PLoS ONE: Tissue og Serum microRNAer i KrasG12D transgene dyr model og i patienter med pancreas Cancer

Abstrakt

microRNA (Mirs) modulere ekspressionsniveauerne af mRNA og proteiner, og kan dermed bidrage til kræft initiering og progression . Ud over deres intracellulær funktion, Mirs frigives fra cellerne og udskilles til kredsløbet. Vi postuleret, at cirkulerende Mirs kunne give indsigt i veje ændret ved kræft progression og kan indikere reaktioner på behandling. Her fokuserer vi på pancreascancer malign progression. Vi rapporterer, at ændringer i mir ekspressionsmønstre under progression af normalt væv til Invasiv pancreas adenocarcinom i P48-Cre /LSL-Kras

G12D musemodel spejle MIR ændringer observeret i humane pancreas cancer væv. miR-148a /b og miR-375-ekspression blev fundet faldet, mens miR-10, miR-21, miR-100 og miR-155 blev forøget, når man sammenligner normale væv, præmaligne læsioner og invasive karcinom i musemodel. Forudsagt target mRNA’er FGFR1 (MIR-10) og MLH1 (MIR-155) blev fundet nedreguleres. Kvantificering af ni microRNA’er i plasmaprøver fra patienter skelnes pancreascancer fra andre kræftformer samt ikke-kræft i bugspytkirtlen sygdom. Endelig gemcitabin behandling af kontroldyr og P48-Cre /LSL-Kras

G12D dyr med kræft i bugspytkirtlen forårsagede tydelig og op til 60-fold ændring i cirkulerende Mirs der indikerer differentielle lægemiddelvirkninger på normale og cancer væv. Disse resultater understøtter betydningen af ​​afsløre Mirs i kredsløbet og foreslår, at cirkulerende Mirs kunne tjene som indikatorer for lægemiddelrespons

Henvisning:. LaConti JJ, Shivapurkar N, Preet A, Deslattes Mays A, Peran I, Kim SE et al. (2011) Tissue og Serum microRNAer i Kras

G12D transgene dyr model og i patienter med kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 6 (6): e20687. doi: 10,1371 /journal.pone.0020687

Redaktør: Janine Santos, University of Medicine og Dentistry of New Jersey, USA

Modtaget: Januar 20, 2011; Accepteret: 6 maj 2011; Udgivet: 27 juni 2011

Copyright: © 2011 LaConti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet delvist af National Institutes of Health give CA108440 (AW), US DOD CDMRP (JJL), den Lombardi Cancer center (NS), Gordon Foundation (AW), den Lustgarten Foundation (ATR) og Ruesch center (JLM og AW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

microRNA (miRNA eller Mirs) er små, ikke-kodende RNA, som spiller en væsentlig rolle i at kontrollere aktiviteterne i cellulære veje både i fysiologi og patologi (se f.eks [1]). Den tydelige funktion af Mirs i forskellige cancertyper er blevet mere indlysende i de senere år [2], [3], og mange undersøgelser viser, at MIR signaturer kan anvendes til at skelne mellem forskellige cancere [4], [5], [6], [7] prognoser [8], [9], [10], [11], [12], [13], eller afslører potentielle mål [14] samt ændrede signalveje [15]. Mest overraskende, en sammenligning af MIR og mRNA profiler af primære og metastatiske cancer læsioner viste, at Mirs billede en mere pålidelig og karakteristisk signatur end mRNA’er og fandt, at MIR signaturer var bedre mRNA’er identificere organet kilde af metastaser af ukendt oprindelse [16] , [17]. Ud over disse analyser af normale og sygdomsramte væv, har nyere rapporter vist, at der kan påvises MIR arter i omløb [18], og foreslog, at analyse af serumprøver for definerede MIR arter kunne anvendes til at identificere patienter med kræft [19], [ ,,,0],20], [21], [22], [23], [24], [25] samt andre sygdomme som hjertesygdom [26], [27], [28], [29], [30] eller diabetes mellitus [31].

