PLoS ONE: Øget aktivitet af meprin-α, en Pro-migrerende og Pro-angiogen Protease, i kolorektal Cancer

Abstrakt

meprin-α er en metalloprotease overudtrykt i kræftceller, hvilket fører til akkumulering af dette protease i en delmængde af kolorektale tumorer. Virkningen af ​​øget meprin-a-niveauer på tumor progression er ikke kendt. Vi undersøgte effekten af ​​denne protease på celle migration og angiogenese

in vitro

og studerede udtryk for meprin-α mRNA, protein og proteolytisk aktivitet i primære tumorer på gradvis og i levermetastaser af patienter med kolorektal cancer, samt inhiberende aktivitet over meprin-α i sera fra cancerpatient sammenlignet med raske kontroller. Vi fandt, at hepatocytvækstfaktor (HGF) – induceret vandrende reaktion meprin-transficerede epitelceller blev øget i forhold til vildtype-celler i nærværelse af plasminogen, og at det angiogene respons i organ-dyrkede rotte aorta eksplantater var forøget i tilstedeværelse af exogent humant meprin-α. Hos patienter, blev meprin-α-mRNA udtrykt i colon adenomer, primære tumorer UICC (International Union Against Cancer) fase I, II, III og IV, samt i levermetastaser. I modsætning hertil tilsvarende protein akkumulerede kun i primære tumorer og levermetastaser, men ikke i adenomer. Imidlertid levermetastaser manglede meprin-α-aktivitet trods forøget ekspression af det tilsvarende protein, som korrelerede med ineffektiv zymogen-aktivering. Sera fra cancerpatienter udviste reduceret meprin-α inhibering sammenlignet med raske kontroller. Afslutningsvis er meprin-α-aktivitet reguleres forskelligt i primære tumorer og metastaser, hvilket fører til høj proteolytisk aktivitet i primære tumorer og lav aktivitet i levermetastaser. I kraft af sin pro-vandrende og pro-angiogene aktivitet, kan meprin-α fremme tumor progression i kolorektal cancer

Henvisning:. Lottaz D, Maurer CA, Noël A, Blacher S, Huguenin M, Nievergelt A, et al. (2011) Øget aktivitet af meprin-α, en Pro-migrerende og Pro-angiogen Protease, i kolorektal cancer. PLoS ONE 6 (11): e26450. doi: 10,1371 /journal.pone.0026450

Redaktør: Hang Thi Thu Nguyen, Emory University, USA

Modtaget: September 6, 2010; Accepteret: 27. september 2011; Udgivet: 11. november 2011

Copyright: © 2011 Lottaz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af den schweiziske National Foundation (www.snf.ch indrømme # 3100A0-100772 til EES), Berner Cancer League (www.bernischekrebsliga.ch, give DL) og Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de, DFG BE 4086 /1-1 til CB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

samordnede ekstracellulære proteolytiske begivenheder kan fremme tumorprogression ved at forstyrre fysiske barrierer såsom basalmembranen og ved at behandle ekstracellulære matrix, vækstfaktorer og cytokiner i tumoren stroma. Proteaser påvirker celleadhæsion og cellevækst samt individuelle og kollektive celle migration [1], [2]. De dybtgående virkninger af proteaser styres af reguleringen af ​​protease aktivitet på flere niveauer, herunder ekspressionsniveauerne, aktivering af zymogen former, hæmmer niveauer, og inaktivering.

Vi har tidligere identificeret meprin-α, en metzincin protease af astacin familie [3], som ny komponent af proteasen netværk i colorektal cancer [4]. Der er to homologe isoformer af meprin: meprin-α, kodes af

