PLoS ONE: aldehyddehydrogenase 1 Identificerer Celler med kræft Stem Cell-lignende egenskaber i en human renalcellecarcinom Cell Line

Abstrakt

Kræft stamceller (CSC) eller kræft stamceller celle-lignende celler (CSC-LCS ) er blevet identificeret i mange maligne tumorer. foreslås CSCS at være relateret med medikamentresistens, tumor tilbagefald, og metastase og betragtes som et nyt mål for kræftbehandling; men der er kun få rapporter om CSCS eller CSC-LCS i renalcellecarcinom (RCC). Der er rapporteret om forskellige tilgange til CSC identifikation, men der er ingen universelle markører for CSC. Vi brugte to forskellige tilgange, den traditionelle side befolkning (SP) tilgang, og den enzymatiske (aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1)) tilgang til at identificere CSC-LC befolkning i to RCC-cellelinjer, ACHN og KRC /Y. Vi fandt, at ACHN og KRC /Y indeholder 1,4% og 1,7% SP-celler, hhv. ACHN SP-celler viste en højere sfære dannende evne, lægemiddelresistens, og et lidt højere tumorigen evne i NOD /SCID-mus end ikke-SP (NSP) celler, hvilket antyder, at celler med CSC-LC ejendomme indgår i ACHN SP-celler. KRC /Y SP og NSP-celler viste ingen forskelle i disse egenskaber. ALDH1 aktivitet analyse afslørede, at ACHN SP celler udtrykte et højere aktivitetsniveau end NSP-celler (SP vs. NSP: 32,7% vs. 14,6%). Analyse af ALDH1-positive ACHN celler afslørede, at de har en højere sfære dannende evne, selvfornyelse evne, tumorigenicitet og hurtig højere mRNA-niveauer af CSC-LC ejendomsrelaterede gener (f.eks ABC transporter-gener, selv-replikationsgenerne, anti- apoptose gener osv) end ALDH1-negative celler. Drug behandling eller udsættelse for hypoksisk tilstand inducerede en 2- til 3-dobling i antallet af ALDH1-positive celler. Som konklusion antyder resultaterne, at ALDH1-positive cellepopulation snarere end SP celler viser CSC-LC egenskaber i en RCC-cellelinie, ACHN

Henvisning:. Ueda K, Ogasawara S, Akiba J, Nakayama M, Todoroki K, Ueda K, et al. (2013) aldehyddehydrogenase en Identificerer Celler med kræft Stem Cell-lignende egenskaber i en human renalcellecarcinom Cell Line. PLoS ONE 8 (10): e75463. doi: 10,1371 /journal.pone.0075463

Redaktør: Masaharu Seno, Okayama University, Japan

Modtaget: Marts 25, 2013; Accepteret: 14. august 2013; Udgivet: 8 oktober 2013

Copyright: © 2013 Ueda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Renalcellecarcinom (RCC) er en af ​​de. mest almindelige maligne sygdomme i den urogenitale kanal, der tegner sig for 116,500 dødsfald i 2008 i henhold til World Health Organization [1]. Forekomsten af ​​RCC har været støt stigende over de seneste 30 år [2]. På grund metastatisk RCC er notorisk resistent overfor de fleste konventionelle behandlinger, såsom kemoterapi og strålebehandling, prognosen for patienter med RCC er fattige som en tredjedel af patienterne allerede har metastatisk sygdom ved den første diagnose og 30-40% af dem udvikler fjernt metastaser efter resektion af den primære tumor [3]. I de senere år har de molekylære målrettede behandlinger, der er udviklet vist betydelige objektive responser [4] – [6], og de er nu anerkendt som de nuværende standardbehandlinger af metastatisk RCC. Men effektiviteten af ​​disse molekylære target behandlinger er utilstrækkelig.

