PLoS ONE: associering mellem tumorigent potentiale og Fate af cancerceller i en Syngene melanom Model

Abstrakt

selvfornyelse potentiale en kræftcelle kan estimeres ved hjælp af særlige analyser, som omfatter xenotransplantation i immunsvækkede dyr eller dyrkning i ikke-adhærente serumfrie stamceller-celler medier (SCM). Men om celler med selvfornyelse potentiale faktisk bidrager til sygdommen er ukendt. Her undersøgte vi den tumorigene potentiale og skæbne af cancerceller i en in vivo melanom-model. Vi undersøgte cellelinier, der blev afledt fra den samme parentale linje: en ikke-metastatisk cellelinie (K1735 /16), en metastatisk cellelinie (K1735 /M4) og en cellelinie, som blev udvalgt i ikke-adhærente betingelser (K1735 /16S ). Alle cellelinjer udviste lignende spredning kinetik, når de dyrkes på dyrkningsplader. K1735 /16 celler dyrket i blød agar eller i suspensionskulturer ikke-adhærente betingelser undladt at danne kolonier eller sfæroider, mens de øvrige cellelinjer udviste fremtrædende colonogenicity og klumpformet dannelse kapacitet. Ved at bruge sfære begrænsende fortynding analyse (SLDA) i serumfrie medier, K1735 /16S og K1735 /M4 celler dyrket i suspension var stand til at danne sfæroider selv i lave frekvenser af koncentrationer, i modsætning til K1735 /16 celler. Den tumorigent potentiale af cellelinierne blev bestemt i SCID-mus under anvendelse af intra injektioner trædepude. Tydelige tumorer var tydelige i alle mus. Efter aftale med

in vitro

undersøgelser, den K1735 /M4 cellelinje udviste de højeste vækst kinetik, efterfulgt af K1735 /16S cellelinje, mens K1735 /16-cellelinje havde den laveste potentiale tumorvækst (

P

0,001). I modsætning hertil, når vi gentog forsøgene i syngene C3H /HeN mus, den K1735 /16-cellelinje producerede makroskopiske tumorer 30-100 dage efter injektion, hvorimod K1735 /M4 og K1735 /16S afledte tumorer regression spontant i 90-100% af mus . TUNEL-analyse afslørede signifikant højere antal apoptotiske celler i K1735 /16S og K1735 /M4 cellelinie-afledte tumorer sammenlignet med K1735 /16 tumorer (P 0,001). Modellerne vi har undersøgt her rejste muligheden, at celler med høj tumorigen aktivitet kan være mere immunogene og derfor er mere modtagelige for immun-regulering

Henvisning:. Krelin Y, Berkovich L, Amit M, Gil Z (2013) associering mellem tumorigent potentiale og Fate af cancerceller i en Syngene melanom Model. PLoS ONE 8 (4): e62124. doi: 10,1371 /journal.pone.0062124

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: 16. april, 2012; Accepteret: 19 marts 2013; Udgivet 23. april, 2013 |

Copyright: © 2013 Krelin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Israel Science Foundation (nummer 1680-1608 og 482/11), at Israel Cancer Association (tilskud doneret af Ellen og Emanuel Kronitz til minde om Dr. Leon Kronitz nummer 20.090.068), det israelske Sundhedsministeriet (antal 3-7355 ), Weizmann Institute – Sourasky Medical center Joint Grant, Tel Aviv Sourasky Intramural Grant, den ICRF Barbara S. Goodman begavet forskning karriereudvikling award (2011-601-BGPC) og en bevilling fra US-Israel Binational Science Foundation (antal 2007312) til ZG De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en kompleks sygdom, der involverer forskelle mellem tumorer eller celler inden for en given tumor, samt variation mellem patienter. Inden for det spektrum af celler i en given tumor kan subpopulationer af celler er fænotypisk forskellige og udviser distinkt proliferativ potentiale. For eksempel cancer stamceller (CSC) model antyder, at kun en lille subpopulation af celler har en selvfornyelse og tumordannelse potentiale, mens størstedelen af ​​tumoren består af ikke-tumorigene celler [1]. Beviser til støtte for CSC model er fundet i kimcelle kræft, leukæmi, brystcancer, coloncancer og i nogle hjerne kræftsygdomme. [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. På den anden side, hvad enten melanomer er i overensstemmelse med en sådan model er et spørgsmål om løbende debat [12], [13].

