatoxylin og monteret med Glycergel (DAKO). Antallet af mærkede M1 og M2 makrofager blev talt manuelt ved to forskellige forskere (GFZ; EM) uden forudgående kendskab til de kliniske og biologiske parametre, ved lav forstørrelse (5X objektiv) ved at evaluere i hvert enkelt tilfælde den samme tumor område bestående af ti repræsentative høj effekt felter (400x forstørrelse) af vævssnit. Endelig blev M1 /​​M2-forholdet beregnet.

Statistisk analyse

Lineær regression model blev brugt til at undersøge betydningen af ​​klinisk-patologiske variabler som prædiktorer for residual sygdom efter CT /RT. Samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) blev beregnet fra tidspunktet for diagnosen til datoen for død /tilbagefald eller dato for sidste opfølgningsbesøg ifølge M1, M2 og M1 /​​M2 niveauer. Medianer og liv borde efter Tams niveauer blev beregnet ved hjælp af produktet-limit estimat af Kaplan og Meier-metoden, og log-rank test blev anvendt til at vurdere den statistiske signifikans [21,22]. Alle statistiske beregninger blev udført ved hjælp af statistiske Package for Social Sciences (Version 17,0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

De klinisk-patologiske karakteristika hele serien har blevet sammenfattet i tabel 1. Sixty-otte patienter (82,1%) viste FIGO stadie IB2 /IIB, mens 16 sager (17,9%) havde stadie III-IVA. Langt størstedelen af ​​kvinder (84,5%) viste en squamous histotype, og fuldstændig patologisk reaktion på CT /RT blev dokumenteret hos 35 patienter (41,6%). Det mediane antal TAM’er detekteret ved immunhistokemisk analyse i tumorbiopsier truffet på tidspunktet for diagnosen var 12 (0-46), og median antal M1 og M2 makrofager var lig regnskab for 5 (tabel 1). Forholdet mellem antallet af M1 og M2 blev beregnet for hver patient, og medianværdien var 0,600, der spænder fra 0 til 19. Median monocyt tælle på evaluering baseline var 490 /pl (230-1180), og antallet af cirkulerende monocytter udviste en direkte statistisk signifikant sammenhæng med antallet af TAM’er (p-værdi = 0,001, fig 1).

Tomme cirkler repræsenterer antallet af TAM’er og cirkulerende monocytter i hver patient, lineær tendens er også (

s værdi

, og

X

2

er beregnet anvende lineær regressionsmodel).

De medianværdier af M1, M2, og M1 /M2 blev anvendt som tærskelværdier til at identificere patienter med lave og høje niveauer. Repræsentative eksempler på sager med høje M1 og M2 niveauer er blevet tilvejebragt i figur 2A og 2B.

Som vist i tabel 1, blev ingen forskelle dokumenteret på sigt af klinisk-patologiske egenskaber mellem kvinder med høj lav M1 /​​M2. Men andelen af ​​kvinder, der viser pr0 efter CT /RT var næsten dobbelt i gruppen af ​​patienter med for højt M1 /​​M2 i forhold til sager med lave niveauer af forholdet (55,0% Vs 29,5%; p-værdi = 0,029). Ved univariate /multivariat analyse, squamous histotype (OR = 2.120; p-værdi = 0,028), og høje niveauer af M1 /​​M2 (OR = 2.067; p-værdi = 0,037) -forhold dukket op som de eneste uafhængige prædiktorer for PR0 (tabel 2).