De to dominerende modeller af carcinogenese er den stokastiske model (klonal evolution) og den hierarkiske organisering af tumor (cancer stamceller (CSC)) model. Ifølge den traditionelle klonale evolution model, tumordannelse er konsekvensen af ​​at akkumulere tilfældige genetiske begivenheder i normale differentierede celler, mens CSC-modellen postulerer, at en enkelt CSC giver anledning til en hierarkisk organisation inden en tumor [7], [8]. Nylige undersøgelser tyder på, at CSCS kan være ansvarlige for tumorigenese og bidrage til nogle individer modstand mod cancerterapi, hvilket resulterede i cancer tilbagefald og metastase [9], [10]. Derfor er det en udbredt opfattelse, at identifikation og karakterisering af CSC eller kræft stamcelle-lignende celle (CSC-LC) kan bidrage væsentligt til udviklingen af ​​effektive behandlingsformer. Bussolati et al. identificeret en population af CD105 positive tumorfremkaldende celler i RCCS, og revideret litteraturen om rollen af ​​stamceller i humant RCC [11], [12]. Kim et al. rapporteret, at ekspressionen af ​​stamcelle markører, OCT4 og CD133, kan tjene som henholdsvis en fattig og gunstig prognostisk markør, i papillær RCC [13]. Desuden foreslog de, at ekspressionen af ​​CD133 er et gunstigt prognostisk markør i klar celle RCC [14]. Salg

Der er mange rapporter om, at CSC-LC’er af nogle faste tumorer forekommer i side befolkning (SP) celler [15], [16], men der er kun få rapporter om rolle SP celler i human RCC [17], [18]. SP-celler blev oprindeligt identificeret i flowcytometrisk analyse ved deres evne til udstrømning den vitale DNA farvestof, Hoechst 33342, hvilket resulterer i Hoechst-negative SP-celler og Hoechst-positive ikke-SP (NSP) celler. Tidligere undersøgelser af cancere in vitro og primære tumorer in vivo har vist, at SP-celler er unikt i stand til at generere både SP og NSP cellepopulationer, der udviser egenskaber i overensstemmelse med stamceller eller CSC. SP-celler udtrykker høje niveauer af ATP-bindende kassette (ABC) transporter familiemedlemmer, især ABCG2 og udviser mere kemoterapeutisk lægemiddelresistens end NSP celler i cellelinier afledt fra nogle humane maligne faste tumorer, såsom brystcancer, lungecancer, ovariecancer og pladecellekræft [19] – [21]

for nylig er det blevet rapporteret, at aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1) er ansvarlig for oxidationen af ​​retinol på retinsyre og spiller afgørende roller i fosterudviklingen, homeostase. i flere organer [22]. Nogle forskere har rapporteret, at høj ekspression af ALDH1 var forbundet med lægemiddelresistens og dårlig prognose, og at ALDH1 er en CSC markør [23], [24]. Ozbek et al. rapporterede, at ALDH1 ekspression blev korreleret med tumorklassificering i RCC [25], men de biologiske funktioner i ALDH1-positive celler i RCC er stadig ukendte.

I denne undersøgelse har vi isoleret SP-celler fra to humane RCC-celle linjer og systematisk undersøgt CSC egenskaber af SP celler og ALDH1-positive celler, og forholdet mellem SP celler og ALDH1-positive celler.

Materialer og metoder

cellelinjer og Dyr

Vi brugte to RCC cellelinier: afledt af malign pleural effusion fra en patient med RCC (ACHN) og den anden er afledt af primære læsion hos en patient med RCC (KRC /Y). Disse 2 RCC cellelinjer har høj proliferativ og kolonidannende evner

in vitro

og besidder høj tumorigenicitet i selv nøgne mus

in vivo

. ACHN blev købt fra American Type Culture Collection. KRC /Y blev etableret i vores laboratorium [26]. Dyrkningsmedium til ACHN bestod af modificerede Eagles medium (EMEM) (Gibco, BRL /Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Dyrkningsmedium til KRC /Y bestod af Dulbeccos modificerede medium (DMEM) (Nissui Seiyaku Co, Tokyo, Japan) suppleret med varmeinaktiveret (56 ° C, 30 min) 5% føtalt bovint serum (FBS, Bioserum, Vic, Australien ), 100 U /ml penicillin og 100 ug streptomycin (Gibco BRL /Life Technologies Inc.). Celler blev dyrket i en atmosfære af 5% CO

2 i luft ved 37 ° C. Kvindelige ikke-overvægtige diabetiske /svær kombineret immundefekt (NOD /SCID) mus (5 uger gamle) blev købt (Clea Japan, Inc., Osaka, Japan), og har til huse i laminar flow kabinetter under specifikke patogenfrie betingelser. Alle procedurer blev godkendt af den etiske Review Committee for Animal Eksperimenteren af ​​Kurume University School of Medicine.