I øjeblikket er den eneste assay, der bestemmer den tumorigene potentiale af humane tumorer involverer xenotransplantation af forskellige subpopulationer af kræftceller i flankerne af meget immunosuppressive dyr (f.eks NOD /SCID mus). Desuden stemness (dvs. evnen til at forny sig selv og differentiere) ofte evalueres

in vitro

af surrogat analyser, der undersøger kugle-dannende evne og clonogenicity i Anchorage uafhængige forhold, såsom halvfast blød agar [ ,,,0],14]. Tidligere forsøg har vist, at flercellede tumor spheroids er morfologisk og karakteristisk ligner solide tumorer

in vivo

[15], [16]. Det er også blevet påvist, at kuglen-dannende potentiale i suspensionskulturer ikke-adhærente betingelser konsekvent korrelerer med den neoplastiske vækstpotentiale i immunsupprimerede mus [17], [18], [19], [20].

Både

in vitro

in vivo

stemness analyser løse tumorigent potentiale af særskilte underpopulation af celler, mens den faktiske dannelse af tumorer hos patienter, kan afhænge af andre faktorer. Tumormikromiljøet, der kan være stedsspecifik og værtens immunsystem, der er nedsat hos NOD /SCID-mus kan potentielt ændre skæbnen for cancerceller og deres bidrag til sygdommen. Derfor er spørgsmålet om, hvorvidt celler med en høj tumorigent potentiale faktisk bidrage til tumorvækst i patienter med et intakt immunsystem forbliver uløst

I dette papir, vi søgte at sammenligne to fænomener i relation til udvikling af kræft:. Tumorigent potentiale og skæbnen for cancerceller. For at overvinde to af de vigtigste begrænsninger, der er uløseligt forbundet med subkutan xenografting af humane cancerceller i immunkompromitterede mus, dvs. artsbarrieren og indstillingen transplantation, vi brugte en syngen melanom model og ortotopisk intra injektioner trædepude i immun-kompetente dyr.

Materialer og metoder

cellelinier

Mus melanom cellelinjer (K1735 /16 og K1735 /M4) var en gave fra laboratoriet af Dr. Lea Eisenbach (Weizmann Institute, Rehovot ). Den K1735 /16S cellelinie blev afledt af K1735 /16 cellelinie ved dyrkning af celler i ikke-adhærente betingelser (se nedenfor) i 16 dage. Celler blev dyrket i DMEM suppleret med MSCM, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C, 5% CO2, i en fugtig inkubator. Alle mellemstore ingredienser blev indkøbt fra Biological Industries, Israel. For selvfornyelse og klumpformet vækstassays anvendte vi melanom serumfrit stamcelle medier (MSCM), der bestod af Dulbeccos modificerede Eagles medium /F12, KnockOut ™ SR, 100 mM L-glutamin (Invitrogen), MEM ikke-essentielle aminosyrer Løsning 10 mM, 2 ug /ml FGF (Sigma), og antibiotika. For sfære vækstassays anvendte vi MSCM konditioneret med muse embryonale fibroblaster (MEF) CF-1 i 24 timer. [21] blev også brugt reagenser, såsom: natriumazid, paraformaldehyd, xylen og natriumcitrat blev købt fra Sigma Aldrich, Israel

Mus og

in vivo

Foot Pad Model

.

