PLoS ONE: FGFR4 Rolle i Epithelial-Mesenchymale Overgang og dets behandlingsmæssige værdi i kolorektal Cancer

Abstrakt

fibroblast vækstfaktor receptor 4 (FGFR4) er afgørende i den tidlige udvikling og væv reparation. FGFR4 ekspressionsniveauer er meget begrænsede i voksent væv, undtagen i flere faste tumorer, herunder kolorektal cancer, som viste overekspression af FGFR4. Her, FGFR4 mutationsanalyse kasseret tilstedeværelse af aktiverende mutationer, bortset Arg

388, i forskellige colorektal cancer-cellelinjer og tumorale prøver. Stabil shRNA FGFR4-nedregulering i SW480 og SW48 cellelinier resulterede i et signifikant fald i celleproliferation, adhæsion, cellemigration og invasion. Dette fald i tumorigene og invasive kapacitet kolorektale cancerceller blev ledsaget af et fald på Snail, Twist og TGFp genekspressionsniveauer og en forøgelse af E-cadherin, hvilket medfører en tilbagevenden til en mere epitelial fænotype, i tre forskellige cellelinjer. Desuden FGFR4-signalering aktiveret den onkogene SRC, ERK1 /2 og AKT pathways i colon cancerceller og fremmes en forøgelse i celleoverlevelse. Relevansen af ​​FGFR4 i tumorvækst blev støttet af to forskellige strategier. Kinaseinhibitorer ophævede FGFR4-relateret cellevækst og signalveje på samme udstrækning end FGFR4-lyddæmpet celler. Specifikke FGFR4 målretning hjælp antistoffer fremprovokeret en tilsvarende reduktion i cellevækst. Desuden FGFR4 knock-down celler udviste en nedsat evne til

in vivo

tumordannelse og angiogenese i nøgne mus. Kollektivt, vores data understøtter en afgørende rolle for FGFR4 i tumorigenese, invasion og overlevelse i kolorektal cancer. Desuden FGFR4 målretning vist sin anvendelighed for tarmkræft terapi

Henvisning:. Peláez-García A, Barderas R, Torres S, Hernández-Varas P, Teixido J, Bonilla F, et al. (2013) FGFR4 Rolle i Epithelial-Mesenchymale Overgang og dets behandlingsmæssige værdi i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (5): e63695. doi: 10,1371 /journal.pone.0063695

Redaktør: Qian Tao, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: November 9, 2012; Accepteret: April 6, 2013; Udgivet: May 16, 2013 |

Copyright: © 2013 Peláez-García et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af tilskud BIO2009-08818 fra det spanske ministerium for videnskab og innovation, indrømmer etablerede forskergrupper (AECC) og tildele S2011 /BMD-2344 /Colomics2 fra Comunidad de Madrid. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

fibroblastvækstfaktorer (FGF’er) har været impliceret i flere biologiske processer under embryo udvikling, sårheling, hæmatopoiese og angiogenese [1]. De binder til fire FGF-receptorer (FGFR) udpegede FGFR1-4 [2]. Den FGFR’er struktur indbefatter et ligandbindende domæne, der indeholder tre forskellige immunglobulin-lignende domæner (kaldet Ig I, Ig II og Ig III). Liganden domænet er efterfulgt af en enkelt transmembrant domæne og et intracellulært cytoplasmatiske tyrosinkinasedomæne. FGFR4 viser den mest begrænsede ekspressionsmønster til fosterudviklingen, vævsreparation [3], [4], når sammenlignet med de andre tre FGFR’er, og dens ekspressionsniveauer falde postnatalt. Hos voksne er FGFR4 udtrykt i muskel myofibroblaster under regenerering efter skade, men ikke i moden skeletmuskulatur [5]. FGF-receptorer dysregulation har vist sig at spille en vigtig rolle i cancerudvikling og progression. Der er blevet foreslået at forekomme gennem overekspression, genamplifikation eller mutation [6].