Angivelse af CSC Markers i RCC cellelinier

Vi analyserede udtryk for den formodede CSC markører ABCG2, CD90, CD105, CD133 og epithelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) i ACHN og KRC /Y. Celler blev inkuberet i mørke ved 4 ° C i 30 minutter med fluorescens-konjugeret monoklonale antistoffer, herunder fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret muse-anti-humant CD90-antistof (5E10, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og muse-anti -human CD105 antistof (MEM-226, EXBIO, Praha, Tjekkiet) og phycoerythrin (PE) -konjugeret CD133 /2 antistoffer (293C3, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Tyskland) og anti-EpCAM antistof (EBA-1, BD Biosciences ). Celler med muse-anti-BCRP monoklonalt antistof (ABCG2) (BXP-21, Chemicon, Temecula, CA, USA) blev inkuberet i 30 minutter og yderligere inkuberet i mørke ved 4 ° C i 30 minutter med FITC-konjugeret ged anti-mus Ig (FITC-GAM) (BD Biosciences). Celler blev vasket, resuspenderes og analyseret på en FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

SP Cell Identifikation og CSC Marker Expression i SP og NSP Cells

Dyrkede celler med 80 % konfluens blev løsnet med Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc., San Diego, USA) og suspenderet ved 1 x 10

6 celler /ml i phosphatbufret saltvand (PBS) suppleret med 2% FBS og derefter inkuberet med Hoechest 33342 farvestof alene (5 ug /ml for ACHN og 10 ug /ml for KRC /Y) (SIGMA-Aldrich, St. Louis, MO, USA) eller med 20 ug /ml reserpin (SIGMA-Aldrich) ved 37 ° C i 60 min. Prøver blev vasket, centrifugeret og resuspenderet i 2 ml kold PBS suppleret med 2% FBS, derefter 1 ug /ml propidiumiodid (PI) (BD Biosciences) tilsat og cellerne blev filtreret gennem et 40 um cellefilter (BD Biosciences). Flowcytometrisk analyse blev udført som tidligere beskrevet [27]. Reserpin konventionelt anvendes som et ledende parameter til bestemmelse af grænsen mellem SP og NSP-celler. Analyser blev udført med en FACSAria II (BD Biosciences). Udtrykket af CD90 og EpCAM i ACHN, og af CD105 og EpCAM i KRC /Y, i SP og NSP celler blev undersøgt yderligere. Celler blev farvet ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet ovenfor.

Cell Growth Assay af SP og NSP celler

I alt 2.000 SP-celler og NSP-celler blev udpladet i plader med 96 brønde og dyrket i en CO

2 inkubator. Cellerne blev høstet ved 24, 48, 72, 96, 120 eller 144 timer og proliferation blev undersøgt i kolorimetriske assays under anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl-y -) – 2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT ) cellevækst assaykits (Chemicon, Temecula, CA, USA) som beskrevet andetsteds [28].

kolonidannelse assay af SP og NSP Celler

blød agar forankringsuafhængig klonogene vækst assay var udført. Kort fortalt, 2 × 10

4 celler blev suspenderet i 2 ml EMEM eller DMEM indeholdende 0,36% blød agar (Gibco BRL /Life Technologies Inc.) og 10% FBS i en 35 mm skål. Cellesuspensionen blev derefter overlejret på en presolidified 0,72% hårdt agar. Mediet indeholdende 0,36% blød agar blev suppleret gang om ugen. Kolonier ( 10 celler), der opstod inden for 3 uger blev præsenteret som clonogenicity. Fem retter blev undersøgt for hver celletype og blindt talt under mikroskop (× 200) på alle områder.

Sphere Dannelse Analyse af SP og NSP Celler

Isoleret SP og NSP celler fra to cellelinier (4.000 celler /skål) blev dyrket i serum-frit medium med 10 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF) (Sankojunyaku, Tokyo, Japan) og 20 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) (Sankojunyaku) ved anvendelse ultra Lavt-tillæg 6-brønds plader (Corning Inc., Corning, NY, USA) i 1 uge, hvorefter kugle-dannelse blev vurderet ved at tælle antallet af kugler ( 3-celler). under mikroskop (× 200)

Drug Resistance Assay

isoleret SP og NSP celler blev plantet på 2.000 celler per brønd i 96-brønds plader, og effekten af ​​multikinasehæmmer, Sorafenib (2 uM) (Cell Signaling Technology. Inc. , Danvers, MA, USA) og IFNa (4.000 IE /ml) (OIF, Otsuka Pharma Co., Ltd., Tokyo, Japan) blev undersøgt. blev bestemt Lægemiddelresistens efter behandling i 72, 96 eller 144 timer ved MTT-analysen.