Sekvenser af Mirs ofte bevaret på tværs af arter og vi spekuleret på, at analysen af ​​Mirs i en veldefineret dyremodel kunne oplyse studier med patientprøver. Vi var især interesseret i at vurdere, om dette kunne oversættes til påvisning og kvantificering af Mirs i kredsløbet, fordi der måske i sidste ende afslører aktiveret eller ændret smitteveje baseret på en analyse af en blodprøve i stedet for analyse af syge vævsprøve [32] . Desuden behandlinger vil sandsynligvis indvirkning mir mønstre i omløb, og disse mønstre kan meget vel være nyttige ved fastsættelse underskrifter lægemiddelvirkninger.

Her er vi fokuseret på kræft i bugspytkirtlen, der blev diagnosticeret i 43,140 patienter i 2010. Kræft i bugspytkirtlen er en dødelig sygdom med en 5-års overlevelse på kun 6% [33]. Denne dårligt resultat skyldes sene detektion samt en mangel på effektive behandlinger [34]. At identificere informativ Mirs, vi brugte en gensplejset musemodel, at P48-Cre /LSL-Kras

G12D model, der først blev beskrevet af Hingorani

et al.

[35]. Denne model gengiver den maligne progression ses i human PDAC udvikling [34], [35] og talrige undersøgelser med denne model indsnævret cellerne oprindelseslande PDAC [36] og viste bidrag forskellige driver gener [37], [38 ], [39], der styrer biologi og progression af denne sygdom [40]. Vi anvendte væv høstet på forskellige stadier af malign progression fra denne musemodel til at evaluere et panel af Mirs, der var blevet vist at være op- eller nedreguleret i humane pancreas cancer væv og var blevet gennemgået og kompileret nylig af Seux og kolleger [41 ]. Denne analyse blev derefter fulgt af kvantificering af Mirs i kredsløbet af patienter med pancreas og andre kræftformer eller kontroller, og vi fandt miR ekspressionsmønstre der skelnes mellem de forskellige grupper. MIR udtryk mønstre i serum fra forsøgsdyr parallel resultaterne hos patienter. Endelig behandling af dyr med anti-cancer stof Gemcitabin, der er godkendt til første linie behandling af kræft i bugspytkirtlen [42], viste et klart mønster ændring i MIR-niveauer i kredsløbet af dyr med kræft i bugspytkirtlen versus kontroller.

Resultater

microRNA ekspression i pancreas væv under Kras

G12D-induceret ondartet progression

Et panel af Mirs konsekvent op- eller nedreguleret på tværs af forskellige undersøgelser i humane pancreas cancer væv i forhold til normale pancreas væv blev udvalgt fra litteratur og database søgninger (se tabel S1; Refs [7], [41], [43], [44], [45]). Til dette miR panel nedsat vi kvantitativ RT-PCR påvisning [46], fordi vi forventet en bred vifte af MIR-koncentrationer ved sammenligning vævsekstrakter versus blodprøver eller på tværs humane og murine prøver.

Mus pancreas vævsprøver blev høstet ved forskellige aldre fra P48-Cre /LSL-Kras

G12D musemodel. Pancreas kanal epitel i disse dyr fremskridt gennem tidlige og sene dysplastiske læsioner, Panin (= bugspytkirtlen in situ carcinom) over en periode på flere måneder til invasiv kræft og dermed efterligne ondartet progression af sygdom hos mennesker [34], [35]. Hver prøve væv høstet blev iscenesat af en histologisk analyse af pancreas ductusceller ændringer (figur 1A). Kontrol væv indeholdt 100% normale kanaler (Figur 1B). Pancreas fra yngre mus (Figur 1C) indeholdt mere end 50% af kanaler med tidlig stadie dysplastiske læsioner (Panin-1 eller -2). Pancreas fra ældre mus (Figur 1D) indeholdt ca. 10% af kanaler med sene stadie dysplastiske læsioner (Panin-3) i tillæg til -50% af kanaler med Panin-1 eller -2. PDAC væv indeholdt meste invasiv adenokarcinom (figur 1E).

