PLoS ONE: Forbedring Kemoterapi Reaktion med Bmi-1 Silencing i kræft i æggestokkene

Abstrakte

kræft Utvivlsomt æggestokkene er en irriterende, uhelbredelig sygdom for patienter med tilbagevendende kræft og terapeutiske muligheder er begrænsede. Selvom Polycomb gruppen genet,

Bmi-1 Hoteller, som regulerer selv-fornyelse af normale stamceller og stamceller har været impliceret i patogenesen af ​​mange menneskelige maligniteter, men en rolle for Bmi-1 påvirke kemoterapi reaktion har ikke er blevet behandlet før. Her demonstrerer vi, at lukke munden Bmi-1 reducerer intracellulære GSH-niveauer og derved sensibiliserer kemoterapi ovariecancerceller til kemoterapeutika såsom cisplatin. Ved at forstærke ROS produktion som respons på cisplatin, BMI-1 nedregulering aktiverer DNA beskadigelse respons pathway, caspaser og spalter PARP medfører induktion apoptose i ovariecancerceller. I en

in vivo

ortotopisk musemodel af kemoterapi ovariecancer, knockdown af Bmi-1 ved nanoliposomal levering hæmmer tumorvækst betydeligt. Mens cisplatin monoterapi var inaktiv, kombination af Bmi-1 lyddæmpning sammen med cisplatin næsten helt ophævet æggestokkene tumor vækst. Kollektivt disse fund etablere Bmi-1 som et vigtigt nyt mål for terapi i kemoterapi æggestokkræft

Henvisning:. Wang E, Bhattacharyya S, Szabolcs A, Rodriguez-Aguayo C, Jennings NB, Lopez-Berestein G, et al. (2011) Styrkelse kemoterapi Reaktion med Bmi-1 Silencing i kræft i æggestokkene. PLoS ONE 6 (3): e17918. doi: 10,1371 /journal.pone.0017918

Redaktør: Sujit Basu, Ohio State University, USA

Modtaget: Januar 21, 2011; Accepteret: 15 februar 2011; Udgivet: 21 Mar 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Marsha Rivkin Pilot Award (RB), CA136494, CA135011 (PM) og P50 CA083639, U54 CA151668 (AS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene har den højeste dødelighed blandt alle gynækologiske maligniteter [1]. Trods første reaktion på kirurgisk debulking og front-line platin /taxan kemoterapi, de fleste tumorer i sidste ende udvikle en resistent tilbagefald drug [2], [3]. Undersøgelser viser, at cisplatin modstand kan være resultatet af en defekt apoptotisk program. I dette tilfælde ville øgede DNA-skader være forpligtet til at fremkalde det signal initierende apoptose [4], [5].

Bmi-1

, en Polycomb gruppe gen, regulerer proliferative aktivitet af normale stamceller og progenitorceller [6]. Det er også en forudsætning for selvstændige fornyelse af neurale [7], [8] og hæmatopoietiske stamceller [9]. Bmi-1 ofte opreguleres i en række forskellige cancere, herunder ovariecancer og dens korrelation med klinisk kvalitet /fase, lymfeknudemetastase og dårlig prognose er blevet rapporteret [10], [11], [12], [13], [14 ], [15], [16], [17], [18], [19].

Bmi-1

forårsager neoplastisk transformation af lymfocytter og samarbejder med H-Ras giver anledning til metastatisk brystkræft i mus [20], [21], [22], alle stærkt antyder en onkogen rolle i epitelial maligniteter. Desuden isolerede cancer stamceller æggestokkene udviser meget højere BMI-1-niveauer sammenlignet med de differentierede eller parentale bulk-tumorceller og har forøget resistens over for cisplatin og paclitaxel sammenlignet med tumorcellerne [23]. Også den forøgede ekspression af Bmi-1 var en af ​​de vigtigste regulatoriske faktorer, der bestemmer en cellulær fænotype fanget af ekspression af et dødsfald-fra-cancer signatur i et bredt spektrum af terapi-resistent klinisk letale maligniteter [24]. På trods af dette væld af oplysninger en mulig rolle for Bmi-1 påvirke kemoterapi svar ikke er blevet behandlet før. I denne sammenhæng vil bestemme den mekanisme, hvormed Bmi-1 lyddæmpning sensibiliserer kræftcellerne til cisplatin være vigtigt for udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier til bekæmpelse af kræft i æggestokkene.