tumorgenicitet Analyser af SP og NSP Cells in vivo

At udforske tumorigen kapacitet, SP og NSP-celler (1, 10 eller 100 × 10

3) blev isoleret fra de to RCC-cellelinjer, placeret i 100 pi medium og separat injiceret i det subkutane rum i flanken af ​​fem uger gamle NOD /SCID-mus under bedøvelse. Tumorigen kapacitet blev bedømt 8 uger efter injektion.

cDNA Forberedelse og kvantitativ real-time RT-PCR for Gene Expression Assay

Efter SP og NSP celler i ACHN og KRC /Y blev isoleret, alt RNA blev ekstraheret under anvendelse af et RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), og komplementært DNA (cDNA) blev syntetiseret under anvendelse af revers transkription System (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens anvisninger. Kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR) blev udført for at undersøge ekspressionen af ​​CSC-LC ejendomsrelaterede gener (f.eks ABC transporter-gener (ABCB1 og ABCG2), selvreplikationsaktiviteter gener (BMI1 og c-MYC), anti-apoptose gener (BCL2 og CFLAR), hypoxi-relaterede gener (hypoxi inducerbare faktor 1α (HIF1α) og vaskulær endotel vækstfaktor-A (VEGFA)), og epitel-mesenkymale overgang (EMT) -relaterede gener (sneglen og Twist) ) med en ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genekspression assays og primer og probe blandinger blev anvendt til ABCB1, ABCG2, ALDH1A1, BMI1, c-myc, BCL2, CFLAR, HIF1α, VEGFA, sneglen, Twist, og β-actin (assay id’er (Hs 00184500_m1, Hs00184979_ml, Hs00946916_m1, Hs00180411_ml, Hs00153408_ml, Hs00608023_m1, Hs00153439_m1, Hs00153153_ml, Hs00900055_ml, Hs00195591_m1, Hs01675818_s1, og Hs99999903_m1 henholdsvis; Applied Biosystems), og termiske forhold cyklus var som følger: indledende inkubation ved 95 ° C i 10 min, derefter 40 cykler skiftevis på skift med 95 ° C i 10 s, 60 ° C i 20 s og 72 ° C i 15 s, og derefter holdt ved 72 ° C i 10 min.

Sammenlignende genekspression analyse blev udført under anvendelse af 2

(- ΔΔCt) metoder med normalisering til niveauet for den interne kontrol gen, β-actin

ALDH1 Expression i SP og NSP Celler og i celler under patologiske tilstande

ALDH1 ekspression blev undersøgt i. prøver fremstillet fra SP og NSP-celler, lægemiddelbehandlede celler, og celler dyrket under hypoxiske betingelser. Kort fortalt blev SP og NSP-celler isoleret fra ACHN og KRC /Y celler dyrket i 72 timer under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet ovenfor. Parentale celler og isolerede SP og NSP-celler blev anvendt som prøver. ACHN celler dyrket med EMEM indeholdende Sorafenib (1 uM) eller IFNa (4.000 IE /m) i 48, 72 eller 96 timer, og cellerne dyrket under hypoxiske (1% O

2) betingelserne for 48, 72 eller 96 timer var også brugt som prøver. Prøver blev suspenderet i ALDEFLUOR assaybuffer indeholdende ALDH substrat, Baaa (Bodipy-aminoacetaldehyd) (50 ug tør reagens), med eller uden 5 pi af den specifikke ALDH inhibitor diethylaminobenzaldehyde (DEAB 1,5 mM i 95% ethanol-stamopløsning), som en negativ kontrol og inkuberet i 60 minutter ved 37 ° C (ALDEFLOUR KIT, stamceller teknologier, Vancouver, BC, Canada) og analyseres ved anvendelse af flowcytometri (FCM).

Biologiske kendetegn ALDH1-positive og ALDH1- negative celler

Sphere dannelse assay blev udført i ACHN og KRC /Y-celler. Tumorigenicitet assay og genekspression assay blev udført for at undersøge biologiske funktioner i ALDH1-positive og ALDH1-negative ACHN celler. At sammenligne selvfornyelse kapacitet mellem ALDH1-positive og ALDH1-negative ACHN celler undersøgte vi en kugle-dannende evne ved tre på hinanden følgende serielle passager af enkelt-dissocierede celler ifølge fremgangsmåden ifølge Lim et al. [29]. Kort fortalt, efter at dissociere den første passage kugle med 0,25% trypsin, enkeltstrengede dissocierede celler i ALDH1-positive og ALDH1-negative celler af ACHN blev udpladet i 6-brønds plader. En uge senere blev antallet af kugler tælles og den samme procedure blev gentaget endnu en gang. Tumorigenicitet assay og genekspression assay blev udført som beskrevet ovenfor bortset sammenligningen på 1 × 10

3 celler blev ikke udført i tumorigenicitet assay.