(A) Kvantificering af histopatologiske ændringer i pancreas af kontroller eller P48-Cre /Kras

G12D mus. Prøverne blev adskilt i kontrol, tidlige stadie dysplastiske læsioner (Panin-1 og -2), sen fase dysplastiske læsioner (Panin-3 nuværende) og invasive pancreas kanalen adenocarcinom (PDAC). (B til E) Repræsentative histopatologi billeder fra hver af grupperne: (B) normale bugspytkirtlen, (C) Panin-1 og -2 (tidligt), (D) Panin-3 (sen) og (E) PDAC. Middelværdi ± standard error for% af pancreasvæv med de respektive læsioner er vist (n = 3 dyr i hver gruppe). 0, ikke påvist

Analyse af ekspressionen af ​​individuelle Mirs viste tre vigtige tendenser (figur 2A-C):. Først ekspressionen af ​​miR-10, miR-16, miR-21, miR- 100 og mIR-155 øges i de tidlige Panin læsioner i forhold til kontrol, og opretholdt høj ekspression i slutningen Panin og adenocarcinom væv. (Figur 2A) For det andet MIR-22, MIR-148a /b, MIR-212 og MIR-375 blev højt udtrykt i kontrol væv og deres ekspression blev reduceret i Panin (figur 2C) samt i adenocarcinom væv. For det tredje udtryk for miR-29b, miR-34a /c, miR-141, miR-199, har miR-210C og miR-301a ikke ændre sig væsentligt i løbet af ondartet progression (Figur 2B).

(A- C) Ekspressionsniveauer af individuelle Mirs i kontrol og pancreas væv på forskellige stadier af malign transformation. Mirs niveauer blev grupperet som stigende (A), steady (B), eller faldende (C) baseret på en sammenligning af niveauerne i hver gruppe (n = 3 pr gruppe). Middelværdi ± standardafvigelse er vist for hver miR ekspression. (D) Hierarkisk klyngedannelse af mus væv baseret på miR udtryk. Særskilte grupper er angivet af den blå og det gule felt. (E) Hierarkisk gruppering af Mirs baseret på deres udtryk niveauer. Mirs, der blev givet udtryk for på et højt niveau i kontrol (blå boks) versus PDAC væv (gul boks) er angivet. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; kontrol vs. tidlig Panin, sen Panin, eller PDAC. #: Au 0,85 og p = 0,06, ##: au 0,85 og p 0,05, ###: au 0,90 og p 0,01. (Au, omtrent fordomsfri sandsynlighed).

Tydelig gruppering af Mirs og pancreas væv med forskellige sygdomsområder stadier

En ukontrollerede gruppering af musen væv baseret på deres mir ekspressionsniveauerne identificeret tre forskellige grupper (Figur 2D). De kontrol væv adskilt fra alle andre væv i en gruppering af deres egne (blå boks). Fem af seks væv klassificeret som in situ læsioner (Panin) blev samlet i en anden gruppe. Invasiv adenokarcinom og en af ​​de sene Panin væv adskilt i en yderligere klynge (gul boks). Således sæt Mirs analyseret her er tilstrækkeligt til at skelne mellem de forskellige stadier af mutant Kras-induceret bugspytkirtlen malign progression.

Unsupervised gruppering af de enkelte Mirs blev udført for at bestemme, hvilke Mirs opfører parallelt og kan således tjene som fælles signaturer sammenfaldende med sygdomsstadium (Figur 2E). En gruppe (gul boks) indeholdt disse Mirs der viste det højeste udtryk i adenocarcinom væv og den laveste i kontrol væv. En separat gruppe (blå boks) viste en gensidig miR udtryk mønster, med de højeste niveauer i kontrol væv og de laveste niveauer i adenocarcinom. Disse grupperinger tyder på, at en delmængde af Mirs kan definere et væv klassifikation der bekræfter tidligere arbejde fra andre med forskellige humane cancer prøver [16], [17].

