PLoS ONE: Complement C1q Aktiverer Tumor suppressor WWOX at inducere apoptose i prostatakræft Cells

Abstrakt

Baggrund

Tissue ekssudater indeholder lave niveauer af serum komplement proteiner og deres regulerende effekt på prostatakræft progression er stort set ukendte. Vi undersøgte specifikke serum komplementkomponenter i koordineringen af ​​aktiveringen af ​​tumorsuppressorer p53 og WWOX (også kaldet TIL eller WOX1) og kinaser ERK, JNK1 og STAT3 i humane prostata DU145 celler.

Metodologi /vigtigste resultater

DU145-celler blev dyrket natten over i 1% normalt humant serum, eller i humant serum udtømt for en angivet komplement protein. Under komplement C1q- eller C6-fri betingelser, WOX1 og ERK var hovedsageligt til stede i cytoplasmaet uden phosphorylering, hvorimod phosphoryleret JNK1 blev stærkt akkumuleret i kernerne. Eksogene C1q hurtigt genoprettet WOX1 aktivering (med Tyr33 fosforylering) på mindre end 2 timer. Uden serum komplement C9, blev p53 aktiveret, og hyaluronan (HA) vendt effekten. Under C6-fri betingelser, HA-induceret aktivering af STAT3, en forstærker af metastase. Især exogent C1q signifikant induceret apoptose af WOX1-overudtrykkende DU145 celler, men ikke køretøj-udtrykkende celler. En dominant negativ og Y33R mutant af WOX1 blokeret den apoptotiske virkning. C1q forstærkede ikke p53-medieret apoptose. Ved total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi blev det bestemt, at C1q destabiliseret adhærens af WOX1-udtrykkende DU145-celler ved delvis adskillelse og inducere dannelse af klynger mikrovilli for fokal adhæsion især i mellem celler. Disse celler undergik derefter krympning, membranblæredannelse og død. Bemærkelsesværdigt, som bestemt ved immunfarvning blev benign prostatahyperplasi og prostatacancer vist sig at have en signifikant reduceret ekspression af væv C1q, sammenlignet med aldersmatchede normale prostata væv.

Konklusioner /Betydning

Vi konkluderer, at komplement C1q kan inducere apoptose af prostata cancer celler ved at aktivere WOX1 og destabiliserende celleadhæsion. Nedregulering af C1q forbedrer prostatahyperplasi og kræft dannelse grund af svigt af WOX1 aktivering

Henvisning:. Hong Q, Sze C-I, Lin S-R, Lee M-H, He R-Y, Schultz L, et al. (2009) Complement C1q Aktiverer Tumor suppressor WWOX at inducere apoptose i prostatacancerceller. PLoS ONE 4 (6): e5755. doi: 10,1371 /journal.pone.0005755

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: Januar 4, 2009; Accepteret: 5 maj 2009; Udgivet: 1 juni 2009

Copyright: © 2009 Hong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Research var delvist understøttet af Guthrie Foundation for Uddannelse og Forskning, National Science Council, Taiwan (NSC96-2320-B-006-014, 96-2628-B-006-041-MY3 96-2628-B-006- 045-MY3), National Health Research Institute, Taiwan (NHRIEX97-9704BI), de National Cheng Kung University Landmark projekter (C0167), og det amerikanske forsvarsministerium, USA (BC075692) til NS Chang. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hyaluronsyre eller hyaluronan (HA) deltager i en bemærkelsesværdig mangfoldighed af cellulære og fysiologiske begivenheder, herunder fosterudvikling, morfogenese, differentiering, inflammation, sårede healing, immunrespons og cancer progression og metastase [1] – [ ,,,0],4]. HA er involveret i initiering og progression af inflammation på både cellulære og ekstracellulære niveauer [5], [6]. Ved de cellulære niveauer af inflammation, HA rekrutterer neutrofiler, aktiverer makrofager og stimulerer dendritcellemodning. Men i serum HA kan interagere med komplement-proteiner. Naturligt forekommende polysulfaterede glycosaminoglycaner, såsom heparin, begrænse komplementaktivering serum via både klassiske og alternative veje under inflammation [7] – [10]. Styrken af ​​glycosaminoglykaner i hæmme komplementaktivering afhænger af deres omfang og positioner polysulfation. Medmindre konformt ændret, ikke-sulfaterede HA, selv ved høje koncentrationer (1-5 mg /ml), kan ikke begrænse komplementaktivering [7], [11] – [13]. Induktion af serum komplement-aktivering er blevet betragtet som vigtige strategier i at dræbe kræftceller

in vivo

[14], [15]. Cancercelle-afledte inhibitorer til blokering tidlige komplementkomponenter er kendt for at forbedre cancervækst [16]. Ekspression af det alternative forløb inhibitor faktor H i lungecancerceller synes at være afgørende for deres overlevelse [17]. Ikke desto mindre, den funktionelle rolle af hver enkelt serum komplement komponent i reguleringen cancercelleoverlevelse er stort set ukendt.