Tidligere vores gruppe identificeret FGFR4 som et autoantistof mål i colorektal cancer disse forandringer (CRC) anvendelse af protein microarrays [7]. Desuden observerede vi en klar overekspression af FGFR4 i kolorektale cancer cellelinjer (især i to ud af fire meget metastatiske kolorektal cancer cellelinjer) med en potentiel sammenslutning af FGFR4-udtryk til sene stadier kolorektal cancer [8]. FGFR4 er blevet rapporteret at være overudtrykt i humane bryst-, prostata-, tyktarms-, rhabdomyosarcomaceller, gastriske, pancreas-, hepatocellulære og hypofyse adenocarcinomer [4], [9], [10], [11], [12], [13] , [14], [15], hvor det kan bidrage til tumorudvikling gennem forskellige mekanismer [4], [9]. Desuden blev FGFR4 ekspressionsniveauer associeret med metastatisk sygdom og ringe overlevelse i gastrisk, lunge-, bryst- adenocarcinom og rhabdomyosarkom [16], [17], [18]. FGFR4 somatiske mutationer er sjældne i kræft [11], [19], [20], [21]; Arg

388 er den mest almindelige enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) i FGFR4, som provokerer forøget stabilitet og langvarig aktivering af receptoren. Det har været forbundet med dårlig prognose for positiv knude brystcancer, high-grade bløddelssarkom, hoved og hals og lunge pladecellecarcinom [9], [16], [18], [22], [23].

Blandt de 18 FGF ligander, FGF19 binder fortrinsvis FGFR4 [24], selv om det binder også FGFR1. Binding forekommer i et kompleks omfattende heparin, FGFR4 og to FGF-molekyler, hvilket udløser FGFR dimerisering, hvilket fører til autophosphorylering af multiple tyrosinrester i det intracellulære tyrosinkinasedomæne [3], [25]. FGF19-FGFR4 er blevet foreslået at spille en rolle i induktionen af ​​hepatocytproliferation og carcinogenese [26]. Antistoffer rettet mod FGF19 har vist terapeutisk løfte i forskellige tumorxenotransplantater [27]. Men blokering af FGF19 kan virke på forskellige FGF-receptorer, [28].

Vi har brugt forskellige tyktarmskræft prøver og cellelinier (SW480, SW620, SW48, KM12C og KM12SM) [29], [30], [31] for at undersøge forekomsten af ​​SNPs eller aktiverende mutationer i FGFR4 og at beskrive den biologiske relevans som onkogen og terapeutisk mål i kolorektal cancer. KM12C og KM12SM epitelceller besidder tilsvarende genetisk baggrund, forskellige i deres metastatiske egenskaber [31]. SW480 og SW620 er to isogene kolorektale cancer cellelinjer. SW480 blev isoleret fra en primær Dukes B tumor af colorektal cancer, hvorimod SW620-cellelinien blev isoleret fra en metastatisk lymfeknude fra den samme patient [30]. SW48 kolorektal cancerceller blev afledt fra en tumor på hertugens C etape [30]. Disse fem cellelinier også forskellige i FGFR4 proteinekspressionsniveauer [8]. I vores undersøgelse er der ikke nye SNPs eller aktiverende mutationer findes i FGFR4. Dog afslørede tab-of-funktion eksperimenter en vigtig rolle FGFR4 i tumorgene egenskaber af kolorektal cancer celler, siden sin udtømning ophævet proliferation, adhæsion, migration og invasion. FGFR4-lyddæmpning forårsagede en opregulering af E-cadherin ekspression og nedregulering af Sneglen og andre epitel-mesenkymale overgang (EMT) mediatorer. Endelig viste vi, at FGFR4 målretning var i stand til at blokere tumorvækst

in vitro

in vivo

.

Materialer og metoder

Etik Statement

Etisk Komité Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, Spanien) godkendte protokoller, der anvendes til eksperimentelt arbejde med mus.

cellelinier, RNA Extraction, Antistoffer og Inhibitors

kolorektal cancer cellelinjer KM12C og KM12SM [31], [32] blev opnået fra Dr. I. Fidler (MD Anderson). SW480, SW48 og HEK293-cellelinier var fra ATCC. Celler blev dyrket ifølge etablerede protokoller [7]. RNA blev ekstraheret fra cellelinier og 20 parrede normal /tumoral væv fra cancerpatienter med RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc.) i henhold til fabrikantens protokol. Den ekstraherede RNA blev kvantificeret med en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies Inc.).

anvendtes i alt 15 forskellige antistoffer, herunder proteiner relateret til FGFR4 signalvejen og kontrol proteiner. Source, klonalitet, og betingelser for brug for alle tilfælde og teknik er angivet i tabel S1. FGFR4-specifikt polyklonalt antistof (sc-124, Santa Cruz Biotechnology) og kontrol GST-specifikt polyklonalt antistof fra GE Healthcare blev anvendt til FGFR4-targeting eksperimenter. FGFR-inhibitorer var PD173074 (Sigma) og TKI-258 (Novartis). PD173074 er en pan-FGFR-hæmmer, der inducerer apoptose [33]. TKI-258 er et klinisk relevant, multi-kinase inhibitor, herunder VEGFR og PDGFR kinaser blandt andre [34]. Andre inhibitorer var: PP2 (Sigma) i SRC, JNK Inhibitor II og UO126 (Calbiochem) for MEK1 /2. De blev brugt på 3 uM og 15 uM som tidligere rapporteret [35].