Statistical Analysis

Sammenligning af cellevækst-assay blev udført under anvendelse to-faktor faktoriel ANOVA, og de af kolonidannelse assayet, sfære formation assay og medikamentresistens assay blev udført ved anvendelse af Students

t

-test. De øvrige data sammenligninger blev udført ved anvendelse af Mann-Whitney U test. En værdi på

P

0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Angivelse af CSC Markers

ACHN udtrykte CD90 (96,9%) og EpCAM (. 87,7%), men ekspression af CD105 (1,5%), CD133 (1,3%) og ABCG2 (0,9%) forblev på et meget lavt niveau. På den anden side, KRC /Y udtrykt CD105 (28,9%) og EpCAM (93,0%), men ekspression af CD90 (1,7%), CD133 (1,7%), og ABCG2 (2,9%) var meget lav.

SP Cells Analyse og Expression af CSC Markers i SP og NSP Celler

SP celle fraktioner i ACHN og KRC /Y var 1,4% og 1,7%, henholdsvis (fig. 1A). Efterfølgende undersøgte vi ekspressionen af ​​CSC markører, såsom CD90 og EpCAM i ACHN, og CD105 og EpCAM i KRC /Y, i SP og NSP-celler. Der var ingen synlig forskel i CD90 og EpCAM udtryk mellem SP og NSP celler i ACHN. Selv om der var ingen forskel i EpCAM udtryk mellem SP og NSP celler i KRC /Y, CD105 ekspressionen i SP-celler (24,6%) var meget højere end i NSP-celler (4,6%) (fig. 1B).

(A) ACHN og KRC /Y blev mærket med Hoechst 33342, og derefter analyseret ved FCM. De SP-celle satser i ACHN og KRC /Y var 1,4% (A-a) og 1,7% (A-C), henholdsvis som faldt betydeligt i nærværelse af reserpin (A-b, A-d). Forsøget blev gentaget mindst tre gange for hver cellelinje og næsten identiske resultater blev opnået. Et repræsentativt tal på vores eksperimenter er vist. (B) Der var ingen synlig forskel i CD90 og EpCAM udtryk mellem SP og NSP celler i ACHN. I KRC /Y-cellelinje, selv om der var ingen forskel i EpCAM udtryk SP celler udtrykte en højere CD105-positive celler end NSP-celler (SP vs NSP: 24,6% vs. 4,6%). Eksperimenterne blev gentaget to gange, og næsten identiske resultater blev opnået. Et repræsentativt tal på vores eksperimenter er vist.

Biologiske funktioner i SP og NSP Celler i ACHN og KRC /Y in vitro

Der var ingen signifikant forskel i den celleproliferative evne og clonogenicity mellem SP og NSP-celler i ACHN. På den anden side, efter dyrkning i 48 timer, SP-celler i KRC /Y havde en signifikant højere proliferativ evne end NSP-celler (

P

0,0001) (. Figur 2A). Selvom SP celler i KRC /Y havde en signifikant højere clonogenicity end NSP-celler (

P

0,01) (. Figur 2B), var der ingen signifikant forskel i sfære dannende evne mellem SP og NSP celler i KRC /Y. Omvendt SP-celler i ACHN havde en signifikant højere sfære dannende evne end NSP-celler (fig. 2C). Efter 72, 96 eller 144 timer behandling med Sorafenib eller IFNa blev følsomheden over for hvert medikament vurderes med MTT-assayet. Der var ingen forskel i følsomhed mellem SP celler og NSP celler i KRC /Y mod Sorafenib eller IFNa behandling. Imidlertid SP celler i ACHN havde en signifikant højere IFNa resistens (

P

0,0001). (. Figur 2D)

(A) Vækstkurver for SP og NSP-celler. SP celler i KRC /Y viste en højere proliferativ evne i forhold til NSP-celler (*