En sammenligning af resultaterne i musemodel (figur 1 Refs [7], [43], [44], [45]): Syv Mirs opreguleret i cancer versus normale væv i musemodellen blev også opreguleret i humane cancere. Af fem Mirs fundet nedreguleret i muse model blev fire også nedreguleret eller viste ingen ændring i studier med humane eksemplar. Kun MIR-212 blev opreguleret i human og nedreguleret i mus PDAC prøver. Det er fristende at spekulere i, at uoverensstemmelse af miR-212 mellem menneskelige og mus PDAC prøver kan indikere artsforskelle af epitel-stroma interaktioner under ondartet progression [47]. Samlet set tæt sammenfald af miR ændringer i maligne pancreas væv på tværs af arter og på tværs af forskellige undersøgelser tyder på, at den kliniske pancreas adenocarcinom er repræsenteret godt af P48-Cre /LSL-Kras

G12D dyremodel.

Angivelse af MIR målgener og Mirs i mus pancreas væv

Nylige undersøgelser har vist, at den fremherskende aktivitet af Mirs (84%) er deres indvirkning på target mRNA steady state-niveauerne [48]. At assss dette i musemodel, vi identificeret kandidat mRNA-mål fra en uvildig liste over under-udtrykt mRNA i humane pancreascancer og matches disse med miR panelet studerede her (tabel S3). Sættet af matchende gener nedreguleret i bugspytkirtelkræft indeholder MLH1 som forudsagt mål for miR-155, og FGFR1 som et mål på miR-10. I en sammenligning af normale og cancer væv høstet fra musemodeller mRNA ekspression af MLH1 og FGFR1 viste en signifikant, omvendt forhold MIR-155 og MIR-10 henholdsvis (figur 3). Salg

Væv fra P48-Cre /Kras

G12D mus med invasiv pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) og normal pancreas blev analyseret for ekspression af mIR-10 og mIR-155 i forhold til de respektive kandidat target mRNA’er, FGFR1 og MLH1 ved brug af kvantitativ RT-PCR. Middelværdi ± SEM af n = 3 i hver gruppe; ***, P 0,001 normal versus kræft

Gemcitabin behandling effekt på cirkulerende Mirs i dyremodel

Tilstedeværelsen af ​​syge væv kan angives ved ændrede MIR concentraions i. cirkulation (se indledning). Som en logisk forlængelse, kunne MIR koncentrationer i omløb også tjene som lettilgængelige markører for behandlingseffekt og selv angive veje ændret af en given behandling. Vi testede denne hypotese i PDAC musemodel forhold til at styre dyrene uden kræft. Gemcitabin er en first-line stof, der anvendes i behandlingen af ​​patienter med kræft i bugspytkirtlen og blev administreret i en uge til dyr med PDAC og alderskategori kontroldyr. dosis og behandlingsplan den blev tilpasset fra andre undersøgelser, der havde vist effekt over en længere behandlingsperiode [49], [50]. En lille blodprøve ( 0,1 ml) blev trukket før påbegyndelse af behandling for at sammenligne mir serumniveauer før og efter behandling på tværs af disse to grupper af dyr. Tilstedeværelsen af ​​PDAC i P48-Cre /Kras