De mest aktive kemoterapeutiske stoffer i kræft i æggestokkene er platin analoger, cisplatin og carboplatin. Antitumoraktiviteten af ​​cisplatin (cis-diammindichlorplatin (II) blev opdaget af Rosenberg og kolleger i 1961 [25]. Cisplatin har været den mest aktive lægemiddel til behandling af ovariecancer i de sidste 4 årtier og prognosen for kvinder med ovariecancer kan defineres ved tumoren respons på cisplatin [26]. Selv om de fleste patienter med ovariecancer svare front-line platin kombinationskemoterapi størstedelen vil udvikle sygdom, der bliver resistent over for cisplatin og vil i sidste ende bukke under for sygdommen [26]. således metoder til forebyggelse eller overvinde modstand mod cisplatin kunne have en stor indvirkning i kampen mod denne sygdom.

Her viser vi, at

Bmi-1

spiller en vigtig rolle i sensibilisering af kemoterapi kræft i æggestokkene celler til cisplatin. Vi viser også, at denne sensibilisering er gennem en hidtil ukendt pathway moduleret af Bmi-1, nemlig reaktive oxygenarter (ROS) induktion bevirker indgreb af DNA-skade respons (DDR), der fører til apoptose. Vi etablerer også Bmi-1 som et gyldigt terapeutisk mål

in vivo

ved hjælp af en let oversættes tilgang nanoliposomal levering af siRNA i en ortotopisk musemodel af kræft i æggestokkene.

Resultater

Knockdown fra BMI-1 øger cisplatin følsomhed in vitro

Vi har tidligere vist, at reduktion af Bmi-1 proteinniveauer i ovariecancerceller hjælp microRNA 15a /16 aftager klonal vækst og proliferation [27]. Her ønskede vi at teste, om knockdown af Bmi-1 påvirkede cisplatin medieret apoptose i æggestokkene cancerceller. Effektiv knockdown fra BMI-1 i A-2780 og CP-70-celler blev bekræftet ved sammenligning med de krypterede kontrol transficerede celler efter 48 timer (fig. 1). De siRNA transficerede celler blev behandlet med cisplatin i 48 timer og apoptose bestemt af Annexin /FITC-metoden. Apoptose i chemosensitive A-2780 kontrol siRNA transficerede celler var ~35 og 55%, når de behandles med 5 eller 10 uM cisplatin alene hhv. I modsætning hertil apoptose i kemoterapi CP-70 var ~17 og 40%, når behandlet med 10 eller 20 uM cisplatin alene, hvilket tyder på resistens af disse celler i retning cisplatin-induceret apoptose (fig. 1). Vigtigere behandling BMI-1 lyddæmpede celler med cisplatin konsekvent øget apoptose i både cellelinier med ~15-20% (fig. 1). For begge cellelinierne, det basale niveau af apoptose bestemmes uden nogen behandling var -10%. Apoptose forsøg med tre yderligere cellelinjer, såsom OVCAR-5, OV-202 og OV-167 gav tilsvarende resultater (data ikke vist). Disse data bekræftede, at knockdown af Bmi-1 kunne sensibilisere ovariecancerceller til cisplatin-induceret celledød.

Det øverste panel viser effektiv knockdown af Bmi-1 ved siRNA i æggestokkene cancer cellelinjer (SC = scrambled kontrol siRNA ) som bestemt ved Western blot. Bundpanelet viser procent apoptose som bestemt ved Annexin /FITC-PI-farvning. Ovariecancerceller transficeret med scrambled kontrol eller Bmi-1 siRNA blev behandlet med eller uden cisplatin i 48 timer. NAC forbehandling blev udført i 1 time før tilsætning af cisplatin eventuelt.