Vektorer, shRNAs, siRNA’er og transfektioner

pRS vektorer indeholdende specifik shRNAs (TI378641, TI378642, TI378643 og TI378644) for FGFR4 (NM_022963) og en kontrol shRNA ikke-effektiv mod enhver menneskelig sekvens (TR30003) var fra Origene. Stabilt-transficerede celler blev opnået ved retroviral infektion. Kort fortalt blev HEK293FT celler transficeret med pRS vektorer og pNGVL-gag-pol og pNGVL-VSVG pakkevektorer vha jetPRIME transfektionsreagens (POLYPLUS). Efter inkubering af cellerne i 12-15 timer i serumfrit medium, blev mediet erstattet med DMEM indeholdende 10% FBS og penicillin /streptomycin. Dagen efter blev medier indeholdende lentivirale partikler centrifugeret, fortyndet 1:02 til 1:10 i DMEM indeholdende 10% FBS og antibiotika og tilsættes direkte til SW480 og SW48 kolorektal cancerceller. Efter tre dages inkubation inficeret SW480 og SW48 colorektale cancerceller blev udvalgt under anvendelse af 1 ug /ml puromycin (Sigma) i 2-3 uger. Derefter blev celler dyrket med 0,5 ug /ml puromycin.

FGFR4 siRNA’er og kontroller blev fremskaffet fra Sigma. For siRNA transfektioner, 5 × 10

5-celler blev podet i dyrkningsplader og opretholdt i DMEM med 10% føtalt kalveserum ved 37 ° C i 5% CO

2 i 24 timer. Celler blev transficeret med 55 pmol siRNA anvendelse af 2 pi JetPrime transfektionsreagens i 200 pi JetPrime puffer. Derefter 48 timer efter transfektion blev cellerne analyseret ved Western blot og semi-kvantitativ PCR [35].

Sekvensanalyse, Semi-kvantitativ og Real-time kvantitativ PCR

cDNA blev syntetiseret ved hjælp den Hævet III First Strand Synthesis (Invitrogen). De anvendte primere til at få FGFR4 sekvens blev tidligere beskrevet [36]. Kort fortalt blev fire par primere (A, B, C og D) benyttes til at få hele molekylet ved PCR i fragmenter på ca 1000 bp under anvendelse af Advantage 2 polymerase (Clontech). Exonuklease I (USB) og reje-alkalisk phosphatase (USB) blev sat til PCR-produkter. De var direkte sekventeret i en ABI7002 sequencer (Applied Biosystems).

cDNA blev syntetiseret som før og gælder anvendes til semikvantitativ PCR-analyse af TGF-Ø1 og GAPDH-mRNA-niveauer i kolorektale cancercellelinjer. PCR-reaktioner blev udført under anvendelse af følgende primere; human TGF-β1, sense 5′-ACCGGCCTTTCCTGCTTCTCA-3 ‘, antisense 5′-CGCCCGGGTTATGCTGGTTGT-3′; human GAPDH, sense, 5’-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3 ‘, antisense 5′-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3’. Specifikke primere for FGFR1-3 bruges til at teste specificiteten af ​​shRNAs og siRNA’er rettet mod FGFR4 var: FGFR1, fornemmer 5′-CACAAGCCACGGCGGACT-3 ‘, antisense 5′-TGATGCTCCAGGTGGCAT-3′; FGFR2, sense 5’-CGTTGCCATTCAAGTGACTG-3 ‘, antisense 5’GACAAAATCTTCCGCACCATC-3’; og FGFR3, sense 5’CAGTTGGTCTTCGGCAGC-3 ‘, antisense 5′-TGCTGCCAAACTTGTTCT-3’.