Kvindelige C3H /HeN mus og svær kombineret immundefekt (SCID) mus blev indkøbt fra Harlan (Jerusalem, Israel). Alle mus blev holdt på Animal faciliteter i Tel Aviv Medical Center (Tel-Aviv, Israel), under aseptiske forhold.

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med alle gældende politikker, procedurer og lovkrav i Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), Research Animal Resource center (RARC) i Tel Aviv University og National Institutes of Health (NIH) “Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr”. Alle dyreforsøg blev udført ved inhalation af 2% isofluran. Efter studierne blev alle dyr aflivet ved CO

2 inhalation.

A trædepuden syngen melanom-model blev etableret, som tidligere beskrevet af Harrell et al. [22]. Kort fortalt blev tredive, 6 uger gamle mus bedøvet med inhalations isofluran for alle procedurer. Den venstre bagben trædepuden blev steriliseret med alkohol og derefter langsomt injiceret med 50 pi cellesuspension ved en koncentration på 2 × 10

5 celler /50 pi over en 2-minutters periode. Musene blev derefter vækket og deres trædepuden overvåget for tumorstørrelse og tegn på smerte eller ulceration to gange om ugen.

Eksperimenter med syngene C3H /HeN mus blev gentaget 3 gange, og i hvert eksperiment injicerede vi 10- 15 mus per gruppe. I forsøgene med SCID-mus anvendtes 6-7 mus pr gruppe. I cellen sortering eksperiment blev hver gruppe (5-6 mus pr gruppe) injiceret med sorterede CD133 (+), kontrol K1735 /M4 eller kontrol K1735 /16 celler til syngene C3H /HeN mus.

Immunhistokemi

prøver fra injektionsstedet af melanomcellelinjer blev opnået på dag 16 og 40, fikseret i 4% paraformaldehyd, dehydreret i alkohol, klaret i xylen og indlejret i paraffin. Fire-mikron snit blev farvet med hematoxylin og eosin (H klon ab66155 Abcam Cambridge, UK), muse-anti-muse /humant Melana (1:20; klon ab731 Abcam Cambridge, UK). Den Vectastain Elite ABC Peroxidase kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) blev anvendt til sekundært antistof detektion. Visualisering blev udført ved hjælp af DAB som substrat (klon ab64238, Abcam Cambridge, UK). En patolog undersøgt dias i en blind måde

Immunoblotting

For udtryk for ABCB5 (1:1000, klon PAB9925, Abnova Taipei City, Taiwan)., Nestin (1:200; klon mab353 , Chemicon, Billerica, USA) og CD271 /NGFR (1:200; klon sc-8317, Santa Cruz, USA), blev celler dyrket i plader med 6 brønde. Derefter blev cellerne frigivet uden enzymatisk fordøjelse ved 4 ° C. Cellepellets blev sonikeret i 10 sekunder og klaret ved centrifugering. Totalt protein (50 ug) undergik elektroforese i 7,5% Tris-HCI-geler (Bio-Rad, Hercules, CA) og blev overført til polyvinylidendifluorid-membraner, blokerede og udsat for primært antistof, efterfulgt af et sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase. Bånd blev udviklet under anvendelse af en ECL Plus påvisningssystem (Amersham, Piscataway, NJ). Density blev kvantificeret ved hjælp af en computerstyret CCD-kamera (AlphaImager Imaging Systems, Alpha Innotech, San Legndra, CA).

flowcytometri og Celle Sortering

For at detektere overflademarkører på tumorceller, melanom cellelinjer blev trypsiniseret eller ikke-enzymatisk fritliggende med EDTA og centrifugeret ved 1500 rpm /min i 5 min. [23] Kort beskrevet Celler blev vasket med Ca

2 + -fri Mg

2 + -fri phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning, og 4 ml 1 mM EDTA (Sigma-Aldrich) blev tilsat til hver kolbe . Kolberne blev inkuberet ved 37 ° C i 5 minutter og rystet langsomt, indtil cellerne blev løsnet. Ti milliliter PBS-buffer blev derefter tilsat til hver kolbe og cellerne opsamles til rør, centrifugeret og vasket med Ca