For nylig er det blevet rapporteret, at neuroner, thymocytter og knoglemarvsceller isoleret fra BMI-1 null mus har forøget ROS-niveauer end deres vildtype-modstykker [28], [29]. Desuden har undersøgelser rapporteret inddragelse af ROS generation i cisplatin-medieret apoptose [30], [31]. Derfor, for at bestemme, hvordan lyddæmpning af Bmi-1 sensibiliserer resistente ovariecancer celler til cisplatin-induceret apoptose, vi undersøgte mulig inddragelse af ROS. Derfor Bmi-1 eller krypteret-kontrol siRNA transficerede ovariecancerceller blev forbehandlet med N-acetylcystein (NAC) ved 1 mg /ml i 1 time efterfulgt af cisplatin behandling i 48 timer. Signifikant inhibering af cisplatin-medieret apoptose i både kontrol- og BMI-1 Knockdown celler blev observeret i nærvær af ROS scavenger NAC (fig. 1). Disse data indikerer, at augmented apoptose observeret i cisplatin behandlede Bmi-1 tavshed celler skyldtes inddragelsen af ​​ROS og førte os til at bestemme ROS produktionen som næste logiske skridt.

Knockdown af Bmi-1 øger cisplatin -medieret ROS produktion

Vi næste bestemt ROS produktion i scrambled kontrol eller Bmi-1 siRNA transficerede celler behandlet med eller uden cisplatin ved at måle fluorescens hjælp DCFDA. Cisplatin behandling alene signifikant forøget ROS-generering ved 10 uM i A-2780 celler, og ved 10 og 20 uM i CP-70-celler. I begge cellelinier, knockdown fra BMI-1 efterfulgt af enhver cisplatin behandling steg betydeligt ROS-generering (Fig. 2). Disse data bekræfter vores tidligere bemærkninger om apoptose og postulerer ROS som den primære årsag til forøget sensibilisering af kræft i æggestokkene celler til cisplatin. For at bestemme en årsag til forværret ROS-medieret apoptose observerede vi næste bestemmes total cellulær glutathion (GSH) niveauer.

Æggestokkræftceller transficeret med scrambled kontrol eller Bmi-1 siRNA blev behandlet med eller uden cisplatin i 24 h. Efterfølgende blev cellerne inkuberet med 5 uM carboxy-H2DCFDA i frisk HBSS i 30 min ved 37 ° C. Cellerne blev høstet med trypsin og fluorescens af de mærkede celler blev målt ved en excitationsbølgelængde på 485 nm og emissionsbølgelængde på 530 nm ved anvendelse Fluorolog 3 (Jobin-Yvon Horiba). Forholdet mellem gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) i forhold til den ubehandlede scrambled kontrol er repræsenteret.

Bmi-1 regulerer GSH produktion

Reduceret GSH er et afgørende element i cellens antioxidant netværk , er direkte involveret i opfangning ROS og i at opretholde thiol proteiner i deres reducerede tilstand [32], [33], [34]. Således at bestemme en årsag til den øgede ROS-medieret apoptose observeres i Bmi-1 lyddæmpede celler, vi næste bestemmes totale intracellulære GSH-indholdet. Lysater blev fremstillet ud fra scrambled kontrol eller Bmi-1 siRNA transficerede celler behandlet med eller uden cisplatin. Knockdown af Bmi-1 alene faldt betydeligt cellulære GSH niveauer (-30% i A-2780 og ~ 40% i CP-70), og dette blev yderligere reduceret, når det kombineres med cisplatin behandling (~45% i A-2780 og ~56% i CP-70) (fig. 3). Cisplatin-behandling alene havde dog ingen effekt på GSH-indholdet. Disse data antyder, at i det mindste nogle af oxidativt stress medierede virkninger observeret i BMI-1 knockdown ovariecancerceller skyldes nedsat intracellulære GSH-indholdet.