I QRT-PCR blev reaktionerne udført under anvendelse af tidligere beskrevne EMT markør primere [37] og SYBR-Green Master PCR mix (Applied Biosystems) i tre eksemplarer. PCR og dataindsamling blev udført på IQ5 (BioRad). Alle quantitations blev normaliseret ved anvendelse af humant GAPDH. For semi-kvantitativ PCR, blev D primerpar anvendes til at bestemme mængden af ​​FGFR4 cDNA under anvendelse GAPDH amplifikation med specifikke primere som kontrol [36].

Western blot-analyse

Protein ekstrakter fra kolorektal cancer-celler blev fremstillet og kvantificeret med 2D-Quant kit (GE Healthcare) i henhold til tidligere offentliggjorte protokoller [7]. Derefter, 25 ug af hver proteinekstrakt blev kørt parallelt under anvendelse af 10% SDS-PAGE. For immunoblotting blev proteiner overført til nitrocellulosemembraner (Hybond-C ekstra) under anvendelse af halvtør udstyr (Bio-Rad). Efter blokering blev membraner inkuberet med specifikke mono- eller polyklonale antistoffer mod de udvalgte proteiner. Membraner blev inkuberet ved optimerede fortyndinger med primære antistoffer, efterfulgt af inkubation med enten HRP-anti-mus IgG (Pierce) ved 1:5000 fortynding eller HRP-anti-kanin IgG (Sigma) ved 1:5000 fortynding. Specifikke reaktive proteiner blev visualiseret med SuperSignal West Pico Maksimal følsomhed Substrat (Pierce). Overfloden af ​​proteinerne i Western blot-analyser blev bestemt ved densitometri hjælp Mængde One 1D Analysis Software v4.6 (Bio-Rad Laboratories).

Cell Adhesion, Invasion, Apoptose Detection, spredning, og Sårheling Analyser

celleadhæsionsassays blev plader med 96 brønde overtrukket med Matrigel (0,4 ug /mm

2) (BD Biosciences) i coating-buffer (0,1 M NaHCO

3 pH: 8,8) natten over ved 4 ° C, og herefter inkuberet med adhæsion medium (0,5% bovint serumalbumin i serumfrit DMEM) i 2 timer ved 37 ° C for at blokere uspecifik binding. Celler blev udsultet uden serum i 5 timer og mærket med BCECF-AM (Molecular Probes) i 30 min ved 37 ° C, fritliggende med 2 mM EDTA i PBS og resuspenderet i adhæsion medium. Derefter blev 10

5-celler tilsat i tre eksemplarer til plader og inkuberet i 30 min. At fjerne ikke-adhærerende celler blev pladerne vasket to gange med DMEM. Bundne celler blev lyseret under anvendelse af 1% SDS i PBS og fluorescensen kvantificeres i en Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo Scientific). For Matrigel invasion assays, 8 × 10

5 SW480 eller SW48-celler blev resuspenderet i invasion medium (serumfri DMEM indeholdende 0,5% BSA) og fyldt på 8 um porestørrelse filtre overtrukket med 35-50 pi 1 :3 fortynding af Matrigel (BD Biosciences) i Transwells (Costar). De nedre rum i invasion kamre blev fyldt med medium indeholdende 10% FBS (Gibco). Efter 22 timers inkubation ved 37 ° C blev ikke-invaderende celler fjernet fra den øvre overflade af filteret, og celler, der migrerede gennem filteret blev fikseret med 4% paraformaldehyd (Sigma), farvet med krystalviolet og de invaderende celler talt under et mikroskop. Til sårheling, blev SW480 og SW48-celler podet i tre eksemplarer med en tæthed på 10

6 celler pr brønd i 24-brønds plader. Efter fastgørelse, blev en 1 mm bred sår produceret i cellemonolaget blev vækstmediet erstattet og et billede blev taget (dag 0) i et Olympus CK40 mikroskop udstyret med et Olympus DP12 kameraet på × 40 forstørrelse. Billeder af samme område blev taget hver 24 timer.

For apoptose detektionsassays blev celler inkuberet med 1 mM H

2O

2 i 16 timer uden serum. Derefter blev celler afmonteret og inkuberet med FITC-mærket-Annexin V (Miltenyi Biotec Inc.) og propidiumiodid ifølge producentens anvisninger og analyseret ved cytofluorometri (Coulter Epics XL). For celleproliferationsassays blev eksperimenter udført følgende fastsatte procedurer [38], [39]. Kort fortalt blev vækstmediet ændret 24 timer efter podning (dag 0), og celler blev yderligere inkuberet i tre dage. Derefter blev mediet fjernet, og celler blev farvet med 100 pi det chromogene farvestof 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (Sigma) i en endelig koncentration på 1 mg /ml i DMEM . Cellerne blev yderligere inkuberet i 1 time ved 37 ° C og 5% CO