Ligesom andre væv, er prostata udsat for udsondringer fra blodet, som indeholder lave niveauer af cirkulerende komplementproteiner. Hvorvidt komplementproteiner kontrollere prostata cellevækst og hyperplasi med alderen er ukendt. Her, ved at udnytte sera med udvalgte deletion af komplementproteiner, undersøgte vi, om hver enkelt komplement protein regulerer aktiveringen af ​​tumorsuppressorer og kinaseproteiner i humane prostata DU145 celler. Disse proteiner omfatter ekstracellulær-signal reguleret kinase /mitogenaktiveret proteinkinase (ERK eller MAPK) [18], WW-domæne-holdige oxidoreduktase (WWOX, FOR, eller WOX1) [19] – [21], p53 [22], c -Jun

N

terminal kinase (JNK1), og signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) [23] – [25]. Vi bestemt, at uden serum komplement C1q eller C6 blev de basale niveauer af aktivering eller nukleare ophobning af ERK og WOX1 reduceres betydeligt, mens konstitutiv aktivering af JNK1 indtraf. WOX1 er en tumorsuppressor og proapoptotiske protein [19] – [21; anmeldelser]. Interessant nok i fravær af serum komplement C9, konstitutiv p53-aktivering forekom. Høj molekylstørrelse HA inducerede signifikant aktivering af STAT3 i DU145, kun når C1q var til stede i serum. STAT3 fremmer prostatacancer invasion [23] – [25]. Endelig C1q alene var i stand til at aktivere ektopisk WOX1 dræbe prostata kræftceller. Vi diskuterede det sandsynlige scenario for cirkulerende eller pericellulært HA og supplere proteiner i reguleringen af ​​kræft cellevækst og død via aktivering af p53, WOX1, JNK1, og STAT3.

Resultater

Complement C1q aktiverer tumorsuppressor WWOX /WOX1 i human prostata DU145 celler

Vi afgøres, om C1q aktiverer endogen WOX1 for nuklear akkumulation. Betydelige beviser viser, at WOX1 er en tumorsuppressor [19] – [21], [26]. Phosphorylering af WOX1 på Tyr33 (p-WOX1) er afgørende for dens apoptotisk aktivitet både

in vitro

og

in vivo

[27] – [31]. Ikke desto mindre, under den indledende hyperplasi og cancer faser, er der en signifikant opregulering af WOX1 ekspression og Tyr33-phosphorylering i prostata, hud og bryst, og at ekspressionen reduceres dramatisk i malignitet og metastase

in vivo

[21] , [29], [32]. Murin WOX1 /Wwox er kritisk for postnatal overlevelse, for så vidt som de knockout-mus kunne overleve kun i én måned [20], [33]. Også dette protein er essentielt for normal knoglemetabolisme [33]. De mekanismer vedrørende kontrol for WOX1 at udøve prosurvival eller proapoptotiske funktioner mangler at blive etableret.

Humane DU145 celler blev dyrket natten over i tilstedeværelsen af ​​varme-inaktiveret føtalt kalveserum (10%), efterfulgt af sult for en time uden serum. Disse celler blev derefter behandlet med renset C1q i 1 time. Lokalisering af p-WOX1 blev bestemt ved immunofluorescens-mikroskopi. Disse udsultede celler havde meget lave niveauer af cytoplasmatisk p-WOX1 (fig. 1A). Exogent C1q hurtigt induceret akkumulering af p-WOX1 i kerner (fig. 1B). Til sammenligning når de udsultede celler blev dyrket i 1% C1q-depleteret (ΔC1q) humant serum i 1 h blev p-WOX1 hovedsagelig lokaliseret i cytoplasmaet (fig. 1C). Rekonstituering af ΔC1q serum med oprenset C1q hurtigt induceret p-WOX1 akkumulering i kerner (fig. 1D).