Toppanelet repræsenterer Totalt cellulært GSH måles (Materialer og metoder) i ovariecancerceller transficeret med scrambled kontrol eller Bmi-1 siRNA behandlet med eller uden cisplatin i 24 timer. Bundpanelet repræsenterer fold ændring i genekspression (normaliseret med beta actin og sammenlignet med scrambled kontrol) som bestemt ved kvantitativ RT-PCR af ovariecancerceller transficeret med scrambled kontrol eller Bmi-1 siRNA i 48 timer.

for yderligere at undersøge årsagen til reducerede GSH-indhold i Bmi-1 tavshed celler vi næste bestemt, om ekspressionsniveauerne af de centrale enzymer involveret i GSH biosyntese pathway blev ændret. Vi udførte kvantitativ RT-PCR til at bestemme genekspression niveau af glutamat-cystein ligase (GCLM) og glutathion-syntase (GSS), i BMI-1 siRNA transficerede æggestokkene cancercellelinier. Glutamat-cystein ligase (GCLM) er det første hastighedsbegrænsende enzym af glutathion biosyntesevejen [35]. I det andet trin, glutathion syntase (GSS), konverterer gamma-L-glutamyl-L-cystein til glutathion [35]. Mens mRNA-ekspression fra BMI-1 blev reduceret som forventet i Bmi-1 lyddæmpede celler, interessant mRNA ekspression af GCLM faldt betydeligt, mens den for GSS forøget (fig. 3). Tendensen var den samme i begge æggestokkene kræftceller. Disse resultater antyder, at forstyrrelse af GCLM, det hastighedsbegrænsende enzym er tilstrækkelig til at reducere de samlede cellulære GSH-niveauer og efterfølgende gange stigning i GSS mRNA-niveauer repræsenterer sandsynligvis en forsvarsmekanisme for cellerne forsøger at lindre oxidativ stress.

Bmi -1 modulerer DDR pathway

for yderligere at undersøge mekanismen for ROS medieret forøget apoptose af cisplatin i Bmi-1 tavshed ovariecancerceller vi ønskede at teste inddragelse af DNA-skader og reparation (DDR) vej. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at oxidativt stress kan udløse aktivering af DDR pathway [36]. For at teste dette bestemt vi phosphoryleringsniveauerne af Chk2 og H2AX to vigtige biomarkører for DNA-skader og aktivering af DDR-vejen [37]. Cisplatin behandling alene inducerede phosphorylering af Chk2 og H2AX i en koncentrationsafhængig måde og knockdown BMI-1 yderligere forværret denne effekt (fig. 4A). I bekræftelse, blev øget nuklear foci dannelse observeret af 53 BP1 immunoflourescence i CP-70 Bmi-1 Knockdown celler behandlet med cisplatin (fig. 4B). Disse resultater indikerer, at vedvarende niveauer af ROS genereret ved Bmi-1 knockdown kombineret med cisplatin behandling er tilstrækkelige til direkte beskadige DNA og engagere DDR-vejen. En stor mængde litteratur understøtter, at DNA-skader kan føre til apoptose via aktivering af caspaser [38], [39]. Derfor næste fortsatte vi at bestemme aktiveringen af ​​caspaser i Bmi-1 tavshed ovariecancerceller behandlet med eller uden cisplatin.

(A) Æggestokkræftceller transficeret med scrambled kontrol eller Bmi-1 siRNA blev behandlet med eller uden cisplatin i 48 timer. Western blot blev udført for phospho Chk-2, total Chk-2, phospho-H2AX, total H2AX og beta actin anvendelse af respektive antistoffer. (B) Scrambled kontrol eller Bmi-1 siRNA transficerede CP-70-celler blev udsat for konfokal mikroskopi under anvendelse 53BP1 antistof (rød) og DAPI (blå nuklear farvning) at påvise dannelsen nukleare foci.

BMI 1 regulerer effektorer af apoptose

Etablerede mediatorer af apoptose omfatter caspaser [40]. Derefter bestemte vi, kløvning af caspase 8 og caspase 9 i kontrol krypteret eller Bmi-1 siRNA transficerede celler behandlet med eller uden cisplatin. Cisplatin behandling alene forårsagede spaltning af caspase 8, men ikke caspase 9. Det er plausibelt, at med højere koncentrationer af cisplatin spaltning af caspase 9 kunne observeres. Vigtigere dog kombination af Bmi-1 knockdown og cisplatin behandling betydeligt og dosisafhængig øget kløvning af caspase 8 og caspase 9 i begge cellelinier (Fig. 5).