MEP1A

på kromosom 6, og meprin-β, der kodes af

MEP1B

på kromosom 18 [5]. Meprin-α og meprin-β co-udtrykkes i tyndtarmen, mens kun meprin-α udtrykkes i colon [6]. Meprin-β akkumuleres på den apikale celleoverflade på enterocytter i tyndtarmen, hvorimod meprin-α udskilles medmindre den fastholdes på celleoverfladen via ikke-kovalent association med meprin-β [6]. De enkelte polypeptidkæder er ikke stabile, begge isoformer dannelse proteinkomplekser af meprin-β-dimerer, meprin-a- og meprin-p tetramerer eller multimere komplekser af op til ti meprin-α-underenheder [7], [8]. Meprin-α udtrykkes i epitelceller i sund kolon mucosa samt i colorektal cancer [6]. Men i modsætning til normale intestinale epitelceller, som frigiver proteasen i tarmlumen, cancerceller secernerer proteasen på en ikke-polariseret mode,, hvilket fører til akkumulering og aktivering i tumorstroma [4]. Meprin-a spalter en række forskellige substrater

in vitro

[9], herunder ekstracellulære matrix komponenter af basalmembraner [9], [10], men nogle substrater er blevet beskrevet

in vivo

[ ,,,0],11], [12], [13], [14], [15]. Tre endogene meprin inhibitorer er beskrevet, mannose-bindende lectin (MBL) [16], fetuin-A og cystatin C [17].

meprin-α secerneres fra epitelceller som et zymogen [18].

In vitro

kan propeptidet fjernes under anvendelse af trypsin, hvilket gav det aktive enzym. Trypsin dermed kan aktivere meprin-α i tarmen lumen

in vivo

. Et alternativt aktiveringssystem er blevet identificeret i co-kulturer af colon carcinom cellelinie Caco-2 og intestinale fibroblaster. Fibroblast-afledte urokinase-plasminogenaktivator (uPA) omdanner plasminogen til plasmin, som igen genererer aktiv meprin-α [19]. I huden kallikrein-relaterede peptidase 5 kunne identificeres som en promeprin-α konverterende enzym [20].

Her er vi bevis for en pro-angiogene og pro-vandrende aktivitet meprin-α og undersøge udtrykket , aktivering og hæmning af denne protease i primære tumorer, levermetastaser og blodbanen i patienter med tarmkræft. Vores resultater viser et komplekst mønster af regulering, hvilket er i overensstemmelse med protease bliver impliceret i spredningen af ​​kræftceller fra primære sites.

Resultater

meprin-α fremmer celle migration og angiogenese

in vitro

virkningen af ​​meprin-α på cellemigrering blev undersøgt ved anvendelse af velkarakteriserede spredning respons af Madin-Darby hunde-nyreceller (MDCK) celler som reaktion på hepatocytvækstfaktor (HGF ) [21]. Svaret fra meprin-transficerede celler og forældrenes MDCK celler er optaget med time-lapse videomicroscopy og kvantificeret som tidligere beskrevet (Fig. 1A) [22]. Vi sammenlignede migration af parentale MDCK celler med MDCK-celler transficeret med enten meprin-α alene, meprin-β alene eller co-transficeret med både meprin-α og meprin-β. Ubehandlede forældre- og meprin-transficeret MDCK celler ikke migrere og vokse som celle klynge, der til sidst danner en celle monolag. En pro-vandrende respons blev induceret ved tilsætning af HGF. Meprin-transficerede og kontrol MDCK celler migreret på lignende i nærvær af HGF alene. Kun efter tilsætning plasminogen som en kilde til generering af plasmin, som igen aktiverer meprin-α [19], migration hastighed meprin-a /p co-transficerede celler var forøget med ca. 50% i forhold til vildtypeceller. Denne forskel blev afskaffet ved tilsætning af meprin inhibitor actinonin. Især opbinding af meprin-α til celleoverfladen gennem meprin-β er afgørende at forbedre denne pro-vandrende reaktion i nærvær af HGF og plasminogen, som MDCK-celler transficeret med enten meprin-α eller meprin-β alene migreret lighed med forældre- celler.