(a, b) DU145-celler blev dyrket på dækglas og dyrket natten over i 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum. Cellerne blev derefter sultet under serumfrie betingelser i 1 time, efterfulgt af behandling med eller uden oprenset C1q (1 ug /ml) i 1 time. Lokalisering af endogen Tyr33-phosphoryleret WOX1 (p-WOX1) blev bestemt ved immunofluorescens-mikroskopi. (C, D) Desuden udsultede celler blev derefter dyrket i 1% C1q-depleteret humant serum (ΔC1q serum) i 1 time, i nærvær eller fravær af eksogent C1q (1 ug /ml). (E) Tilstedeværelse af p-WOX1 i kerner er vist fra tælle -100 celler i 3 forsøg (gennemsnit ± standardafvigelse).

Complement C1q aktiverer ektopisk WOX1 til induktion af apoptose af DU145 celler

Vi afgøres, om C1q aktiverer ektopisk WOX1 for induktion af apoptose. DU145-celler blev transficeret med EGFP-WOX1 (mærket med EGFP) eller EGFP alene ved elektroporering. Disse celler blev dyrket natten over (i 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum), efterfulgt af behandling med oprenset C1q i 24 timer. C1q forbedret WOX1-induceret apoptose og vækst suppression af DU145 celler på en dosis-relateret måde, som afsløret ved en forøget cellepopulation ved SubG1 fase og en reduceret population ved G0 /G1-fasen af ​​cellecyklussen (fig. 2A og 2B og supplerende fig. S1). I kontrol, har C1q ikke inducere apoptose i DU145 celler, der overudtrykker EGFP vektor eneste (fig. 2A og 2B).

(A) DU145 celler blev transficeret med EGFP-WOX1 (mærket med EGFP) eller EGFP alene ved elektroporation , dyrket natten over, og derefter behandlet med renset C1q (1 ug /ml) i 24 timer. C1q forbedret WOX1-induceret apoptose af DU145 celler (se stigninger i SubG1 fase). I vektor kontrollerne, havde C1q ikke øge apoptose i DU145 celler, der overudtrykker EGFP. (B) en repræsentativ datasæt fra 3 eksperimenter er vist i søjlediagrammet. Lignende resultater blev observeret ved transfektion DU145-celler med forskellige mængder af WOX1, efterfulgt af behandling med 1 ug /ml C1q natten over (se supplerende fig. S1). WOX1: EGFP-WOX1. Vektor: Kun EGFP. Ingen ep: celler uden elektroporation. (C) Stabile transfektanter af BCC celler til at udtrykke EGFP eller EGFP-hWOX1 (human WOX1 /WWOX) blev etableret. Ved time-lapse mikroskopi, C1q (1 ug /ml) inducerede død hWOX1-udtrykkende celler, men ikke EGFP-udtrykkende celler. Disse hWOX1-udtrykkende celler syntes at undergå typiske apoptose, som de udviste celle krympning og membranblæredannelse i en tid-relateret måde. En repræsentativ data vises fra 5 eksperimenter.

forøgelse af apoptose ved C1q skyldtes ikke dets aktivering af komplement kaskade i føtalt bovint serum, for så vidt som serum var varmeinaktiveret. Også under serumfrie betingelser, exogent C1q forbedret ektopisk WOX1-medieret apoptose (data ikke vist). Disse observationer antyder, at WOX1 er en nedstrøms effektor af C1q-medieret apoptose, uden inddragelse af komplementaktivering.

Under tilsvarende forsøgsbetingelser viste vi, at C1q øget apoptose i celler, der overudtrykker WOX1. Disse omfattede bryst MCF7 (Supplerende Fig. S2), og neuroblastom SH-SY5Y (Supplerende Fig. S3) og SK-N-SH-celler (data ikke vist). Igen blev ingen effekt observeres ved hjælp af celler kun overeksprimerer EGFP.

Samtidig stabile transfektanter af huden basalcellekræft (BCC) celler til at udtrykke EGFP eller human WWOX /WOX1 (hWOX1 tagget med EGFP) blev etableret ved hjælp af G418 udvælgelse. Ved time-lapse mikroskopi viste vi, at BCC celler, der udtrykker EGFP var resistente over for C1q-medieret celledød, hvorimod hWOX1-udtrykkende celler var følsomme til C1q (fig. 2C). Disse hWOX1 udtrykkende celler syntes at udvise typiske morfologi af apoptose, herunder cellens svind og membranblæredannelse.