æggestokkene cancerceller transficeret med scrambled kontrol eller Bmi -1 siRNA blev behandlet med eller uden cisplatin i 48 timer. Western blot blev udført for caspase-8, caspase-9 og PARP anvendelse af respektive antistoffer.

PARP er et af de vigtigste spaltningsprodukter mål af aktiverede caspaser og spaltet PARP letter cellulær adskillelse og tjener som en markør for celler, som undergår apoptose [40]. BMI-1 Knockdown celler, blev klart spaltning af PARP observeret i en cisplatin dosisafhængig måde (fig. 5). Alle disse

in vitro

data indikerer, at cisplatin behandling af Bmi-1 Knockdown celler øger apoptose ved at øge ROS produktion, hvilket engagement i DDR vej og aktivering caspaser. Vi næste fortsatte med at bestemme den terapeutiske effekt af lyddæmpende Bmi-1 i en ortotopisk kemoterapi musemodel af kræft i æggestokkene.

Knockdown af Bmi-1 øger cisplatin følsomhed in vivo

Næste terapeutiske potentiale Bmi-1 blev testet ved

in vivo

levering fra BMI-1 siRNA hjælp DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin) nanoliposomes i ortotopisk CP-20 musemodel. Denne metode til levering er blevet grundigt karakteriseret tidligere for varighed af knockdown og har vist sig at mangle uspecifikke inflammatoriske reaktioner [41], [42]. For at simulere behandling af fremskreden små mængder sygdom blev behandlingen påbegyndt 1 uge efter tumorcelleinjektion. Musene blev delt op i følgende fire grupper (n = 10 mus per gruppe): (a) kontrollere siRNA-DOPC (150 ug /kg ip to gange om ugen), (b) kontrol siRNA-DOPC + cisplatin (160 ug /mus ip ugentligt), (c) Bmi-1 siRNA-DOPC (150 ug /kg ip to gange ugentligt), og (d) Bmi-1 siRNA-DOPC + cisplatin (doser samme som individuelle behandlinger). Alle dyrene blev aflivet efter 4 ugers behandling. Effektiv knockdown fra BMI-1 (-85%) blev først bekræftet ved RT-PCR (fig. 6A). Behandling med Bmi-1 siRNA alene, medførte signifikant (-60%) reduktion i tumorvægt sammenlignet med kontrolgruppen siRNA gruppen. Kombinationsbehandling med Bmi-1 siRNA og cisplatin resulterede i endnu større (-80%) reduktion i tumorvægt sammenlignet med cisplatin alene behandlede gruppe (fig. 6B). For yderligere at evaluere denne effekt, at antallet af tumorknuder dannet i hver gruppe blev bestemt. Igen kombinationsterapi viste størst effekt med -70% færre tumorknuder sammenlignet med cisplatin alene behandlede gruppe (fig. 6B). Ingen oplagt toksicitet blev bemærket i dyrene under terapi eksperimenter som vurderet af ændringer i adfærd, fodring vaner og mobilitet. Den gennemsnitlige kropsvægt var også ens mellem behandlingsgrupperne (data ikke vist).

For at vurdere virkningerne af siRNA-terapi på tumorvækst, behandling blev initieret en uge efter i.p. injektion (1,0 x 10