P

0,0001). (B) Den clonogenity blev øget betydeligt i SP celler i KRC /Y (*

P

0,01). (C) Sphere danner evne var signifikant højere i SP celler i ACHN (*

P

0,05). (D) Lægemiddelresistens af SP og NSP celler behandlet med Sorafenib eller IFNa. SP celler i ACHN havde højere IFNa modstand (*

P

0,0001). Forsøgene blev gentaget to gange, og næsten identiske resultater blev opnået.

tumorgenicitet Analyser in vivo i SP og NSP Celler

Både SP og NSP celler viste tumor danner evne i hver af de to RCC-cellelinier. Forholdet mellem tumorigenicitet mellem SP og NSP celler i ACHN og KRC /Y var ikke signifikant forskellig, men tumorigeniciteten af ​​SP-celler var lidt højere end den for NSP-celler i ACHN (tabel 1).

Analyse af CSC-LC ejendomsrelaterede genekspression i SP og NSP Celler ved QRT-PCR

Der var ingen signifikante forskelle i mRNA udtryk for ABC transportør gener (ABCB1 og ABCG2), selv-replikation gener (BMI 1 og c-MYC), anti-apoptose gener (BCL2 og CFLAR), hypoxi-relaterede gener (VEGFA og HIF1α), og EMT-relaterede gener (sneglen og twist) mellem SP og NSP-celler i de 2 cellelinier. SP celler i ACHN udtrykte et lidt højere niveau af ALDH1A1 mRNA end NSP celler, men blev ikke observeret nogen synlig forskel i KRC /Y (fig. 3).

Der var ingen signifikante forskelle i mRNA udtryk for ABC transportør gener (ABCB1 og ABCG2), self-replikationsgenerne (BMI-1 og c-myc), anti-apoptose gener (BCL2 og CFLAR), hypoxi-relaterede gener (VEGFA og HIF1α), og EMT-relaterede gener (Sneglen og twist) mellem SP og NSP-celler i de 2 cellelinier. SP celler i ACHN udtrykte et lidt højere niveau af ALDH1A1 mRNA end NSP celler, men blev ikke observeret nogen synlig forskel i KRC /Y. Forsøget blev gentaget mindst fire gange for hver cellelinje og næsten identiske resultater blev opnået.

ALDH1 Expression, og biologiske funktioner af ALDH1-positive og ALDH1-negative RCC Cells

Den ALDH1-positive celle sats i KRC /Y-celler var 6,5%. Der var ingen forskel i ALDH1 udtryk mellem SP og NSP celler. I ACHN celler, den ALDH1-positive celle lå 15,3%. Også antallet af ALDH1-positive SP-celler (32,7%) var højere end den for NSP-celler (14,6%) (fig. 4A). Cellevækst blev signifikant undertrykt i celler behandlet med Sorafenib eller IFNa og i celler udsat for hypoxi, sammenlignet med kontrolceller (fig. 4B). Vedrørende ALDH1 ekspression, var der ingen tydelig forskel i ALDH1-positive celle satser blandt kontrolceller, celler behandlet med Sorafenib eller IFNa og celler udsat for hypoxisk tilstand i 48 timer. Men andelen af ​​ALDH1-positive celler steg kronologisk, især i celler behandlet med Sorafenib eller udsat for hypoxiske betingelser. Især efter udsættelse for Sorafenib eller IFNa eller hypoxi i 96 timer, de procentdele af ALDH1-positive celler var 40,0%, 19,2% og 37,1%, henholdsvis (fig. 4C).

(A) udtryk for ALDH1 i SP celler og NSP celler i ACHN og KRC /Y. De ALDH1-positive celle satser i ACHN og KRC /Y var 15,3% og 6,5%, henholdsvis. (B) Sammenligning af cellevækst blandt kontrolceller, celler behandlet med Sorafenib eller IFNa og celler udsat for hypoxi i ACHN. Cellevækst blev målt ved 48, 72 eller 96 timer efter lægemiddelbehandling eller eksponering for hypoxi. Cellevækst efter lægemiddelbehandling eller udsættelse for hypoxi blev signifikant undertrykt sammenlignet med kontrol (*

P

0,005, **

P

0,0001 vs. kontrol). (C) Procentdelen af ​​ALDH1-positive celler i celler behandlet med Sorafenib eller IFNa eller celler eksponeret for hypoxi i 48, 72 eller 96 timer. Procentdelen af ​​ALDH1-positive celler i celler behandlet med Sorafenib eller IFNa eller celler eksponeret for hypoxi i 96 timer var højere sammenlignet med den normale tilstand. Eksperimenterne blev gentaget to gange, og næsten identiske resultater blev opnået. Et repræsentativt tal på vores eksperimenter er vist. (D) Sphere dannende evne mellem ALDH1-positive celler og ALDH1-negative celler. Kuglen dannelse af ALDH1-positive celler i ACHN og KRC /Y var højere end for ALDH1-negative celler. Forsøgene blev gentaget to gange, og næsten identiske resultater blev opnået.