(A) Parental MDCK vildtypeceller (wt, åbne søjler) og MDCK-celler co-transficeret med meprin-α og meprin-β (αβ, venstre panel, fyldt sorte søjler) eller transficeret med enten meprin-α (α) eller meprin-β (β) alene (højre panel, fyldt grå søjler) blev dyrket på laminin 1-overtrukne skåle og eksponeret for HGF (20 nM) for at inducere migrationen i fravær eller nærvær af plasminogen som angivet. HGF-induceret migration blev sporet i 3-4 timer ved hjælp videomicroscopy. Vist er den gennemsnitlige migration hastighed (+/- SEM) af meprin-transficerede celler i forhold til identisk behandlede vildtypeceller. Resultaterne er gennemsnittet fra tre til fire uafhængige forsøg for hver betingelse. I nærværelse af plasminogen (100 nM), HGF-induceret migrering af meprin-a /p co-transficerede celler blev signifikant forbedret. Denne virkning blev tilbageført i nærvær af meprin inhibitoren actinonin (100 nM). Migrationen af ​​celler transficeret med enten meprin subunit’en alene var ikke forskellig fra vildtypeceller. (B) meprin-α fremmer angiogenese. Oprenset rekombinant humant aktivt meprin-α blev suppleret til dyrkningsmediet (0,7 ug /ml) i rotte aorta ring assay og udvækst af fartøjer i kollagengelen blev kvantificeret ved anvendelse af billedanalyse (se materialer og metoder). N

v: antal fartøjer, N

b: antal forgreninger, L

max: maksimal længde på skibe. * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet organkultur. Resultaterne er fra tre uafhængige forsøg med triplikater for hver betingelse.

Oprenset rekombinant aktivt humant meprin-α fremmet angiogen respons i rotte aorta ring assay [23] (fig. 1B). Computer-assisteret billedanalyse af rotte aorta eksplantater i 3-dimensional kollagengel kultur indikerede, at meprin-α forbedret udvæksten af ​​kapillærer sammenlignet med kontrolkulturer med hensyn til både længde (en stigning på 44%, p 0,05) og antallet af forgreninger (3-dobling, p 0,05)

meprin-α udtryk i kolorektal cancer ved progressive tumor stadier

Variable niveauer af en enkelt 3,5 kb meprin-α mRNA blev påvist i. patientprøver på alle stadier, herunder adenomer, som ikke korrelerer signifikant med tumor stadier (fig. 2A, B). Alternativ splejsning af meprin-β i cancer er tidligere blevet beskrevet [24]. Ingen beviser for en alternativt splejset mRNA isoformen af ​​meprin-α blev fundet i tumorer. På immunblots meprin-α protein var kun svagt påviselig eller fraværende i adenomer, mens en delmængde af prøver kræft, herunder primære tumor stadier I-IV og levermetastaser, indeholdt store mængder af meprin-α protein (fig. 2C). Oprensede børste grænserne membraner fra human tyndtarm, som indeholder både meprin-α og meprin-β, blev analyseret som en positiv kontrol. Som tidligere beskrevet [4], de molekylære arter af meprin-α i tumorer var 10 til 25 kDa mindre end den fremherskende 100-kDa protein fra børstesøms membraner. Immunfarvning for meprin-α i primære tumorer og levermetastaser afslørede klynger af kræftceller med kraftige signaler støder op til negative cancerceller (fig. 3). Alle adenomer men man scorede den mindste værdi 1 (fig 4A.), Mens primære tumorer og levermetastaser scorede højere (p 0,025 for primære tumorer stadier I-IV i forhold til levermetastaser og adenomer).

(A ) repræsentant Northern blot for meprin-α på total RNA (12 ug) udvundet af tumor prøver af patienter med forskellige tumor stadier (A adenom, primære tumorer iscenesætter UICC i til UICC IV, M levermetastaser). Normal kontrol-RNA fra sunde colon mucosa er også vist (bane C). blev påvist varierende niveauer af en enkelt 3,5 kb mRNA arter. Mængden af ​​belastede RNA blev vurderet ved Fornyet probing blottet for 7S RNA. (B) Kvantificering af meprin-α-mRNA-niveauer i forhold til 7S RNA. Box plot repræsentation af densitometriske værdier opnået fra Northern blot. Box omfatter laveste kvartil, median og øvre kvartil, whiskers indikerer 5-95 percentil interval (N = 12 i hver gruppe). Ingen signifikante forskelle mellem forskellige grupper. (C) Repræsentant Western blot for meprin-α på protein ekstrakter fra tumor prøver (40 pg). Som kontrol blev oprenset humant børste grænserne membraner fra tyndtarmen (20 ug) analyseres også (BBM), hvor meprin-α er forbundet med transmembrane meprin-β i heterodimere proteinkomplekser. Meprin-α blev påvist i en undergruppe af tumorerne. For at afsløre svage signaler blev membranen overeksponeret i forhold til tumorprøver der udviste stærk ekspression.