2 + /Mg

2 + -fri PBS. Antallet af løsnede celler blev talt med et hæmacytometer (Marienfeld, Tyskland). Celler blev derefter høstet, vasket med iskold 0,5% FBS og 0,02% natriumazid i PBS og blokeret med en opløsning af 0,5% FBS og 5 ug /ml oprenset anti-CD16 /CD32 (BioLegend, San Diego, USA) i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur. Efterfølgende blev celler farvet for APC-konjugeret anti-muse-CD133 mAb (klon 13A4, eBioscience, San Diego, USA), APC-mærket anti-muse CD117 (klon 2B8, eBioscience, San Diego, USA), FITC-mærket anti- muse Sca-1α (klon D7, eBioscience, San Diego, USA), CD271 (klon ab8874, Abcam Cambridge, UK) og ged polyklonale sekundære antistof til kanin-IgG (klon ab6108, Abcam Cambridge, UK) i 30 minutter på is. Prøver blev derefter vasket og analyseret med BD FACSCanto ™ II (BD Bioscience, USA).

For sortering vi brugte MACS® Separation-system (# 130-090-312, Miltenyl Biotec Inc., USA) i henhold til producenten protokol. Kort fortalt: K1735 /M4-celler blev farvet med APC-konjugeret anti-muse-CD133 mAb og celleseparation fortsatte med anti-APC mikroperler (# 130-090-855, Miltenyl Biotec Inc., USA). Cellen del blev gjort to gange med samme celler for at berige CD133 positive cellepopulation. Efter celleseparation CD133 positive cellepopulation blev vasket med PBS og forberedt til injektion (7,5 × 10

4 celler /200 uL /​​mus) eller til kontrol ved FACS.

Cell Proliferation Assay

celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1000 celler per brønd med DMEM-MSCM. Efter 24, 48 og 72 timer blev cellevæksten bestemt ved anvendelse af den kolorimetriske XTT celleproliferationsassay (Beit Haemek, Israel). Prøver blev analyseret med Spectra MR Dynex (Chantilly, USA).

blød agar-assay

Alikvoter af 10

4 melanomceller blev resuspenderet i 1 ml, 0,35% agar i MSCM. Alikvoter blev hældt i seks-brønds plader oven på en 1,5-ml lag af 0,5% agar i MSCM, fik lov at størkne og inkuberes i 21 dage ved 37 ° C i nærvær af 5% CO2. Skålene blev fotograferet med et stereoskopisk billeddannende system (stereo Lumar.V12. Zeiss, Tyskland) og de numeriske kolonier pr 1 /cm

2 blev anslået efter erhvervelsen hjælp ImagJ (NIH, Bethesda, MD) billede analyse software.

Vurdering af Tumor Sfæroide Dannelse og selvfornyelse Analyse

En 2 ml nedre agarlag blev fremstillet ved at resuspendere 0,5% agar med MSCM, som derefter lodes størkne i plader med 6 brønde. Alikvoter af 3 × 10

4 melanomceller i MSCM blev udpladet i suspension betingelser på blød agar lag og inkuberet i 2-16 dage ved 37 ° C, i nærvær af 5% CO

2 inden analyse.

Sphere begrænsende fortynding Analysis (SLDA) blev udført som tidligere beskrevet. [24] Kort beskrevet sfærer blev høstet efter 14 dage holdes i suspension betingelser i 6-brøndsplader, adskilt med trypsin og udpladet igen i ikke-adhærente betingelser i MSCM hjælp fortyndingsforhold alikvoter af: 1000, 300, 100, 50, 10 celler /96 -wells plade. Fjorten dage senere blev antallet af brønde uden kugle dannelse kvantificeres og dataene blev log transformeret og plottet mod plating tæthed. En lineær regression blev anvendt til at beregne frekvensen af ​​celler, som kan prolifererende at danne et melanom sfære.