Kuglen danner evne ALDH1-positive celler i både ACHN og KRC /Y var højere end for ALDH1-negative celler. Desuden ALDH1-positive celler i ACHN genereret betydeligt større sfære størrelser end ALDH1-negative celler (Fig. 4D). Vi fandt også, at enkeltstrengede dissocierede sfære celler udpladet ved en densitet på 4.000 celler per brønd gav anledning til sekundære og tertiære sfærer inden for 1 uge podning. Selv om antallet af kugler viste sig at falde i den anden og tredje passager i forhold til den første passage, blev kuglen danner evne ALDH1-positive celler i ACHN opretholdes under den anden og tredje passager. På den anden side, ALDH1-negative celler dannede et par sekundære kugler (fig. 5).

Kuglen danner evne ALDH1-positive celler i ACHN blev fastholdt i den anden og tredje passager (*

P

. 0,0001)

Tumor dannelse blev observeret i tre af fem og fem af fem mus injiceret med 10 × 10

3 og 100 × 10

3 ALDH1- positive celler, henholdsvis efter 8 uger. Imidlertid ALDH1-negativ celle injektion udviklet ingen synlige tumorer hos alle mus på dette tidspunkt (tabel 2).

QRT-PCR i ALDH1-positive og ALDH1-negative ACHN Celler

Vi udførte QRT-PCR-analyse for at sammenligne CSC-LC ejendomsrelaterede genekspression i ALDH1-positive og ALDH1-negative ACHN celler. ALDH1-positive celler udtrykte signifikant højere niveauer af mRNA i alle gener undtagen Snail end ALDH1-negative celler. Niveauerne af stigningen var som følger: ABCB1, 4,9-fold; ABCG2, 2,5-fold, ALDH1A1, 4,8-fold; BCL2, 5,0-fold; CFLAR, 4,1-fold; BMI-1, 3,9-fold; c-myc, 3,9-fold; HIF1α, 3,4 gange; VEGFA, 2,7-fold; Twist, 4,0-fold (Fig. 6).

ALDH1-positive celler viste signifikant højere mRNA-ekspression af ALDH1A1, transportproteiner-relaterede gener (ABCB1 og ABCG2), selvreplikationsaktiviteter gener (BMI-1 og C MYC), anti-apoptose gener (BCL2 og CFLAR), hypoxi-relaterede gener (HIF1α og VEGFA) og EMT-relaterede gener (Twist) end ALDH1-negative celler i ACHN. Der var imidlertid ingen signifikant forskel i mRNA-ekspression af Snail mellem ALDH1-positive og ALDH1-negative celler. Forsøgene blev gentaget mindst fire gange, og næsten identiske resultater blev opnået.

Diskussion

Siden CSC konceptet blev foreslået at forklare heterogenitet af tumorceller, CSCS eller CSC- LCS er blevet identificeret i mange typer af kræft. Generelt CSCS besidder både selvfornyelse og differentiering kapaciteter tillader CSC til delvist genskabe den cellulære heterogenitet af forældremyndigheden tumor. En række undersøgelser har rapporteret, at den manglende evne konventionelle behandlinger for at forebygge tilbagefald eller metastaser skyldes tilstedeværelsen af ​​små delmængder af resistente celler, nemlig CSCS [8], [30]. I de senere år SP teknik er blevet en af ​​de mest anvendte fremgangsmåder til isolering CSC-LC’ere. Da den detaljerede farvning og målemetode med Goodell et al. blev først introduceret, har mange forskere rapporteret, at SP-celler er en delmængde af celler med højere lønklasse malignitet, og CSC-LCS egenskaber [15], [16], [31]. Med hensyn til RCC, Addla et al. rapporterede, at SP-celler udgør 4-6% af de samlede cancerceller. Men de cellulære karakteristika SP celler er ikke godt forstået [17].