2. Derefter blev mediet omhyggeligt udsuget og 100 pi af DMSO (Sigma) blev tilsat til hver brønd for at afbryde celler. Absorbans blev aflæst ved 570 nm. Alle forsøgene blev udført tre gange in duplo. For reduktion af proliferation blev cellelevedygtighed repræsenteret sammenligne effekten af ​​anti-FGFR4 eller anti-GST (som kontrol) antistoffer eller specifikke inhibitorer i sammenligning med ubehandlede celler (100% af proliferation) inkuberet under samme betingelser [39].

konfokal mikroskopi

Celler blev fikseret med 1% paraformaldehyd og permeabiliseres med PBS-0,5% Triton X-100 før inkubation med FGFR4 specifikt antistof eller TRITC-phalloidin i 1 time ved 37 ° C . FGFR4 eller E-cadherin antistoffer blev påvist med AlexaFluor 488-mærket anti-kanin-IgG-antistof. Celler blev observeret med et konfokalt mikroskop (TCS-SP5-AOB’er-UV, Leica-Microsystems) efter nucleus modfarvning med DAPI. Billeder blev erhvervet med 63 × nedsænkning olie mål ved hjælp af Leica Konfokal Software. Viste billeder blev taget til fange på de samme afsnit i de forskellige prøver.

In vivo

tumorxenoplantater

Swiss nøgne mus (Charles River) blev anvendt til metastase og tumor xenografundersøgelser . Det Etiske Komité Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, Spanien) godkendt protokoller for forsøgsarbejde med mus.

For tumorxenoplantater, mus injiceret subkutant i højre flanke ved hjælp 1 × 10

7 SW48 stabilt-transficerede kolorektal cancer celler i 0,2 ml PBS i Matrigel fortyndet 1:03. Tumor størrelser blev kontrolleres mindst to gange om ugen, og hvert dyr blev aflivet ved hjælp af en CO

2 kammer i overensstemmelse med retningslinjerne for Menneskelige endpoints for Animal Anvendelse i biomedicinsk forskning.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser, medmindre andet er angivet, blev udført med Microsoft Excel. Data er præsenteret som median ± standardafvigelse. For vurdering af den statistiske signifikans sammenlignet mellem grupper alle

p

værdier blev afledt fra en to-halet statistisk test med 95% konfidensinterval.

s

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

FGFR4 mutationsstatus i kolorektal kræftcellelinjer og vævsprøver

Vi undersøgte FGFR4 mutationer. i kolorektale cancer cellelinjer og kræft prøver, der kunne bidrage til antistof anerkendelse overekspression eller aktivering. Total RNA blev isoleret og cDNA syntetiseres ved retrotransskription. cDNA blev anvendt som template til at bestemme tilstedeværelsen af ​​mutationer.

I alt vi fundet 3 SNP’er i FGFR4 cDNA i 4 colorektale cancercellelinier og 20 cancer prøver (tabel 1 og figur S1). Vi observerede tre mutationer i det ekstracellulære og transmembrane domæne af FGFR4 i patientprøver. Foruden velkarakteriserede Arg

388 SNP [9], [15], fandt vi V10L lokaliseret i signalpeptidet og P136L mellem immunglobulindomæner 1 og 2 (figur S1). Disse to SNP’er er tidligere blevet beskrevet uden korrelation til patologiske manifestationer [40], [41]. I KM12C og KM12SM kolorektal kræftceller, observerede vi tilstedeværelsen af ​​Arg

388 SNP, mens SW480 og SW48 ikke indeholdt denne SNP. I 20 kolorektal cancer prøver, 60% af patienterne præsenterede polymorfi Arg

388, mens forekomsten af ​​de to andre mutationer var 55% for P136L og 15% for V10L. Disse data er i overensstemmelse med tidligere publicerede data, hvor 50% af tumorer præsentere Arg

388 SNP, 53% af polymorfi P136L og 30% af tumorerne indeholder V10L [9].

Vi fandt ikke nogen aktiverende mutation i FGFR4 eller nukleotid ændring af tidligere rapporteret for FGFR4. Så disse data tyder på, at øget ekspression af FGFR4 kunne være ansvarlig for autoantistof induktion i CRC patienterne og højere invasion og metastase i tyktarmskræft.