N

terminal Tyr33-phosphoryleret WW domæne WOX1 er ansvarlig for C1q-induceret apoptose af DU145 celler

Vi bestemmes som domæne (r) i WOX1 deltager i C1q-medieret apoptose af DU145 celler. Menneskelig og murine WWOX /TIL /WOX1 er sammensat af to

N

terminale WW-domæner, et kernelokaliseringssekvens, og en

C

terminal kortkædede alkoholdehydrogenase /reduktase (SDR) domæne [19-21,34; anmeldelser]. En dominerende negativ-WOX1 (dn-WOX1) er designet tidligere, med ændringer i

N

terminale første WW-domæne [27]. dn-WOX1 vides at blokere apoptotiske funktion p53 og forhindre phosphorylering af endogent WOX1 ved Tyr33 [27]. Når DU145 celler blev forbigående overudtrykt med dn-WOX1 (EGFP tag), cellerne modstået C1q-induceret apoptose (fig. 3). I kontroller blev celler transficeret med en EGFP kun vektor, og cellerne undergik ikke apoptosis i respons på C1q (data ikke vist eller se fig. 2). I positive kontroller, blev ikke-transficerede celler behandlet med staurosporin at inducere apoptose (fig. 3).

(A) DU145 celler blev elektroporeret med forskellige mængde af dn-WOX1 (EGFP tag) eller EGFP alene, efterfulgt ved dyrkning i 24 timer. dn-WOX1-udtrykkende celler blev behandlet med C1q (1 ug /ml) natten over blev og cellecyklus analyse udført. EGFP-udtrykkende celler blev behandlet på lignende måde (data ikke vist). Desuden blev ikke-transficerede kontrolceller behandlet med eller uden staurosporin (1 uM) natten over. (B, C) en repræsentant datasæt for både SubG1 og G0 /G1 faser er vist (fra 3 eksperimenter).

Således baseret på de ovennævnte observationer,

N

terminale WW domæne WOX1 sandsynligvis vil være ansvarlig for C1q-induceret aktivering af WOX1 for drab kræftceller. DU145-celler blev transficeret med

N

terminale WW-domænet af WOX1 (WOX1ww med en EGFP tag) eller EGFP kun ved elektroporering og dyrkedes i 24 timer. Ved time-lapse mikroskopi af levende celler, eksogene C1q induceret apoptose af celler, der udtrykker de WW domæner (Fig. 4A). Celle krympning og kernekondensering forekom ca. 100-130 min efter udsættelse af celler til C1q. Dette er et typisk tilfælde af apoptose. Når DU145-celler blev cotransficeret med WOX1ww og dn-WOX1 blev C1q-induceret apoptose mindsket (fig. 4B). Tyr33 fosforylering i WOX1 spiller en central rolle i apoptose både

in vitro

in vivo

[27] – [31]. Vi ændret Tyr33 til Arg33 i første WW-domænet [27], [35], og konstateret, at C1q ikke mægle apoptose, når celler udtrykte denne mutant protein (fig. 4C). I vektoren kontrolceller, blev der ikke observeret apoptose (fig. 4D). C1q-medieret celledød blev ikke observeret i disse kontrolceller efter længere inkubation i mere end 8-24 timer, hvilket svarer til de førnævnte observationer (fig. 2).

(A) Live DU145 cellecentre udtrykker

N

terminale WW domæne (WOX1ww; EGFP tag) blev behandlet med C1q (1 pg /ml), efterfulgt af optagelse af morfologiske ændringer ved automatisk time-lapse mikroskopi (én ramme pr 10 min). Celle krympning og kernekondensering forekom ca. 100-130 min efter udsættelse af celler til C1q. (B) Når celler blev cotransficeret med WOX1ww og dn-WOX1 blev C1q-induceret apoptose betydeligt reduceret. (C) Ændring af Tyr33 til Arg33 i WOX1 forårsagede ikke C1q-medieret celledød. (D) nr apoptose blev observeret i celler, der udtrykker EGFP kun ved udsættelse for C1q. I forhold til de ovennævnte eksperimenter blev C1q koncentration forhøjes for de time-lapse mikroskopi eksperimenter. Et repræsentativt datasæt er vist fra 5 eksperimenter. Ca. 100 celler blev undersøgt i slutningen af ​​time-lapse mikroskopi. En fusionerede foto af cellen udtrykker grøn fluorescens og lyse felt billedet vises (før udfordre med C1q).