I vores nuværende undersøgelse fandt vi, at SP fraktioner i ACHN og KRC /Y var 1,4% og 1,7%, henholdsvis. Der var ingen forskel mellem KRC /Y SP og NSP-celler i tumorigenicitet, sfære dannende evne, eller i resistens over for sorafenib eller IFNa, som konventionelt anvendes til behandling af fremskreden RCC. Disse fund indikerer, at KRC /Y SP celler mangler karakteristika CSCS-LC’ere. I modsætning, mens der ikke var nogen signifikante forskelle mellem ACHN SP og NSP celler i in vitro-vækst celle eller kolonidannelse analyser, har SP-celler viser en højere sfære danner evne, højere modstand IFNa og højere tumorgenicitet for NOD /SCID-mus end NSP celler , tyder på celler med CSC-LC ejendomme indgår i ACHN SP celler. På nuværende SP tilgang er den mest anvendte metode til at identificere CSC markører imidlertid mange forskere stadig spørgsmålstegn ved forholdet mellem SP-celler og CSCS [32] – [34]. Desuden Ibrahim et al. studerede forholdet mellem Hoechst farvning koncentration og inkubationstid og rapporterede, at Hoechst farvning koncentration havde en effekt på celleskader [35]. I vores foreliggende undersøgelse for at identificere de SP-celler i ACHN og KRC /Y vi bruges Hoechst-farvning i en koncentration på 5 ug /ml og 10 ug /ml. Hoechst-farvning udføres generelt ved en koncentration på 5 ug /ml, men i den foreliggende undersøgelse anvendte vi en højere koncentration i KRC /Y-celler [36]. Således kan vi ikke helt udelukke muligheden for, at cellulære skader på grund af Hoechst farvning var ansvarlig for forskellen i biologiske kendetegn observeret mellem KRC /Y-celler in vivo og in vitro i vores nuværende undersøgelse.

Bussolati et al. tidligere rapporteret i en human RCC-cellelinie, som CD105-positive celler udgjorde en cellegruppe med høj clonogenicity og høj tumorigenicitet; Men vores nuværende undersøgelse viste, at mens KRC /Y SP celler indeholdt omkring fem gange så mange CD105-positive celler som KRC /Y NSP celler, var der ingen forskel i CSC-LC egenskaber mellem KRC /Y SP og NSP celler. Desuden blev CD105 ekspression fundet i nogle få celler i ACHN. Således er vores nuværende resultater konflikt med resultaterne af Bussolati et al., Og foreslå den mulighed, at CD105 ikke kan være en universel CSC markør i RCC.

Mange nyere undersøgelser har rapporteret, at SP-celler viser en højere udtryk for ABC transportører, især ABCG2, end NSP celler i mange solide tumorer og cellelinjer, og at det kan spille en rolle i narkotika efflux og lægemiddelresistens. Udtrykket af narkotika transportører via ABCG2 er en vigtig markør i identifikation og analyse af SP celler [19], [20], [31], [37]. I vores nuværende undersøgelse observerede vi ingen forskel i ABCG2 ekspression på mRNA-niveauet mellem SP og NSP-celler i nogen af ​​de to RCC-cellelinier undersøgt. Men i de sidste par år har flere undersøgelser har rapporteret, at SP-celler udtrykker andre transportører, såsom ABCB1 og ABCB5, foruden ABCG2 [38], [39]. Derfor kan dette resultat skyldes ekspressionen af ​​de andre transportører i SP-celler, eller det kan være, fordi funktionerne af ABCB1 og ABCG2 ikke var afspejlet af mRNA-ekspression af disse gener. Dette punkt skal undersøges nærmere.

Dernæst for at studere andre CSC markører, vi udført en Aldefluor assay. ALDH1 enzymatisk aktivitet er blevet anerkendt i de senere år som en generel markør for både normale stamceller og CSCS [40], [41]. ALDH1-positive celler har CSC-LC egenskaber, såsom evnen til at kopiere sig selv og til at danne tumorer, så en række forskere har anvendt ALDH1 enzymatisk aktivitet som en CSC markør i mange forskellige typer cancer, herunder lunge, lever, bugspytkirtel , prostata, blære, bryst og malignt melanom [42] – [46]. Det er også blevet rapporteret i bryst og flere andre kræftformer, at høj ALDH1 udtryk er tæt forbundet med dårlig klinisk prognose [23]. For nylig er sfære formation assays er ofte blevet brugt til at vurdere selvfornyelse kapacitet CSC-LC’ere.