FGFR4 Knockdown Reduceret friktion, Migration og invasion af tyk- og endetarmskræft Cells

for at studere rolle FGFR4 overekspression i tumorgenese og metastase, vi undersøgt effekten af ​​FGFR4 udtryk i SW48, SW480 og SW620 colorectal cancer cellelinjer, som ikke indeholdt Arg

388 polymorfi. SW480 og SW48 celler blev stabilt transficeret med fire shRNAs rettet FGFR4 plus en kontrol scrambled shRNA. SW620-celler blev transient tavshed med siRNA. shRNA # 41 viste den højeste reduktion i FGFR4-proteinekspression (figur 1A) og mRNA-niveauer (figur 1b) i begge celletyper. shRNA # 44 var også effektive til at reducere proteinekspression, især i SW48-celler. Lignende niveauer reduktion blev opnået med forbigående siRNA lyddæmpning i SW620 celler. For at undersøge effekten af ​​FGFR4 tavshed om andre familiemedlemmer, vi udført RT-PCR. mRNA-niveauer for FGFR1, FGFR2, og FGFR3 forblev uændret efter FGFR4- lyddæmpning, hvilket bekræfter specificitet for FGFR4 (fig. 1B). Immunofluorescens viste, at FGFR4 ekspression blev signifikant reduceret i SW480 og SW48 efter transfektion med shRNA 41 vektorer, selv om der blev observeret noget resterende farvning i kernen af ​​SW48-celler (figur S2).

Fire shRNAs rettet mod forskellige exoner FGFR4 og en kodet shRNA blev brugt til at opnå stabilt transficerede kolorektal cancer celler efter selektion med puromycin. Desuden blev transient siRNA FGFR4-nedregulering udført i SW620 colorektal cancerceller. A. Western blot-analyse af FGFR4 ekspression i stabilt transficerede SW480 og SW48 cellelinier og kortvarigt transficeret SW620-celler. Tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. B. Semi-kvantitativ PCR-analyse af FGFR1, FGFR2, FGFR3, og FGFR4 ekspression under anvendelse af specifikke primere i tre forskellige cellelinier. GAPDH blev anvendt som kontrol. C. Proliferation blev bestemt ved MTT-assays efter 24 timers kultur. Optisk densitet blev signifikant reduceret med FGFR4 knockdown (*, p 0,01, **, p 0,001). D. Krypterede og bragt til tavshed celler blev dyrket indtil konfluens og deres træk kapaciteter blev analyseret i en sårhelende assay hver 24 timer, indtil konfluens. Repræsentative billeder af sårhelende assay er vist. Migration hastighed (um /h), scrambled og FGFR4-tavshed celler blev beregnet som den afstand, i 96 timer. E. celleadhæsion til Matrigel af FGFR4-tavshed eller krypterede celler, efter at udsulte celler i 5 timer i medium alene. F. SW480 og SW48 scrambled celler viste ca. 2 gange højere invasion end shRNA # 41 FGFR4 stabilt-transficerede celler. Data for alle forsøgene repræsenterer middelværdien ± SD af 3 uafhængige forsøg.

s

værdier af alle forsøg er vist.

For at vurdere de tumorgene egenskaber, vi bestemt cellevækst, vedhæftning, migration og invasion af FGFR4-tavshed celler. Brug af MTT-assays, FGFR4-lyddæmpet SW480 eller SW48-celler viste en reduceret proliferationshastighed sammenlignet med scrambled celler (figur 1C). For at undersøge virkningen af ​​FGFR4 om migration, FGFR4-tavshed SW480 og SW48 cellelinier blev podet i 24-brønds plader og analyseret ved sårhelende assays. FGFR4-lyddæmpet celler var ude af stand til at lukke såret selv efter 96 h (figur 1D). Den retarderede migration var vigtigere for SW48 (3 gange) end SW480-celler (2 gange). Disse resultater svarer til dem rapporteret tidligere anvendelse af to forskellige CRC cellelinier, HCT116 og HT29, og forskellige assays [15].

Desuden hjælp Matrigel assays, der var et betydeligt fald i adhæsion og invasion kapacitet af FGFR4-lyddæmpet celler i begge cellelinier. SW480 celler faldt deres vedhæftning kapacitet i 2,5 gange, mens SW48 celler viste næsten 4 gange reduktion i forhold til scrambled celler (Figur 1E). Invasion blev ca. 2 gange reduceret med FGFR4 knockdown i begge cellelinier (figur 1F). Tilsammen understøtter disse data en vigtig rolle FGFR4 i tumorigenese og invasion af kolorektal cancer, som er mere relevant for metastatiske SW48 celler.