Immunfarvning for meprin-α på vævssnit fra formalinfikserede og paraffinindlejrede colorektale vævsprøver ved hjælp en kanin polyklonalt primært antistof sammen med et peroxidase-koblet sekundært antistof og diaminobenzidin som kromogent substrat. Tæller plet: hæmatoxylin. Målsætning forstørrelse: 40 ×. Bar = 50 um. (A) I normal colon mucosa meprin-α er knapt påviselig. Lejlighedsvis blev signalerne detekteret ved foden af ​​crypt regioner i cytosolen af ​​celler med apikalt lokaliserede kerner (asterisker). Specificiteten af ​​disse signaler og identiteten af ​​cellerne blev ikke undersøgt yderligere. (B) Repræsentant prøve af en meprin-α positive primær tumor fase III. Tumorer udviser en mosaik ekspressionsmønster. I cancer celleklynger celler med stærke signaler for meprin-α (pile) blandet med celler, der viser et svagt signal eller intet signal overhovedet. Celler i stroma udtrykker ikke meprin-α (C) repræsentativt udsnit af meprin-α positive primær tumor stadie IV viser klynger af meprin-a-positive cancerceller (pile). (D) Kræftceller udtrykker meprin-α (pile) i levermetastaser (Met). Det omgivende normale levervæv (Hep) er kun svagt plettet.

(A) Semi-kvantitativ vurdering af meprin-α udtryk i kolorektale karcinomer ved hjælp af en immunhistokemisk score (minimum score 1, maksimal score 16) . + = Medianværdier. (B) Øget proteolytiske aktivitet meprin-α i primære tumorer stadier I-IV i forhold til adenomer og metastaser. Proteolytiske aktivitet af meprin-α blev målt ved anvendelse af kunstigt substrat N-benzoyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesyre (PABA-peptid). Grænseværdien på 2,5 pmol /h /g protein svarer til to standardafvigelser over middelværdien i adenom-gruppen. En stigning af proteolytiske aktiviteter over tærsklen blev fundet i 36%, 40%, 44% og 33% af den primære tumor prøver på trin UICC I, II, III og IV, henholdsvis, men ikke i levermetastaser. blev udført Statistisk analyse mellem primære tumorer trin I til UICC IV som én gruppe og adenomer, eller metastaser (ensidet Wilcoxon rang sum test af uafhængige prøver). + = Medianværdier.

meprin-α-aktivitet, zymogen aktivering og hæmning

meprin-α-aktivitet blev specifikt målt i proteinekstrakter fra vævsprøver i tilstedeværelse af en bred vifte proteaseinhibitor er målrettet mod alle protease klasser undtagen metalloproteaser. Meprin-α-aktivitet var lav i adenomer, mens signifikant forøget aktivitet blev målt i en delmængde (33 til 44%) af primære tumorer i trin I til IV (Fig 4B, s. 0,01 for trin I til IV i forhold til adenomer). I levermetastaser, uventet, meprin-a aktivitetsniveau var så lav som i adenomer, trods betydelig ekspression af proteinet (p 0,01 sammenlignet med primære tumorer stadier I-IV)

Den tilsyneladende uoverensstemmelse mellem lav. aktivitetsniveauer og høje meprin-α proteinniveauer i levermetastaser (fig. 2C og 3) kan skyldes manglende meprin-α zymogen-aktivering, eller en inhibitor specifikt stede i levermetastaser. At bestemme omfanget af zymogen-aktivering i tumorprøver vi først immunopræcipiteret zymogen og aktive former af meprin-α og målte aktivitet direkte på perlerne. Denne værdi, der repræsenterede den endogent aktiveret protease pool, blev sammenlignet med aktiviteten i immunopræcipitater efter maksimal zymogen aktivering af begrænset trypsinbehandling [18]. Den aktiverede form af meprin-α dominerede i alle prøver. Imidlertid endogen aktivering af meprin-α var signifikant højere i primære tumorer end levermetastaser (fig. 5A). I primære tumorer I-IV, blev så meget som 20% af den samlede meprin-α aktiveret endogent, og alle, men en prøve viste endogen aktivering over 5%. Omvendt endogen aktivering var under 5% i alle undtagen to prøver fra levermetastaser. Som konklusion kan øget zymogen-aktivering bidrager til den øgede meprin-α aktivitet ved primære tumor-sites sammenlignet med metastatiske steder i leveren.