Survival Analysis

i juni 2014 den mediane varighed af opfølgning var 28 måneder (7-107) i den samlede serie. Gentagelse og død af sygdom blev observeret i 21 og 20 patienter henholdsvis

Kvinder med høje M1 niveauer viste en længere 5-år DFS (79,7% vs 51,3%; p-værdi = 0,450)., Og 5- yrs OS (74,7% vs 49,0%, p-værdi = 0,249, fig 2C) i forhold til sager med lave M1 niveauer, men disse forskelle nåede ikke statistisk signifikans. På den anden, blev tilstedeværelsen af ​​et stort antal M2 forbundet med en kortere 5-yrs DFS (54,3% vs 64,8%, p-værdi = 0,067), og OS (51,9% vs. 60,3%, p-værdi = 0,236) , men igen forskellene var ikke statistisk signifikant (figur 2D).

i betragtning af den modsatte effekt på overlevelsen af ​​M1 og M2 fænotyper, vi fokuserede vores opmærksomhed på prognostisk rolle M1 /​​M2-forholdet. 5-yrs DFS var signifikant længere hos kvinder med høj M1 /​​M2, sammenlignet med tilfælde med overvægt af M2 (dvs. lav M1 /​​M2) (67,2% vs. 44,3%, p-værdi = 0,019, Fig 3A). Tilsvarende blev tilstedeværelsen af ​​en høj M1 /​​M2 forbundet med en forlænget 5-yars OS sammenlignet med tilfælde med lav M1 /​​M2 (69,3% vs. 46,9%, p-værdi = 0,037, Fig 3B). Med det formål at analysere den uafhængige prognostiske rolle TAMs polarisering, blev Cox ‘regressionsmodel anvendes på overlevelsesdata. Både i univariate og multivariat analyse, niveauer af M1 /​​M2-forholdet (DFS: HR = 0,233, p-værdi = 0,028; OS: HR = 0,245; p-værdi = 0,030), samt baseline monocyt count (DFS: HR = 1,462, p-værdi = 0,043; OS:. HR = 1,181; p-værdi = 0,041) blev uafhængigt forbundet med en reduceret DFS og OS (tabel 3)

diskussion

Efter fremkomsten af ​​CT /RT relevante fremskridt er opnået i prognose af LACC. Men det eksisterer stadig en kohorte af kvinder med nedsat overlevelse på grund af tilstedeværelsen af ​​tumorceller resistente mod kemo og strålebehandling.

For nylig resultaterne af en retrospektiv analyse gennemført i en større serie af kvinder med lokalt fremskreden sygdom påvist, at høj forbehandling cirkulerende monocyt tæller er en uafhængig negativ prognostisk faktor, og det kan bruges som supplerende biomarkør til SCC-antigen [13]. I vores undersøgelse har vi bekræftet disse resultater (tabel 3), hvilket viser for første gang, at der findes en signifikant sammenhæng mellem baseline cirkulerende monocyt optælling og antallet af TAM’er i tumor prøver udtaget på tidspunktet for diagnosen (Fig 1). Disse resultater støtter kraftigt, at der findes en cirkulerende monocyt /Tams akse, der fungerer i regulering livmoderhalskræft progression [23].

Det er velkendt, at tumoren mikromiljø repræsenterer en relevant kilde til kemokiner, der driver ekstravasation af cirkulerende monocytter til tumorstedet [23]. Efter at have nået den maligne væv, et komplekst netværk af cytokiner, herunder IL-4, IL-10 og IL-13 inducerer differentieringen af ​​monocytter til M1 og M2 TAMer [23]. I den forbindelse vores undersøgelse er den første evaluering af den kliniske rolle M1, og M2 TAMer hos patienter med LACC.

Først, vi rapporterer i vores undersøgelse et forhold mellem M1 og M2 på 0,600, hvilket tyder på, at ved diagnose tumormikromiljøet hovedsageligt polariseret mod en M2 fænotype. Disse data er i overensstemmelse med overbevisende beviser tyder på, at M2 makrofager er involveret i processen med udvikling af kræft i flere humane maligniteter, herunder livmoderhalskræft [14]. Mekanismer, som dette sker stadig uklare så yderligere undersøgelser for at undersøge og afklare dem er ønskelige.