Kvantitativ Reverse Transcription-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra muse melanomcellelinier under anvendelse af et RNeasy Mini (Qiagen, Holland) ifølge producentens instruktioner. Oprenset RNA blev kvantificeret under anvendelse af en NanoDrop® ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies Inc., USA). cDNA blev syntetiseret fra 200 ng af total RNA, ved anvendelse af VersoTM cDNA Kit (Thermo Scientific, Epsom, UK) og vilkårlige hexamerer. cDNA PCR-amplifikation blev udført ved hjælp af Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG med ROX (Invitrogen Corporation, Grand Island, NY USA) på en Step One Plus Real Time PCR-system (Applied Biosystems) med gen-specifikke oligonukleotidpar (Sigma Aldrich, Israel). Hvert gen blev kontrolleret ved tre forskellige primerpar, der er opført i tabel S1. At sikre specificiteten af ​​reaktionsbetingelserne, ved afslutningen af ​​de enkelte kørsler blev smeltetemperaturen (Tm) af de amplificerede produkter målt for at bekræfte dets homogenitet. Cykling var som følger: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder for i alt 40 cykler. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer. Til kvantificering, blev standardkurver opnået ved anvendelse seriefortyndet cDNA amplificeret i den samme real-time PCR-kørsel. Resultater blev normaliseret til ACTB og 18S mRNA-niveauer. Det 2-ΔΔCT metode blev anvendt til at analysere de relative ændringer i genekspression. Efter kvantificering procedure blev produkterne opløst ved 2,5% agarosegelelektroforese for at bekræfte, at reaktionen var amplificerede DNA-fragmenter med den forventede størrelse.

Statistical Analysis

Student

t

tester eller analyser mellem grupperne (ANOVA) blev anvendt til statistisk analyse er relevant. Forskelle blev betragtet som signifikante ved

P

0,05. Alle data er repræsenteret som middelværdi ± SD, medmindre andet er angivet. Alle forsøg blev gentaget tre gange. Data fra repræsentative eksperimenter er vist.

In vivo

eksperimenter bestod af 10-15 mus i hver forsøgsgruppe.

Resultater

For at vurdere sammenhængen mellem kræft celle selvfornyelse potentiale og celle skæbne, vi valgte murine melanomceller, som blev afledt fra den samme parentale cellelinje, men som har forskellige fænotyper

in vivo

in vitro

. Den K1735 murine melanom-cellelinie er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere melanom [25]. Denne cellelinie, som har en lav tilbøjelighed til at danne metastaser, blev induceret i C3H /HeN mus ved kronisk udsættelse for ultraviolet B-stråling. For vores undersøgelse, vi vælger tre cellelinjer, som blev afledt af denne parental cellelinie, men som afveg betydeligt i deres tumorigent potentiale, sfære-dannende evne og clonogenicity [26], [27], [28]. Den K1735 /16 er en ikke-metastatisk cellelinie og K1735 /M4 cellelinjen blev afledt fra en lunge metastase og har en høj metastatisk potentiale. En tredje cellelinje, K1735 /16S, blev afledt af K1735 /16 cellelinie ved opretholdelse af celler i suspension ikke-adhærente betingelser i 16 dage. Alle tre cellelinier udviste lignende spredning kinetik ved dyrkning i dyrkningsplader (fig. 1a).