meprin-α blev immunopræcipiteret fra tumorprøver, delt i to portioner for at udlede endogene og total aktivitet, som beskrevet i Materialer og Metoder. (A) Ratio af endogent meprin-α-aktivitet versus total aktivitet i primære tumorer (P, N = 7) og levermetastaser (M, N = 10). Zymogen aktivering væsentligt forbedret i primære tumorer i forhold til levermetastaser. (B) Serumprøver fra kolorektal kræftpatienter udviser lavere hæmmende aktiviteter mod meprin-α. Proteolytiske aktivitet af oprenset humant rekombinant meprin-α (800 ng /ml) blev analyseret i nærvær af 20% humant serum. Aktiviteter er angivet i forhold til reference assay med 20% i phosphatbufret saltvand, pH 7,3 (= 1). N: Normale raske kontrolpersoner (N = 19), NC: Ikke-kræftpatienter gruppe, som omfatter prøver fra 22 inviduals med inflammatoriske lidelser i tarmen, CRCI-III: kolorektale kræftpatienter (N = 15) trin I-III. CRCIV: kolorektale kræftpatienter (N = 9) trin IV. Markant reduceret hæmning af meprin-α i serum fra patienter med tarmkræft.

Reduceret hæmning af meprin-α i sera fra kolorektal cancer patienter

Cirkulerende kræftceller kan støde faktorer i blodet at modulere meprin-α-aktivitet. Faktisk en aktivitet assay af rekombinant meprin-α i nærvær af 20% humane sera fra raske kontroller, og en gruppe af patienter med intestinale inflammatoriske lidelser angivet inhibering med 35% (interval 5-50%) og 22% (interval 0-59 %), henholdsvis. I modsætning hertil sera fra patienter med tyktarmskræft (trin I-IV) inhiberede meprin-α på et betydeligt mindre omfang (12% i gennemsnit, 0-37%, p = 2,8 * 10

-6 sammenlignet med raske kontroller, p = 0,013 sammenlignet med patienter med inflammatoriske lidelser) (fig. 5B). Sera fra patienter med trin I-III viser en nedsat inhiberende kapacitet i forhold til normale patienter, der ikke var signifikant forskellig fra patienter på stadium IV. Hæmning i serum var uafhængig af MBL, som MBL serumkoncentrationer ikke signifikant forskellig mellem studiegrupper og også korrelerede ikke med meprin-α hæmning (ikke vist). Desuden har rekombinant MBL ikke inhibere human, mus og rotte meprin i N-benzoyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesyre (PABA-peptid) assay (tabel S1).

Sammenfattende er der er en dynamisk og kompleks regulering mønster for aktiviteten af ​​meprin-α i colorektal cancer. Øget aktivering zymogen kan bidrage til højere proteolytisk aktivitet i primære tumorer stadier I-IV, og den hæmmende aktivitet over meprin-α reduceres i blodet i patienter med tarmkræft.

Diskussion

Denne undersøgelse indebærer, at meprin-α er aktiv i overgangen fra godartet vækst (adenomer) til maligne primære tumorer. Paba-peptid aktivitet i kræftvæv er specifik for meprin i vores assay, som vi sørgede for at undertrykke enhver uspecifik aktivitet ved at supplere analysen med en bred vifte proteasehæmmer cocktail. Især chymotrypsinlignende proteaser, som er de eneste kendte enzymer i stand til at spalte PABA-peptid bortset fra meprin [25], hæmmes under disse betingelser. Meprin-α-proteinet og aktivitet steg i sidstnævnte gruppe, selv om der ikke var nogen signifikant forskel af tilsvarende mRNA-niveauer mellem forskellige grupper. Adenomer per definition er karakteriseret ved en forøget væksthastighed af celler med normal differentiering og cellepolarisering [26]. Derfor kan beslægtet med den normale colon mucosa, meprin-α secerneres og efterfølgende tabt i tarmlumen, mens proteasen tilbageholdes i tumorvævet i colorektal cancer skyldes afvigende upolariseret sekretion, en mekanisme beskrevet af os tidligere [ ,,,0],4]. Desuden er der tegn for en posttranskriptionel regulering af meprin-α fra en tidligere undersøgelse, som meprin-α mRNA blev påvises ved