Desuden observerede vi, at andelen af ​​kvinder, der viser pr0 efter CT /RT er næsten dobbelt hos patienter med forhøjet M1 /M2 i forhold til sager med en lav M1 /​​M2, og forholdet mellem M1 og M2 makrofager repræsenterer en selvstændig indikator for PR0. Disse data understrege, at differentiering af TAMer mod en M2 fænotype kan fremme udviklingen af ​​resistens over for CT /RT i LACC patienter. Vores resultater er stærkt understøttet af de seneste beviser, der antyder, at betændelse fremmer differentieringen af ​​M2 makrofager, som i sidste ende drive resistens over for platin agenter i livmoderhalskræft cellelinjer [24].

Med fokus på overlevelse, vi ikke observere en korrelation mellem det samlede antal TAM’er og overlevelse (tabel 3). Disse resultater kan let forklares i betragtning af at befolkningen i TAMer består af mindst to undertyper af makrofager med modsatte funktioner [14]. Faktisk var tilstedeværelsen af ​​et stort antal M1 forbundet med en ikke signifikant tendens mod en længere overlevelse, mens forøgede M2-niveauer blev forbundet med en kortere overlevelse, igen uden at nå statistisk signifikans (Fig 2C og 2D). På den anden side, forholdet mellem M1 og M2 niveauer klart vist sig som en meget interessant relevant uafhængig negativ prognostisk faktor, med en stigning på omkring 20% ​​af 5-yrs DFS og OS hos kvinder med højt M1 /​​M2. For nylig er tilstedeværelsen af ​​en stærk intraepithelial infiltration af M1 makrofager blevet forbundet med en stor tilstrømning af T-lymfocytter og en forbedret overlevelse i livmoderhalskræft [25]. I overensstemmelse med disse

in vitro

beviser, vores resultater giver det første kliniske demonstration af, at, (snarere) mere end det samlede antal M1 og M2 celler, polariseringen af ​​TAMer mod en bestemt fænotype bestemmer tumor biologiske funktioner og patienternes prognose.

fra et klinisk synspunkt, skal det overvejes, at et øget antal TAM’er er blevet forbundet med en højere mikrokar tæthed [26], og forbedret VEGF produktion [27] i livmoderhalskræft kræftpatienter. Derfor vil det være nyttigt at undersøge i fremtiden virkningen af ​​polariseringen af ​​TAM’er på tumor angiogenese, især efter indførelsen af ​​Bevacizumab i forvaltningen af ​​livmoderhalskræft kræftpatienter [28]. Disse eksperimentelle og kliniske resultater fik os til at yderligere at evaluere potentielle mål, der udviser tumorigent og immunosuppressiv potentiale relateret til tumorassocierede makrofager. Desuden er vores resultater støtter yderligere prækliniske evalueringer af effektiviteten af ​​de lægemidler rettet mod TAM’er, såsom Trabectedin, i livmoderhalskræft [29].

Vi anerkender, at vores undersøgelse er et af de første ansøgninger i cervikale patienter af kræft en immunhistokemisk metode til at bestemme den

in situ

antallet af M1 og M2 TAMer; dog pålideligheden af ​​vores forsøgsprotokol understøttes af tidligere offentliggjorte beviser [20]

På trods af den potentielle relevans af vores data flere begrænsninger påvirker vores undersøgelse:. den lille stikprøve, den ikke-standardiserede tilgang i vores eksperimentelle protokol tyder på, at yderligere prospektive undersøgelser påkrævet forud at drage endelige konklusioner.

som konklusion, vores resultater viser, at polariseringen af ​​TAMer mod en M2 fænotype ved diagnose, som afspejles i en lavere forhold mellem M1 og M2 makrofager, er en meget interessant markør af dårlig respons på CT /RT og kortere overlevelse hos kvinder med LACC. Vores resultater understreger behovet for at fortsætte yderligere eksperimentelle undersøgelser med molekylær tilgang med henblik på at klarlægge, hvilken rolle i livmoderhalskræft af de specifikke undertyper af TAM’er, herunder også befolkningen i blandet M1 og M2 TAMer som for nylig er blevet vist, er involveret i at fremme tumorvækst i kolorektal cancer [30].