FGFR4 Silencing Reduceret Angivelse af induktorer af Mesenchymale Fænotype

Siden celleadhæsion, migrering og invasive kapacitet af epitelceller er forbundet til epitel-mesenkymale overgang (EMT), besluttede vi at undersøge ændringer i EMT-inducere. Efter FGFR4 lyddæmpning, vi studerede ændringer i mRNA ekspressionsniveauer af Snail1 (SNA1), TWIST1, ZEB1, og E-Cadherin (CDH1) ved real-time PCR eller semi-kvantitativ PCR (TGFp1). I SW480 og SW620, FGFR4 knockdown forårsagede et signifikant fald i EMT inducere TGFp1, SNA1 og vride ledsaget af en stor stigning i epitel markør CDH1 (figur 2A, B). SW48 celler udviste en større reduktion i SNA1, TGFp1 og TWIST1and en mindre stigning i CDH1. ZEB1 Faldet var større i SW480 end i de metastatiske cellelinier SW620 og SW48. Epitel- og mesenchymal markører blev analyseret på proteinniveauet ved western blot. Sneglen og E-cadherin bekræftede mRNA resultater. Vimentin, en mesenchymal markør, blev reduceret efter FGFR4 lyddæmpning i de tre cellelinier (Figur 2C). Kun blev påvist mindre ændringer i MT1-MMP-ekspression i SW480 og SW48 celler efter FGFR4-lyddæmpning. Imidlertid observerede vi en stor stigning af MT1-MMP-ekspression i SW620-celler, som er parallel ekspressionsniveauerne af E-cadherin indikerer en reduktion af mesenkymale fænotype.

A. cDNA syntetiseret fra total RNA fra stabilt og kortvarigt bragt til tavshed og kontrol celler blev udsat for QRT-PCR ved hjælp af specifikke primere for EMT induktorer SNAI1, TWIST1, ZEB1 og CDH1, hjælp GAPDH for normalisering. Data repræsenterer medianen ± SD af to eksperimenter. B. Samme cDNA blev underkastet semi-kvantitativ RT-PCR-analyse for at amplificere TGFp1 anvendelse GAPDH som kontrol. C. SW480 og SW48 krypteret og FGFR4-lyddæmpet Cellerne blev lyseret og underkastet WB-analyse under anvendelse af specifikke antistoffer mod de angivne proteiner og EMT markører. Den overflod af hvert protein blev kvantificeret ved densitometri. Tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. D. Immunofluorescensanalyse af E-cadherin i scrambled og bragt til tavshed SW480 og SW48-celler. DAPI blev anvendt til kontrastfarvning af kernen i blåt. E-Cadherin farvning var i grønt.

Stigningen i E-cadherin udtryk, efter FGFR4 knockdown i adherensovergange og celle-celle kontakter blev bekræftet ved immunfluorescens (figur 2D). Forskellene i e-cadherin ekspression var mere tydelig i cellemembranen, hvilket antyder, at FGFR4 lyddæmpning lettet ekspressionen af ​​funktionelt E-cadherin på celleoverfladen og tilbagevenden til en epitelial fænotype. Kollektivt, disse data ved hjælp af tre forskellige kolorektale cancer cellelinjer bekræfter, at FGFR4 er en vigtig effektor i EMT. FGFR4 knock-down provokerer en reduktion i Sneglen og en stigning i E-cadherin med den deraf følgende effekt på vedhæftning, migration og invasion.

signalering Analyse i FGFR4-tavshed celler. Rolle FGFR4 i Cell Survival

For at bestemme virkningen af ​​FGFR4 aktivitet på nedstrøms signalering, analyserede vi effekten af ​​FGFR4-dæmpning på signalveje efter aktivering med FGF19 ± heparin sammenlignet med serum-frit medium. Efter FGFR4 knockdown, aktivering af phosphoSRC, phosphoERK1 /2 og phosphoAKT var signifikant lavere i SW480 og SW48 (figur 3A). ERK1 især viste en næsten fuldstændig reduktion. Med hensyn til AKT, denne effekt antyder en effekt medieret af FGFR4 gennem AKT på EMT og celleoverlevelse. For at teste virkningen af ​​FGFR4 på overlevelse blev celler udsat for apoptose induceret af hydrogenperoxid. FGFR4-lyddæmpet celler viste et signifikant fald på 20-30% i overlevelse sammenlignet med scrambled celler efter hydrogenperoxidbehandling (figur 3B). Uden behandling, krypteret og FGFR4-tavshed SW480 og SW48 kolorektal cancer celler viste tilsvarende niveauer af apoptose. Denne FGFR4 effekt på celle apoptose som reaktion på oxidativ stress kan spille en rolle i fremskreden kolorektal cancer, lette overlevelse metastatiske kolorektal cancer celler.