in situ

hybridisering i både krypt og villus regioner, mens proteinet som påvist ved immunfarvning var kun til stede i villus enterocytter [6].

i kolorektal cancer, indeholdt primære tumorer øget meprin-α-aktivitet og ofte næret en subpopulation af cancerceller med stærk meprin-α proteinekspression, især ved UICC iscenesætter III og IV, dvs. efter progression til metastase til lymfeknuder og fjerne steder (fig. 2 og 3). Formidlingen af ​​kræftceller korrelerer således med øget meprin-α protein og aktivitet. Bemærk dog, at korrelationen mellem immunoblot signaler, immunfarvning scoringer og meprin-α-aktivitetsniveauer i de grupper af primære tumorer er ikke stramt. Den immunfarvning score anser hyppigheden og intensiteten af ​​meprin-a-signaler blandt kræftceller kun inden for et lokalt begrænset område af prøven, mens immunoblot signal er et gennemsnit af hele prøven herunder udskilles meprin-α akkumulere i tumoren stroma [4] . Den meprin-α aktivitetsniveau er yderligere påvirket af zymogen-aktivering og tilstedeværelsen af ​​inhibitorer.

Sera fra patienter med colorectal cancer viste signifikant lavere inhiberende aktivitet over meprin-α end raske kontrolpersoner og patienter med intestinale inflammatoriske sygdomme, hvilket indikerer at emigration af cirkulerende meprin-α udtrykker kræftceller ud af blodkar kan lettes. Den inhiberende aktivitet i serum ikke skyldtes mannose-bindende lectin, en endogen meprin inhibitor tidligere rapporteret [16], og dermed bidrager med en eller flere yderligere inhibitor (er). I en nylig rapport, har fetuin-A og cystatin C blevet rapporteret som sådanne endogene meprin inhibitorer [17]. Faktisk ved anvendelse af rekombinant humant MBL, fandt vi ingen hæmning af meprin (tabel S1). Dette fund er i modsætning til rapporten fra Hirano et al. [16]. Men vores data er i overensstemmelse med den manglende sammenhæng mellem hæmning af patient sera og MBL koncentration. For det andet, som Hirano et al. brugte MBL oprenset fra humant serum i deres meprin inhiberingsassays, vi spekulere, at uoverensstemmelsen mellem vores og deres data skyldes kontaminerende faktorer fra humant serum, såsom fetuin-A og /eller Cystatin C.

Der er en dynamisk og kompleks regulering mønster af aktiviteten af ​​meprin-α i colorektal cancer. Øget aktivering zymogen bidrager til højere proteolytisk aktivitet i primære tumorer stadier I-IV (fig. 5A), og den hæmmende aktivitet over meprin-α reduceres i blodet i kolorektale kræftpatienter (fig. 5B). Den ineffektive aktivering i levermetastaser er i overensstemmelse med den tidligere observation, at det uPA-systemet, en meprin-α aktivator, er inaktivt i levermetastaser, på grund af manglen på uPA-aktivering og overekspression af plasminogenaktivator-inhibitor [27] , [28]. Selv om mange matrix (MMP’er) er kendt for at blive forøget i invasive primære tumorer i kolorektal cancer [29], er der kun få analyser, der omfatter levermetastaser. I en sådan undersøgelse blev MMP-9 viste sig at blive forøget i primære tumorer, men ikke levermetastaser [30]. Denne undersøgelse og vores data peger på betydelige forskelle mellem protease netværk i primære tumorer og levermetastaser, som er relevant for terapeutiske metoder, der anvender proteasehæmmere.