Bestemtes

(A) proliferationshastighed i kultur-behandlede plader efter 96 timer ved hjælp af XTT-assay. Dataene er den gennemsnitlige ± SD af mindst tre uafhængige forsøg udført in triplo. (B) Mean antal kolonier dyrket på blød agar efter 21 dage i kultur. Dataene er den gennemsnitlige ± SD af fem høj effekt felter (P 0,001). (C) Repræsentative mikroskopiske billeder af tumor sfæroider 21 dage efter udpladning. (D) Repræsentative mikroskopiske billeder af tumor sfæroider, 6 dage efter udpladning på ikke-adhærente betingelser.

blød agar Colony og sfærisk Formation Potentielle

Tumorceller dyrkes i tre-dimensionelle flercellede sphæroider anses af mange for en pålidelig

in vitro

model, der kopierer nogle af de komplekse funktioner i solide tumorer [29]. Vi først søgte at karakterisere clonogenicity og kugle-dannende evne tre cellelinjer K1735 /16, K1735 /16S og K1735 /M4 i blød agar. Den K1735 /16-cellelinien dyrket i blød agar undladt at danne kolonier efter 21 dage i kultur (fig. 1B og C). På den anden side, både den metastatiske K1735 /M4 cellelinie og K1735 /16S cellelinie havde fremtrædende en kolonidannelse kapacitet (fig. 1B og 1C). Vi næste undersøgt, om det samme fænotypiske heterogenitet opretholdes i suspension ikke-klæbende betingelser, som er set af mange for at være den nærmeste tilnærmelse af

in vivo

tumorigenicitet blandt de in vitro-analyser [30], [31 ], [32], [33], [34]. Kuglen dannelse kapacitet blev vurderet 6 dage efter plating med MSCM. A vist i figur 1D, den K1735 /M4 og K1735 /16S cellelinjer viste en fremtrædende kugle-dannende evne, mens K1735 /16-cellelinjen ikke voksede i disse stresstilstande. Men når K1735 /16 celler blev holdt på disse betingelser i 16-20 dage, kunne påvises i nogle af pladerne, et par sfæroider.

Stemness Potential

For at vurdere selvfornyelse potentiale af de tre cellelinier, udførte vi en serie af fortyndende assays ved anvendelse af SLDA i serumfrie medier, rettet til at undersøge evnen hos en begrænsende fortynding analyse af melanomceller til dannelse sfæroider i ikke-adhærente betingelser og etableret en frekvens analyse af melanom sfære formation. [24], [35], [36] Alle tre cellelinjer havde en lignende spredning potentiale, når udpladet på 96 brønde dyrkningsplader i normale betingelser (fig. 2A). I modsætning hertil selvfornyelse potentiale i serumfrie medier af den ikke-metastatisk cellelinie, K1735 /16, afveg væsentligt fra de andre to cellelinjer. SLDA udført efter den anden tilsået afslørede, at hyppigheden af ​​celler i stand til selv forlængelse var 1/216 for K1735 /M4 cellelinie 1/296 for K1735 /16S cellelinie og 1/36733 for K1735-16 cellelinjen med MSCM (fig. 2). Desuden K1735-16 celler var ikke i stand til at danne sfærer i adeherent forhold, mens K1735 /M4 celler spontant dannede sphares i serum-frie medier.

SLDA udført efter den anden tilsået med MSCM afslørede, at hyppigheden af celler i stand til selv at forny var A. 1/216 for K1735 /M4 cellelinie, B. 1/296 for K1735 /16S cellelinie og C. 1/74720 for K1735-16 cellelinje. Skæringen af ​​log (37% negative brønde) blev anvendt til at beregne kugle-dannende frekvens (se materialer og metoder).