G12D dyr blev bekræftet ved histologisk analyse af pancreas væv ved afslutningen af ​​undersøgelsen. Vi valgte seks Mirs, der blev fundet opreguleres og to, der var ned reguleret i PDAC væv i forhold til kontroller (se figur 2). A 10.000-fold koncentrationsområde af disse otte Mirs blev fundet i cirkulationen af ​​dyr (Figur 4A). Før behandling (figur 4A, åbne søjler), serumniveauer af miR-10 og miR-155 var forhøjet 2-fold (p 0,05) i PDAC (rød) versus kontrolgruppen (sort). I modsætning hertil serumniveauer af miR-21, miR-148b og miR-375, hvor der ikke kan skelnes mellem grupperne. Gemcitabin behandling (figur 4A, fyldte søjler) reducerede serumniveauer af miR-10, miR-21 og miR-155 i dyr med PDAC og i kontrol med 6- til 60-fold (p 0,05 til 0,01; Figur 4B) . Serum niveauer af miR-100 og miR-375 blev reduceret med 2 gange efter behandlingen selvom kun de kontroller viste statistisk signifikante forskelle (p 0,05). miR-148b serumniveauer blev ikke ændret ved behandlingen og miR-16 niveauer steg 5-fold efter behandling. Det er bemærkelsesværdigt, at Gemcitabin behandling af dyr med PDAC reducerede serumniveauer af MIR-21, MIR-10 og MIR-155 med yderligere 2-, 3- og 6-fold under reduktionen ses i kontroldyr, selv om kun miR- 155 nåede statistisk signifikans i sammenligningen af ​​PDAC og kontrol (figur 4B; p 0,05). Disse data tyder på, at overvågning passende Mirs i cirkulationen kan skelne narkotika effekter på syge væv fra narkotika effekter på de sunde ikke-målvæv.

(A) MIR-niveauer i serumprøver høstet før (åbne søjler) og efter en uges behandling med gemcitabin (5 doser af 40 mg /kg). (B) Forholdet mellem serumkoncentrationer før /efter gemcitabin. Den stiplede linje angiver en to-fold forskel. *, P 0,05; **, P. 0,01

Mirs i cirkulationen af ​​patienter med pancreas og andre kræftformer

Ni forskellige Mirs blev isoleret og kvantificeret fra plasmaprøver fra patienter med pancreascancer, andre gastrointestinale cancere, og ikke-cancer kontroller. Patienten diagnoser er opsummeret i tabel S2. MIR-100a og MIR-10 blev signifikant forøget i pancreas kræftpatienter sammenlignet med kontroller uden cancer mens en række af de andre Mirs (MIR-16, 21, 155, 199, 221, og 223) viste en tendens til forøget ekspression der ikke nåede statistisk signifikans (figur 5A). En anden delmængde af Mirs viste signifikante ekspressionssystemer forskelle mellem bugspytkirtelkræft og tyktarmskræft patienter, men ikke i forhold til patienter med andre gastrointestinale cancerformer. Udtrykket mønstre af de forskellige cirkulerende Mirs tyder på, at nogle er bedst til at skelne mellem kræft og ikke-kræftpatienter, mens andre bedst adskiller de syge organer.

Prøver var fra bugspytkirtlen kræftpatienter, ikke-kræft kontrol, og patienter med andre GI kræftformer. (A) Koncentrationer af ni Mirs påvist i de omløb viser individuelle forskelle mellem patientgrupper. Bemærk de forskellige serier af vægten på Y akser. (B) i vognen tilfældig skov analyse sammenligne pancreascancer (sorte cirkler) versus ikke-cancer kontrol med pancreatisk sygdom (hvid trekant), ikke-cancer kontroller uden pancreatisk sygdom (hvide cirkler), øvre GI cancer (blå cirkler), tyktarmskræft ( røde cirkler) og leverkræft (gule cirkler). Rød cirkel er størstedelen af ​​pancreascancer. Pile angiver to eksemplar fra patienter med duodenal cancer. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Patient karakteristika er angivet i tabel S2.

I et uovervåget tilfældig skov analyse, der betragtes som et udtryk for alle ni Mirs isoleret fra cirkulationen, fem af seks bugspytkirtlen kræftpatienter samlet i en separat gruppe fra flertal af andre patienter (figur 5B). Dette bekræfter, at den kombinerede ekspressionsmønster af disse ni Mirs i kredsløbet var tilstrækkelig til at identificere patienter med kræft i bugspytkirtlen som adskilt fra patienter med andre GI cancere og kontroller. Af note var to prøver fra patienter med duodenale neoplasmer (pile), der grupperede tættest på bugspytkirtlen kræftpatienter, muligvis på grund af bugspytkirtlen engagement uopdaget på tidspunktet for prøveudtagningen. Også prøver fra patienter med ikke-kræft i bugspytkirtlen sygdom og ikke-kræft kontroller grupperet angiver, at panel af miR udtryk er specifikke for kræft i bugspytkirtlen i stedet nogen sygdom, der stammer fra bugspytkirtlen.