Vi studerede celle migration i MDCK celler, der udtrykker meprin-α ved celleoverfladen bundet i heterodimere proteinkomplekser med transmembran meprin-β [31]. Meprin-udtrykkende celler migrerede signifikant hurtigere på laminin-1 overtrukne skåle i nærvær af plasminogen og HGF. Meprin-α kan blive aktiveret på celleoverfladen med plasmin, dannet fra plasminogen gennem aktiviteten af ​​urokinase-plasminogenaktivator (uPA) bundet til dets receptor (u-PAR), som begge er kendt for at være opreguleret af HGF i MDCK-celler [32]. Dette system sandsynligvis bidrager også til aktivering af meprin-α i tumorer

in vivo

, som u-PA og u-PAR er opreguleret i kolorektal cancer [33], [34], [35] , [36]. I vores migration assay, pro-vandrende virkning er faktisk skyldes meprin-α, som plasmin aktiverer meprin-α, men ikke meprin-β [7], og fordi actinonin, der vender pro-vandrende effekt, hæmmer meprin-α med ca. 100 gange højere styrke (K

i 2 * 10

-8 M) end meprin-β (K

i 2 * 10

-6 M) [10].

Både laminin-1 og laminin-5 spaltes ved meprin-α

in vitro

[37], og vi spekulere at meprin-α kan udsætte kryptiske pro-migrerende epitoper på samme måde som tidligere har været vist med laminin-5 og laminin-1 for MT1-MMP [38] og elastase [39], hhv. Den uPA-plasminogen system er også af afgørende betydning i angiogenese [23], [40], og plasmin igen kan aktivere meprin-α som en downstream angiogen effektor i kolorektal cancer. I tråd med vores data, er også blevet observeret en pro-angiogenetisk effekt af meprin-α i en morpholino knockdown i zebrafisk [14].

pro-angiogene aktivitet var tydeligt med ekstracellulær opløselig meprin-α, hvorimod dets pro-vandrende virkning var tydelig på celler med meprin-α på deres celleoverflade. Derfor kan pro-angiogene effekt af meprin-α frigivet af kræftceller fremmes ved sin proteolytiske aktivitet udenfor og fjernt fra pro-angiogene /vaskulogene celler. Secerneret meprin-α kan således konditionere tumor miljø at fremme øget angiogenese sammen med andre pro-angiogene faktorer, hvorimod meprin-α tøjret ved celleoverfladen kan fremme migreringen af ​​cancerceller selv. forventes Begge meprin-afhængige processer i fællesskab at fremme tumor progression.

Som konklusion, denne undersøgelse afslører et komplekst og dynamisk mønster regulering for meprin-α i tumor progression. Overgangen til maligne stadier i kolorektale tumorer korrelerer med øget meprinα aktivitet ved primær tumor sites, i overensstemmelse med en rolle i invasionen og metastatisk spredning af kræftceller. En rolle for meprin-α i denne proces er yderligere understøttet af sin pro-angiogene og pro-vandrende aktivitet. Vore data viser også, at fremme af migration afhænger samtidig kørsel ekspression af meprin-β tethering meprin-α på celleoverfladen. Manglen på påviselig meprin-β mRNA i hele tumor, udelukker ikke induktion i en subpopulation af cancerceller. Vores data er i overensstemmelse med den opfattelse, at meprin-α /β co-udtrykkende cancerceller sandsynligvis migrere væk fra tumor masse. Vi har tidligere beskrevet, at meprin-β svækker intercellulære junctions [41]. Fremtidige undersøgelser bør fokusere på en analyse af den rolle, meprins i emigration af disse cancerceller. Den inhiberende aktivitet over meprin-α er lavere i sera fra patienter med colorektal cancer, som kan lette spredningen af ​​meprin-udtrykkende cancerceller. Terapeutiske tilgange med proteasehæmmere målrettet meprin-α i primære tumorer og i blodbanen kan modvirke tumor progression. På den anden side, meprin-α-aktivitet er lav i levermetastaser, og derfor ikke forventes inhibering af denne protease på dette sted at være en effektiv behandling.