Taget sammen antyder disse data, en fænotypisk heterogenitet af enkelte murine melanomceller, som blev afledt fra den samme parentale cellelinje. Den selv-fornyelse potentiale i suspensionen ikke-klæbende assay kan sammenlignes med kugle-dannende evne og clonogenicity i blød agar assay.

tumorigent potentiale i SCID mus

Næste vi søgte at evaluere den tumorigent potentiale af de tre cellelinier i immunkompromitterede mus ved hjælp ortotopisk intra injektioner trædepude. Dette blev vurderet ved at injicere 2 × 10

5 frisk dissocierede K1735 /16, K1735 /M4 og K1735 /16S cancerceller i trædepuden af ​​SCID-mus. Tydelige tumorer var tydelige i alle mus indenfor 20 dage. Som vist i figur 3A, det metastatiske cellelinie, K1735 /M4, udstillet den højeste vækst kinetik, efterfulgt af K1735 /16S cellelinje, hvorimod den ikke-metastaserende /ikke-colonogenic 1735-1716 cellelinje havde den laveste tumor voksende potentiale (n = 6-7 mus pr gruppe,

P

0,001). Disse data tyder på, at selvfornyelse potentiale

in vitro

kan forudsige

in vivo

tumorigent potentiale i SCID-mus.

(A) Melanom cellelinjer (2 × 10

5) injiceret til trædepuden af ​​SCID-mus. Den K1735 /M4-cellelinien viste de højeste tumor vækstkinetik, efterfulgt af K1735 /16S cellelinie. Den K1735 /16-cellelinje havde den langsomste tumorvækst (n = 5-6 pr gruppe, P 0,001). (B) Det samme koncentration af celler injiceret i trædepuden af ​​syngene C3H /HeN mus. Denne gang K1735 /M4 og K1735 /16S viste minimal tumorigent potentiale, mens K1735 /16S cellelinje havde den højeste tumorvækst kinetc (eksperimenter udført 3 gange i træk med n = 10-15 dyr pr gruppe; P 0,001 mellem K1735 /16 og K1735 /M4 eller K1735 /16S cellelinjer). (C) Repræsentative histologiske træk ved tumorer dyrket i immun-kompetente dyr, 16 dage efter implantation. (D) Immunohistokemisk analyse med anti-Ki-67 Ab (a proliferationsmarkør), der viser lignende ekspression i de tre cellelinjer. (E) immunhistokemisk farvning med anti-Melan A Ab (en melanom markør) viste positivt udtryk i alle tumorer, men ikke i tilstødende normale væv.

tumorigent potentiale i Immun-kompetent mus

Næste, vi ønskede at vurdere, om tumorigent potentiale af de tre cellelinjer, som afsløret af de to

in vivo

in vitro

ovenfor beskrevne analyser, kan forudsige den faktiske skæbne af cancerceller i immun-kompetente dyr. Dette spørgsmål kan kun løses i syngene musemodeller, der kan afspejle den anti-tumor immunreaktion og mikromiljø respons. Derfor gentog vi intra injektioner trædepuden tidligere udført i SCID-mus, men denne gang ved hjælp syngene C3H /HeN mus.

Til vores overraskelse, skæbnen for kræftceller i det syngene model var modsat end tidligere beskrevet i SCID-mus. Som vist i figur 3B, K1735 /16 celler injiceret i intra trædepude af C3H /HeN mus viste de højeste kræft vækst kinetik, mens kun et lille antal dyr, udviklede tumorer efter injektion af K1735 /M4 eller K1735 /16S cellelinje (eksperimenter udføres 3 gange med n = 10-15 mus pr gruppe,

P

0,001). Histologisk analyse af tumorer med H 0,001). TUNEL analyse viste, at antallet af apoptotiske celler i K1735 /16-cellelinje-afledte tumorer var signifikant lavere end i K1735 /16S og K1735 /M4 cellelinjer-afledte tumorer.