C1q /WOX1-induceret apoptose blev yderligere bekræftet ved internukleosomal DNA-fragmentering analyse ved hjælp agarose gelelektroforese. Resultaterne viste de spaltede DNA stiger som induceret af C1q i WOX1-udtrykkende DU145 og SH-SY5Y-celler (fig. 5 og supplerende Fig. S4). I passende kontrolforanstaltninger celler, der udtrykker EGFP eller ingenting, havde C1q ikke inducerer DNA fragmentering (Fig. 5 og supplerende Fig. S4).

(A) DU145 celler blev elektroporeret med cDNA udtryk konstruktioner af WOX1, dn-WOX1 ( DN), og /eller p53. 24 timer senere blev cellerne eksponeret for C1q i 8 timer. I passende kontroller blev celler elektroporeret med medium (Sham) eller uden elektroporation (Cont). Ingen DNA-fragmentering blev vist i disse kontroller. C1q øget DNA-fragmentering i celler, der udtrykker WOX1, men ikke p53. C1q undertrykt p53 /WOX1-øget DNA fragmentering. dn-WOX1 inhiberede celledød forårsaget af p53. (B) Intensiteten af ​​DNA fragmentation blev kvantificeret ved Photoshop, og gennemsnittet resultater vist i søjlediagrammet var fra to eksperimenter. Den “Sham” kontrol (uden C1q behandling) betragtes som 0%.

C1q øger ikke p53-medieret apoptose

Vi har vist, at tumor suppressor p53 fysisk interagerer med WOX1 kan og begge proteiner forårsage apoptose i en synergistisk måde [26], [27], [30]. Vigtigere, WOX1 stabiliserer p53 og forhindrer dens nedbrydning [30]. Vi bestemt rolle p53 og WOX1 i C1q-regulerede celledød. Når DU145 celler blev transient overudtrykt med p53, havde C1q ikke væsentligt forøge graden af ​​DNA fragmentation (fig. 5A og 5B). I kombination, både p53 og WOX1 øget DNA-fragmentering. Interessant C1q undertrykte DNA fragmentering i p53 /WOX1-udtrykkende celler. Efter aftale med vores tidligere observationer [27], dn-WOX1 blev vist at hæmme p53-medieret DNA-fragmentering (fig. 5A og 5B).

Ektopisk WOX1 inducerer dannelse af klynger mikrovilli mellem DU145 celler og C1q forbedrer klyngen dannelse

Vi undersøgte celle morfologiske ændringer forårsaget af ektopisk udtryk med EGFP eller EGFP-WOX1 i DU145 celler, plus effekten af ​​C1q. Time-lapse mikroskopi viste, at C1q induceret svind og membranblæredannelse af WOX1-udtrykkende DU145 og BCC celler under behandling for 2-4 timer eller længere (fig. 2C og 4A). Når DU145 celler blev overudtrykt med EGFP og dyrket natten over, disse hvilende celler adhæreret fladt på dækglasset overflade, som bestemt ved total indre refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi (fig. 6A). TIRF billeddannelse foranstaltninger protein dynamiske begivenheder på cellemembranen og cytoskeletale områder [36], [37]. Interessant transient overudtrykt EGFP-WOX1 induceret punktformig formation på celleoverfladen, og disse punctates, indeholdende EGFP-WOX1, var for det meste samlet i mellem celler (figur 6B;. Se pilespidser). Ved en højere forstørrelse, disse punctates var faktisk mikrovilli, der er brug for fokal adhæsion (Fig. 6C). Især er mange af disse WOX1-udtrykkende celler klæbet på dækglasset overflade hovedsageligt ved pericellulært mikrovilli, som deres ventrale områder blev løsnet fra overfladen. Under behandling i 1 time, C1q steget markant dannelsen af ​​klynger mikrovilli i mellem celler (figur 6B;. Se pilen). Denne handling ser ud til at destabilisere celleadhæsion til efterfølgende krympning, membranblæredannelse og eventuel død. Efter aftale med vores seneste rapport [38], WOX1 kan være forbundet med celleoverfladen hyaluronidase Hyal-2.