6 CP20) af tumorceller. Musene blev inddelt i fire grupper (n = 10 mus per gruppe): (a) kontrollere siRNA-DOPC (150 ug /kg ip to gange om ugen), (b) kontrol siRNA-DOPC + cisplatin (160 ug /mus ip ugentligt), (c) Bmi-1 siRNA-DOPC (150 ug /kg ip to gange ugentligt), og (d) Bmi-1 siRNA-DOPC + cisplatin (doser samme som individuelle behandlinger). Behandlingen blev fortsat, indtil 4 uger efter podning med tumoren før aflivning. (A) Samlet RNA blev isoleret fra en del af tumorvæv og underkastet RT-PCR under anvendelse af primere for Bmi-1 og beta actin. Den sammenlignende C

t metode blev anvendt til at beregne den relative forekomst af mRNA sammenlignet med virkningen af ​​beta actin ekspression. Eksperimentet blev udført tredobbelt og betydning bestemt under anvendelse af to-sidet Student t-test, P 0,05 blev betragtet som signifikant. (B) Mouse og tumor vægte og (C) antallet af tumorknuder for hver gruppe blev sammenlignet ved anvendelse af Students t-test (for sammenligning af to grupper). En to-tailed p ≤ 0,05 blev anset for statistisk signifikant.

Effekt af Bmi-1 knockdown på proliferation og apoptose in vivo

For at underbygge vores

in vitro

data vi næste undersøgt effekten af ​​Bmi-1 knockdown på

in vivo

tumorcelleproliferation og apoptose ved hjælp Ki67 og TUNEL farvning. Kombinationsbehandling med Bmi-1 siRNA og cisplatin viste den største effekt med -50% fald i proliferation sammenlignet med kontrolgruppen ubehandlede gruppe (fig. 7). Tilsvarende blev en stigning i apoptose ca. 80% observeret i kombinationsbehandling sammenlignet med kontrolgruppen behandlet gruppe (fig. 7). Derfor demonstrerer vi, at lyddæmpning af Bmi-1 i æggestokkene cancerceller, om

in vitro

eller

in vivo

øger apoptose som respons på cisplatin.

(A) immunhistokemisk farvning for Ki67 og (B) TUNEL blev udført for at vurdere celleproliferation og apoptose. Original forstørrelse 200X. Kvantificering vises grafisk til højre. Behandling arme blev sammenlignet ved anvendelse Students t-test og p ≤ 0,05 blev anset for statistisk signifikant.

Diskussion

kræft Utvivlsomt æggestokkene er en irriterende, uhelbredelig sygdom for patienter med tilbagevendende kræft og behandlingsmuligheder er begrænset [1], [43]. Her demonstrerer vi Bmi-1 gene silencing som en effektiv løsning, som i kombination med cisplatin forøger terapeutisk effektivitet yderligere. Desuden er vi afgrænse den mekanisme af øget følsomhed at være primært gennem ROS produktion. Frontline kemoterapi for ovariecancer involverer anvendelse af platin /taxan regime, som vides at inducere ROS-produktion. Vi postulere, at knockdown af Bmi-1 vil vise sig effektiv i kombinationsbehandling med dette regime. I denne sammenhæng en nylig rapport har vist Bmi-1 til at blive ansat tidligt til den dobbelt-strenget pause stedet ved ioniserende stråling skader [44]. Vores resultater bekræfter og udvide denne idé og demonstrere

in vitro

in vivo Hoteller, som Bmi-1 lyddæmpning synergistisk med øget oxidativt stress, der fører til ophobning af DNA-skader og apoptose.

mindst to tidligere udgivelser påviste øget ROS niveauer i neuroner, thymocytter og knoglemarvsceller isoleret fra Bmi-1 null mus [28], [29]. Men årsagen til denne ROS produktion er blevet varyingly tilskrevet p53 afhængige og uafhængige undertrykkelse af anti-oxidant-genekspression eller forringede mitokondrielle energetik [28], [29]. Vi viser her, at der ud over disse veje Bmi-1 styrer også cellulære GSH-indholdet ved at regulere transkription af de involverede i GSH biosyntesevejen enzymer. Navnlig transkription af GCLM er positivt reguleret af transkriptionsfaktorer, såsom NRF-1 og NFKB. I forbindelse med Bmi-1 knockdown, er begge disse transkriptionsfaktorer nedreguleret i neuroner og gliomceller henholdsvis [28], [45]. Derfor er det muligt at BMI-1 silencing fører til nedregulering af NRF-1 og eller NFKB i ovariecancerceller og derved reducere transkription af GCLM resulterer i reduceret GSH-syntese. Vigtigst her viser vi at BMI-1 ved regulering ROS og GSH-indholdet beskytter ovariecancerceller fra kemoterapeutiske fornærmelser.