A. Scrambled og FGFR4-lyddæmpet SW480 og SW48-celler blev udsultet og inkuberet med FGF19, heparin, eller FGF19 plus heparin i 30 minutter i DMEM. Derefter blev celler lyseret og underkastet WB-analyse under anvendelse af specifikke antistoffer mod phosphoryleret og total AKT, ERK1 /2 og SRC. Tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. B. Celler blev inkuberet i DMEM suppleret med 10% FBS og antibiotika i nærværelse eller fravær af H

2O

2 i 16 timer og underkastet apoptose påvisningsassays. UNT., Ubehandlede celler. Data viste resultaterne for et repræsentativt eksperiment ud af tre. C. Invasion tværs Matrigel scrambled og bragt til tavshed celler behandlet med inhibitorer til MEK1 /2 (UO126), JNK, og SRC (PP2) som angivet. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD af 3 uafhængige forsøg.

For at studere en synergistisk effekt at øge FGFR4 hæmning på signalveje i celle invasion, vi anvendes specifikke inhibitorer på målrettede og scrambled celler. UO126 (a MEK1 /2-inhibitor opstrøms for ERK1 /2) og PP2 (SRC inhibitor) reducerede invasionen kapacitet SW480 og SW48-celler. Denne reduktion var meget mere udtalt i scrambled end i lyddæmpede celler (figur 3C). JNK inhibitor forårsagede kun en mindre effekt på invasionen kapacitet krypterede og tavshed SW480 og SW48 celler. Tilsammen indikerer disse resultater, at FGFR4-knockdown forårsagede en signifikant reduktion af SRC og MEK1 /2-ERK1 /2-medieret invasion i SW480 og SW48-celler, svarende til den forårsaget af specifikke inhibitorer om kodede celler.

FGFR4 som terapeutisk mål i kolorektal cancer

Vi fulgte to forskellige strategier til at bevise den terapeutiske værdi af FGFR4 i kolorektal cancer. Først testede vi to kinase hæmmere PD173074 og TKI-258. Derefter anvendte vi FGFR4-lyddæmpet celler for at studere afhængigheden af ​​FGFR4 for tumorvækst i mus xenotransplantater. Metastatiske cellelinier (SW48 og KM12SM), som udtrykker mere FGFR4, var mere følsomme over for kemiske inhibitorer end dårligt eller ikke-metastatiske cellelinier (KM12C, SW480) (figur 4A). Multi-kinaseinhibitor TKI var mere effektivt end pan-FGFR inhibitor PD at reducere kolorektal cancer proliferation på en dosisafhængig måde (

s Drømmeholdet værdi 0,001), især i metastatiske cellelinier. Ved 80 nM koncentration, hæmning var højere i metastatisk kolorektal cancer cellelinjer (20% i SW48 og 60% i KM12SM) end i ikke-metastatiske celler eller kontrol celler. I KM12 celler, TKI hæmning var effektiv op til 1 nM koncentration. Henvisning cellelinie HEK293, som udtrykker lave niveauer af FGFR4, blev inhiberet ved en lavere grad. Inhibering af cellevækst blev associeret med inhibering af samme downstream regulatorer ramt af FGFR4-signalveje (figur 4B). De væsentligste effekter blev opnået med TKI-258. Vi observerede et stort reduktion ( 90%) i SRC-aktivering, et signifikant fald (50-80%) i phosphoERK1 /2 og en svag reduktion i phosphoAKT i begge cellelinier (figur 4B). Faldet i aktiveringen af ​​FGFR4-signalveje var den samme som observeret efter FGFR4-lyddæmpning, der bekræfter konsekvenserne af FGFR4. For at bekræfte FGFR4 specificitet, vi brugte kommercielle anti-FGFR4 antistoffer på SW480 og SW48 kolorektal kræftceller. Vi observerede en signifikant inhibering af proliferationen, dosisafhængig i sammenligning med kontrolceller (

s Drømmeholdet værdi 0,01) (Figur S3).