(A) Når DU145 celler blev transficeret med EGFP og dyrket natten over, disse celler klæbet fladt på dækglasset overflade, som bestemt ved TIRF mikroskopi til måling af den grønne fluorescens på cellemembranen og cytoskeletale områder (600 ganges forstørrelse). Epi: epifluorescens. (B) I modsætning hertil forbigående overudtrykt EGFP-WOX1 inducerede dannelsen af ​​punctates, som dukkede op i klynger, på celleoverfladen (se pilespidser, 600 × forstørrelse). C1q signifikant øget punktformige dannelse, især i mellem celler (se pilen). Stigninger i antallet af punctuates er ca 3-6 gange. (C) De klynger punctates, som er rige på EGFP-WOX1 udtryk, er faktisk mikrovilli på celleoverfladen (600 × forstørrelse ved mikroskopi og 3x digital forstørrelse).

C1q udtrykkes i arkiv prostata vævsprøver og betydeligt nedreguleret i hyperplasi og kræft prostata væv

ovennævnte observationer antyder, at serum- eller vævsafledt komplement C1q kan fremkalde WOX1 aktivering

in vivo

og dermed begrænse kræft progression. Mens ændringer af menneskelig

WWOX

gen forekommer hyppigst i prostata og bryst [20], [21], [34], undersøgte vi ekspressionen af ​​C1q i arkivers prostata væv fra postmortem patienter. Ved immunfluorescensmikroskopi, vi fastslået, at i forhold til alder-matchede prostata væv, er C1q signifikant nedreguleret i benign prostatahyperplasi (BPH) og prostatacancer (fig 7A og 7B;. 100 × forstørrelse). Ved en højere forstørrelse, blev C1q vist at udtrykke i de basale og epitelceller arkiveringsmulighederne prostata vævsprøver, og C1q blev colocalized med p-WOX1 i disse celler (fig. 7C).

(A) Prostata væv, herunder normal prostata, BPH og prostatacancer, blev farvet med specifikt antistof mod C1q og derefter med sekundært fluorescerende antistof. Kerner blev farvet med DAPI (100 × forstørrelse). (B) C1q signifikant nedreguleret i BPH og prostatacancer, i forhold til alder-matchede prostata væv (

s

0,0001, n = 5; Studerendes

t

test). Når ikke-immunt serum blev anvendt som kilde til primært antistof, blev intet signal observeret (data ikke vist). (C) C1q udtrykkes i den basale og epitelceller arkiveringsmulighederne normale prostata kirtler (400 ganges forstørrelse). Både C1q og p-WOX1 er colocalized i disse celler. Kerner blev farvet med DAPI. Lignende resultater blev observeret med arkiveringsmulighederne kirtel celler fra BPH. I forhold til de normale prostata væv, blev eksponeringen tid til at tage billederne for BPH steget. Scale bar, 100 um.

Serum supplere C1q og C6 er grundlaget for basal phosphorylering af ERK og WOX1 i DU145 celler

Vi undersøgte, om nedregulering af C1q

in vivo

kan reducere aktiveringen af ​​tumorsuppressorer

in vitro

, hvilket giver en bedre overlevelse for prostata kræftceller. DU145-celler blev dyrket natten over under serumfrie betingelser, i nærvær af 1% normalt humant serum, eller 1% humant serum med udtømning af C1q, C6, C7, C8, C9 eller. Ved Western blotting, vi konstateret, at både ΔC1q og ΔC6 sera ikke kunne støtte konstitutiv ekspression af WOX2 (en isoform af WOX1) og p-ERK i DU145 celler (fig. 8a og 8b), tyder på, at serum C1q og C6 komponenter er vigtigt til ekspression af disse proteiner. Til sammenligning komponent C7, har C8 og C9 ikke støtte ekspressionen af ​​WOX2 og p-ERK (fig. 8A og 8B). Angivelse af ERK, WOX1, MEK1, og p53 blev ikke signifikant påvirket af de ovennævnte dyrkningsbetingelser (fig 8A og 8B,. Data ikke vist for MEK1).