DNA beskadigelse respons pathway kan aktiveres ved genotoksisk stress såsom dem forårsaget af kemoterapeutika og oxidativ DNA-beskadigelse . Faktisk aktivering af DDR kan føre til en pause i cellecyklusprogression, senescens eller apoptose. I overensstemmelse finder vi, at den dobbelte fornærmelse af oxidative skader forårsaget af Bmi-1 knockdown og cisplatin behandling, som er kendt for at forårsage dobbelte strengbrud i DNA sammen med ROS produktions- tips Tærsklen for ovariecancerceller mod apoptose ved at inducere phosphorylering af i ) Chk2 og H2AX, ii) der forårsager foci dannelse nukleare af 53BP1 og spaltning af apoptotiske markører såsom iii) caspaser og PARP.

som vi har demonstreret i vores

in vivo

eksperimenter, knockdown af Bmi-1 kunne være nyttige i kliniske omgivelser på grund af de følgende årsager; a) nedregulering af Bmi-1 øger cisplatin-induceret apoptose i ovariecancerceller. b) Bmi-1 kræves til selvfornyelse og vedligeholdelse af stamceller, herunder ovariecancer stamceller, som per definition er resistente over for kemoterapeutika [23]. c) Bmi-1 regulerer flere veje mest fremtrædende af disse er induktion af telomerase fører til immortalisering af mammaepitelceller [46]. d) Nedregulering fra BMI-1 fører til at de-repression af INK4a, som koder tumorsuppressorer p16Ink og p19Arf der regulerer senescens og apoptose [47]. Aktivering af disse veje er blevet påberåbt som en vigtig tumor suppressor barriere, fordi disse veje virker som potente inhibitorer af proliferation eller opformering af beskadigede celler. e) Desuden postulere vi, at cisplatin og Bmi-1 virker på lignende veje påvirker mitokondriefunktionen og /eller gennem øget ROS generation årsag DNA-skader, der fører til en effektiv induktion af apoptose. Øget DNA-skader og derefter forøge signalet initierende apoptose. Således Bmi-1 er et vigtigt nyt mål for terapi ikke kun i kemoresistent ovariecancer men også for andre maligne sygdomme karakteriseret ved overekspression af Bmi-1.

Materialer og metoder

Reagenser

Bmi-1-antistof var fra Zymed, CA, USA. Bmi-1 og krypterede kontrol siRNA var fra Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Phospho-H2AX, phospho-Chk-2, 53 BP1 spaltede caspase-8, caspase-9 og PARP-antistoffer var fra Cell Signaling Technologies Inc., MA. Annexin /FITC-PI apoptose kit var fra BioVision Inc.

Cell Culture

A-2780 og CP-70 celler blev dyrket i RPMI med 10% FBS og 1% antibiotikum (Penicillin /Streptomycin ) i henhold til udbyderen anbefaling. De CP-20 cellelinier blev dyrket i henhold til vores tidligere offentliggjorte procedurer [48].

SiRNA transfektion

æggestokkene celler A2780 eller CP-70 blev dyrket i deres respektive medium for en dag før transfektion. Under anvendelse oligofectamine cellerne blev transficeret med 25 nM scrambled kontrol eller Bmi-1 siRNA. Efter 48 timer blev cellerne behandlet til western blotting eller apoptoseassays [49].

Western Blot

Høstede ovariecancerceller, både behandlede og ikke-behandlede, blev vasket i PBS og lyseret i iskold radioimmunfældningsassays (RIPA) buffer med frisk tilsat 0,01% protease inhibitor cocktail (Sigma) og inkuberet på is i 30 minutter. Cellerester blev kasseret ved centrifugering ved 13000 rpm i 10 min ved 4 ° C, og supernatanten (30-50 ug protein) blev kørt på en SDS-PAGE [49].

ROS assay

<