Expression Profil af Stem Cell markører

tegn på, at tumorigene celler kan skelnes fra ikke-tumorigene celler baseret på ekspression af specifikke markører. Derfor undersøgte vi evnen af ​​rapporterede stamcellemarkører at forudsige den kliniske fænotype af de tre melanomcellelinjer. Det blev tidligere vist, at c-Kit, kan CD133 og CD271 ekspressionsassays skelne tumorigene fra ikke-tumorigene melanomceller [13], [37], [38], [39]. Vi undersøgte også ekspressionen af ​​Sca-1α, som blev vist at være associeret med tumorigent potentiale i bryst, prostata og lungekræft [13], [37], [38], [39]. Vi undersøgte derfor ekspressionen af ​​disse markører ved flowcytometri i alle tre cellelinier. Celler blev frigjort under anvendelse af trypsin-spaltning eller i enzymatiske-fri betingelser under anvendelse af EDTA. Figur 6-trypsin behandlede celler og Figur S1-EDTA behandlede celler viser, at c-Kit, blev CD133 og CD271 positive celler kun detekteret i mindretal af celler. I modsætning hertil blev Sca-1α ekspression fundet i 50% af de K1735 /16 celler, men ikke i de andre cellelinjer. Disse resultater blev bekræftet ved kvantitativ RT-PCR-analyser.

Ekspression af stamcellemarkører blev bestemt under anvendelse anti Sca-1α, c-Kit, CD133 og CD271 Abs. I modsætning til de øvrige markører, blev SCA-1α udtrykt i 50% af cellerne i K1735 /16 cellelinie, men ikke i de andre cellelinjer. Resultater er fra en af ​​tre repræsentative eksperimenter. Procentdelen af ​​positive celler og markører er vist i øverste højre hjørne. B16 musemelanomceller, knoglemarv (BM) eller hjerneceller (BC) blev anvendt som positive kontroller.

Vi yderligere søgt at identificere andre CSC markører udtrykt af melanom celler, som kan forudsige deres tumorigen fænotype. Således har vi screenet en anden 16 markører tidligere vist at blive udtrykt i CSCS [12], [13], [21], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. Brug kvantitativ RT-PCR-analyse, vi var ude af stand til at opdage højere udtryk for ABCG2, ABCB5, CD20, CD24, CD34, CD44, CD166, Oct4, Cripto-1, CD-90, Gli1 eller Sox2 i nogen af ​​K1735 /M4, K1735 /16S og K1735 /16 cellelinjer (fig. 7). Vi bekræftede disse resultater i nogle af markørerne ved Western blot (fig. 8). Interessant tre markører NANOG, ALDH3A1 og nestin, blev udtrykt i K1735 /16 cellelinie, men ikke i dets datter cellelinie K1735 /16S eller i den metastatiske K1735 /M4 cellelinie. I alt screenede vi 19 forskellige markører, der tidligere blev foreslået at være forbundet med den tumorigene potentiale af kræftceller, og i dem alle, de stærkt tumorigene cellelinjer K1735 /M4 og K1735 /16S havde lignende eller lavere ekspression sammenlignet med den lav-tumorigen cellelinie.

Relativ ekspression af 15 markører tidligere foreslået til anvendelse til at forudsige selvfornyelse potentiale af cancerceller. ALDH3A1, Nanog og Nestin udtrykkes hovedsagelig i K1735 /16 cellelinie, men ikke i K1735 /16S og K1735 /M4 cellelinier. Andre stamcellemarkører herunder SOX2 viste ingen differentiel ekspression mellem de tre cellelinjer. Dataene er den gennemsnitlige ± SD fra tre forskellige eksperimenter. Frisk dissocierede knoglemarv og hjerneceller blev anvendt som positive kontroller (højre spalte).

Disse markører er tidligere foreslået til anvendelse til at forudsige melanom selvfornyelse potentiale. HTB-72 humant melanom cellelinie og murine astrocytter (AST) blev anvendt som positive kontroller. Bemærk at den eneste markør, der blev udtrykt af de murine melanomcellelinjer var Nestine, som blev udtrykt i den ikke-metastatisk cellelinie (K1735 /16).

Endelig har vi forsøgt at bekræfte vores resultater ved klonal cellesortering på enkelt celle niveau. Dette assay blev instrueret til at afgøre, om sub populationer af K1735 /M4 kan give anledning til øget clonogenicity og selv-fornyelse.