(A, B) DU145 celler blev dyrket natten over under serum-fri (SF) betingelser, eller i 1% normalt humant serum (NHS) eller NHS udtømt med C1q (ΔC1q), C6 (ΔC6), C7 (ΔC7), C8 (ΔC8), eller C9 (ΔC9). Væsentlig reduktion af isoform WOX2 ekspression blev observeret i DU145 celler, når de dyrkes i ΔC1q eller ΔC6 serum (versus SF kontroller;

s

0,001; Studerendes

t

test), mens ΔC7, ΔC8, eller ΔC9 serum var mindre effektivt. Aktivering eller phosphorylering af ERK (p-ERK) var afhængig af tilstedeværelsen af ​​C1q eller C6 i serum (versus SF kontroller;

s Restaurant 0,001; Students

t

test). Et repræsentativt sæt data fra 3 eksperimenter er vist. Søjlediagrammerne viser gennemsnittet af 3 eksperimenter. (C) De ovennævnte celler blev også dyrket på dækglas under identiske serum betingelser. Ved immunfluorescensmikroskopi, serum uden C1q eller C6 ikke kunne støtte konstitutiv ekspression af WOX2 (

s

0,0001, som versus SF eller NHS; Studerendes

t

test). Ca. 200 celler blev kvantificeret individuelt under fluorescensmikroskopi og omfanget af fluorescens blev subtraheret (eller normaliseret) fra negative kontroller (celler farvet med sekundært antistof kun). Kerner blev farvet med DAPI. (D, E) De samme celler, som angivet i (A), blev farvet med p-WOX1 antistof og omfanget af proteinekspression blev kvantificeret. (F) Igen blev identiske eksperimenter udført for Western blotting. Under C1q-fri betingelser (ΔC1q serum), blev den basale aktivering af WOX1 signifikant reduceret (~ 50% reduktion;

s

0,001 fra versus SF og NHS, Students

t

test; n = 3).

for at bekræfte de førnævnte observationer blev immunfluorescensmikroskopi udført. Celler fra ovennævnte forsøg blev dyrket på dækglas under identiske serum betingelser, derefter fikseret og farvet med specifikke fluorescens antistoffer. Igen, vi fastslået, at i mangel af serum C1q og C6, blev WOX2 udtryk signifikant nedreguleret i DU145 celler (fig. 8C). Derudover, når DU145 celler blev dyrket i serum uden C1q eller C6, niveauerne af p-WOX1 var betydeligt reducerede i DU145-celler, sammenlignet med andre dyrkningsbetingelser, som bestemt ved immunfluorescens mikroskopi (fig. 8D og 8E). Disse observationer blev yderligere bekræftet ved Western blotting, som afslørede nedregulering af p-WOX1 under C1q-fri betingelser (fig. 8F). Under disse betingelser, p-WOX1 var til stede hovedsagelig i cytoplasmaet i DU145-celler. Nr apoptose blev observeret i disse celler under 24 timer i kultur, som bestemt ved morfologi af kerner farvet med DAPI.

Complement C9 depletion fremmer p53 kerneakkumulation, og hyaluronan stimulerer nuklear eksport

WOX1 fysisk interagerer med p53 både in vitro

in vivo

og kan inducere apoptose

synergistisk [21], [26], [27], [30]. Selvom eksogent C1q ikke kunne øge p53-medieret apoptose (fig. 5), undersøgte vi virkningen af ​​serum komplement C1q og C6 i styrkelsen de basale niveauer af p53 kerneakkumulation eller aktivering. Når DU145 celler blev dyrket i 1% normalt serum eller i serum uden C1q eller C6 blev akkumulering af p53 i kerner reduceret, sammenlignet med serumfrie betingelser (fig. 9A og 9C). Bemærkelsesværdigt, uden serum C9, blev p53 akkumuleret i kernerne (fig. 9B og 9C), hvilket antyder, at serum komplement C9 er i stand til at begrænse p53 aktivering. Under C9-deficiente tilstande, exogent højmolekylær HA inducerede nuklear eksport af p53 til cytoplasmaet (fig. 9B og 9C). I modsætning hertil HA restaureret p53 cellekerneakkumulering under C6-fri betingelser (fig. 9A og 9C). Salg

DU145-celler blev dyrket natten over i hvert angivet serum med udtynding af en specifik komplement-protein. p53 lokalisering i cellerne blev bestemt ved immunofluorescens-mikroskopi. (A) I mangel af komplement C6 (ΔC6 serum), p53 var hovedsageligt til stede i cytoplasmaet. Høj molekylstørrelse HA (50 ug /ml) inducerede nuklear akkumulering af p53 under behandling i 1 time. (B) I mangel af serum C9 (ΔC9 serum), p53 var for det meste lokaliseret i kerner, og HA (50 ug /ml) inducerede nuklear eksport i 1 time. (C) For at bestemme nuklear lokalisering af p53, blev ca. 200 celler talt. Vist i søjlediagrammet er et gennemsnit af resultater danner to eksperimenter. (D) I negative kontroller blev celler farvet med kun Texas Red-konjugeret sekundært antistof. SF, serumfrit; NHS, normalt humant serum.