Materialer og metoder Salg

Rekombinant human meprin

Rekombinant aktive meprin-α og meprin-β blev oprenset fra insektceller som beskrevet tidligere [7], [42]. Nogen resterende trypsin aktivitet kunne påvises i de rensede rekombinante meprins.

cellemigrationsassay

Madin-Darby hunde nyre (MDCK) -celler blev dyrket i minimalt essentielt medium (MEM) suppleret med 5% FCS , 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (celledyrkningsmedier og supplementer fra Invitrogen, Basel, Schweiz). Meprin-transficerede MDCK-celler [31] og vild-type parental MDCK-celler blev podet i laminin-1 coatet 12-brønds plader ved en densitet på 10’000 celler /brønd (plader med 12 brønde fra Costar, Cambridge, MA, USA, oprenset laminin-1 fra Engelbreth-Holm-Swarm muse sarkom, Sigma, St. Louis, MO, USA A) og inkuberet natten over i MEM med 5% FCS. Efter en inkubation af 48 h i serum-frit medium (Advanced DMEM, Invitrogen) indeholdende 20 nM hepatocytvækstfaktor (HGF), blev migrerende celler optaget med tid bortfalder videomicroscopy i 3-4 timer. Plasminogen (American Diagnostica, Pfungstadt, Tyskland) og actinonin (Sigma) begge blev tilsat ved 100 nM. Migration spor blev evalueret som tidligere [22] rapporteret. HGF inducerede migrering af MDCK celler ved hastigheder mellem 27 og 84 um /t. I fravær af HGF, MDCK celler vokser i klynger og ikke migrere. På grund af den tekniske begrænsning af forsøgsopstillingen anvendes, eksperimenter multiple migration måtte ske sekventielt på forskellige dage. Da de gennemsnitlige hastigheder migration varierede betydeligt mellem eksperimentelle sessioner uanset betingelserne vurderes. målingerne blev normaliseret til migration af celler vildtype observeret i hver eksperimentel session.

Angiogenese assay (aorta ring assay)

Ringe af rotte thorax aorta (1 mm længde) blev dyrket i 3-dimensionelle kollagengeler (rotte hale interstitiel collagen gel, 1,5 mg /ml, Serva, Heidelberg, Tyskland) [23]. Kulturerne blev holdt i 9 dage ved 37 ° C i 6 ml MCDB 131 (Invitrogen) med 25 mM NaHCO3, 1% glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i nærvær eller fravær af 0,7 ug /ml oprenset rekombinant aktive humane meprin-α. Den angiogene respons blev kvantificeret ved anvendelse af billedanalyse med softwaren Aphelion 3,2 (Adcis) på tre uafhængige forsøg (hver i triplikat). Efter geometriske og morfologiske parametre blev bestemt:. Antal mikrokar (NV), maksimal mikrokar længde (Lmax) og samlede antal filialer i mikrokar (Nb) [43]

Patienter

Indsamling af tumor prøver under kirurgiske indgreb blev godkendt af Etisk Komité medicinske Fakultet, universitetet i Bern, Schweiz. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. Carcinomer blev iscenesat ifølge UICC nomenklatur. Undersøgelsen omfattede 72 patienter (49/23 mand /kvinde, median 64,5 yrs, interval 20-90 år), med 12 patienter i hver af følgende seks grupper: adenomer (5/7 m /f, median 68,5 år, spændvidde 20 -89 år), primære tumorer iscenesætte I (7/5 m /k, median 72,5 år, interval 60-90 år), fase II (7/5 m /k, median 73 år, interval 50-82 år), fase III (10/2 mand /kvinde, median 64 år, interval 48-84 år), trin IV (9/3 m /k, median 60,5 år, interval 43-84 år) og levermetastaser (11/1 m /k , median 57,5 ​​år, spænder fra 31 til 84 år). Prøverne af denne studiegruppe er blevet analyseret af Northern og Western blotting, immunhistokemi og udsat for meprin aktivitet analyser. Eksperimenter vist i fig. 5A /B omfattede yderligere otte prøver fra levermetastaser (6/2 m /k, median 68 år, spændvidde 37-82 år).