Serum komplement C1q og C6 depletion inducerer konstitutiv aktivering JNK1

Vi har vist, at JNK1 fysisk interagerer med WOX1, og at bindingen forøges ved stimulering af celler med UV-lys eller anisomycin (aktivator af JNK1)

in vitro

[27]. Interessant dopaminerge neurotoksin 1-methyl-4-phenyl-pyridinium (MPP

+) reducerer bindingen af ​​WOX1 med JNK1 i rottehjerner [31]. JNK1 blokerer apoptotiske funktion WOX1

in vitro

[27], mens den funktionelle antagonisme

in vivo

er ukendt. JNK1 og isoformer er involveret i stress og apoptotiske responser, celleproliferation, og mange typer af sygdomme [39]. Skønt de ovennævnte resultater viste, at komplement C1q og C6 støttede aktiveringen af ​​WOX1 (fig. 8), er disse proteiner forudsiges at blokere JNK1 aktivering, og udtømningen af ​​C1q og C6 fra sera vil forårsage JNK1 aktivering. Under lignende forsøgsbetingelser, når DU145-celler blev dyrket i ΔC1q eller ΔC6 serum, konstitutiv JNK1 aktivering forekom, som bestemt ved både Western blotting (fig. 10A) og immunofluorescensmikroskopi (fig. 10B).

(A) DU145 celler blev dyrket under serum-fri (SF) betingelser, eller i 1% NHS, ΔC1q eller ΔC6 serum for 16-24 timer. I mangel af C1q og C6, spontan JNK1 aktivering indtraf (versus SF kontroller;

s

0,001; Studerendes

t

test), som bestemt af Western blotting. Et repræsentativt datasæt er vist fra 3 eksperimenter. (B) Lignende resultater blev observeret ved immunfluorescensmikroskopi, som viser signifikant JNK1 aktivering eller nukleare akkumulering under serum C1q- og C6-frie forhold (versus SF;

s

0,001; Studerendes

t

test, n = 3). ΔC9 serum havde ingen effekt. Ca. 200 celler blev talt fra hvert eksperiment. (C, D) Der var ingen STAT3 aktivering i DU145 celler under alle de angivne serum betingelser. Under C1q-frie betingelser, HA (50 ug /ml) effektivt induceret STAT3 phosphorylering i celler under behandling i 1 time. Ca. 200 celler blev talt fra hvert forsøg (n = 3).

I mangel af C1q, HA inducerer STAT3 fosforylering i DU145 celler

STAT3-aktivering spiller en afgørende rolle i prostata cancercelleinvasion [23] – [25]. HA deltager også i cancer invasion, hvilket tyder på, at HA aktiverer STAT3 for at fremme kræft metastaser. Tilsvarende blev DU145-celler dyrket natten over under forskellige serumfrie eller Forelæggelse betingelser. Disse celler blev derefter eksponeret for HA i 1 time. Ingen aktivering af STAT3 blev observeret ved anvendelse af normale eller komplement-depleteret sera (Fig. 10C og 10D). Især i fravær af C1q, HA induceret STAT3-aktivering i DU145-celler (fig. 10C og 10D), hvilket indebærer, at HA kan forøge metastase af C1q-deficiente prostatacancerceller ved opregulering STAT3 phosphorylering og undertrykke aktivering af p53 og WOX1. Alle de ovennævnte eksperimenter blev udført under anvendelse af medicinsk kvalitet HA fra LifeCore. Lignende resultater blev observeret ved anvendelse af medicinsk kvalitet Healon (data ikke vist). Disse HA præparater er fri for forurening protein.

Diskussion

humant serum komplement kaskade er traditionelt betragtes som en stærk humorale immunsystem, der beskytter mod invaderende mikroorganismer. Ikke desto mindre er de funktionelle egenskaber af enkelte komplement komponent er stort set ukendte. I denne undersøgelse har vi vist for første gang, at C1q udtrykkes i prostata. Bemærkelsesværdigt er C1q ekspression signifikant reduceret i godartet prostatahyperplasi og prostatacancer.