Diskussion

mutant Kras

G12D-drevet bugspytkirtelkræft model er blevet godt karakteriseret ved mange molekylære og biologiske niveauer [35], [36], [37], [38], [39]. Vores analyse af vævsprøver viser, at nogle MIR ændringer forbundet med invasiv kræft i bugspytkirtlen er allerede tydeligt under de tidlige stadier af sygdommen (figur 2). Mere overraskende var, i hvilket omfang ændringer i miR ekspression i dyremodellen efterlignede mir ekspressionsvektorer ændringer observeret i human pancreascancer (se tabel S1). Faktisk blev en delmængde af Mirs der omfatter MIR-10 og MIR-155 opreguleres i bugspytkirtelkræft patienters væv og mus samt i de respektive blodprøver. Således er denne undersøgelse giver bevis for, at inter-art ligheden mellem miR udtryk i forbindelse med kræft i bugspytkirtlen relativt er bevaret, meget sandsynligt på grund af mutant Kras som en vigtig igangsætter af denne malignitet [42].

Den komparative analyse af miR udtryk under ondartet progression i musemodel giver os mulighed for at drage nogle konklusioner om relevante Mirs i omløb, som kan indikere tilstedeværelsen af ​​prækursorer læsioner. Habbe et al. [51] rapporterede om ekspressionsniveauerne af Mirs i humane intraduktal papillære mucinøse neoplasmer (IPMN) væv, og konkluderede, at miR-155 er opreguleret og en mulig væv biomarkør for pre-invasiv sygdom. Vi fandt MIR-155 at være opreguleret i sættene, der indeholder Panin læsioner i musemodellen og også fundet MIR-155 opreguleret i plasmaprøver fra patienter med pancreascancer. Andre undersøgelser evaluere cirkulerende miR-21, miR-210, miR-155 og miR-196a i forskellige sæt af bugspytkirtlen kræftpatienter har trukket lignende konklusioner om den diagnostiske potentiale Mirs [52]. IPMN, mucinøs cystisk neoplasme (MCN), og Panin repræsenterer tre kendte precursor læsioner af PDAC. Disse tre typer af premalignancies har mange genetiske og patologiske ligheder, men også nogle funktioner, der giver at differentiere dem [53]. Vores resultater understøtter den hypotese, at plasmaniveauer af MIR-155 faktisk kan repræsentere en biomarkør indikerer tilstedeværelsen af ​​Panin læsioner.

Tilsvarende miR ændringer i væv og i cirkulationen antyder for os, at Mirs frigives fra det syge væv på en kontinuerlig måde eventuelt via exosomer [54], [55] selv om der kan være specifikke release mekanismer, der kan favoriserer nogle Mirs over andre [56]. Her er vi for det meste fokuseret på Mirs der er forhøjet i syge væv snarere end dem, hvis udtryk er reduceret eller tabt. Vi ræsonnerede, at et tab af en given miR kun vil påvirke steady-state-niveauerne i kredsløbet, hvis det syge organ er den største kilde på MIR stede i kredsløbet. F.eks. miR-148a /b og miR-375 er nedreguleret meget stærkt i bugspytkirtelkræft i forhold til normale pancreas væv. MIR-375 har vist sig at spille en vigtig rolle i pancreas islet udvikling [57], og funktion samt i vedligeholdelsen af ​​glukose homøostase [58], [59], og det er bemærkelsesværdigt, at en tidligt symptom på PDAC kan voksen diabetes mellitus. MIR-148 kan repressere ekspression af DNMT3b via en region i dens kodende sekvens [60] og kan således påvirke DNA reparationsmekanismer

Trods a . 100 gange reduktion af MIR-375 og MIR-148a /b under malign transformation af pancreas væv, er det slående, at deres serumniveauer ikke reduceres til dyr med PDAC (se figur 2C og 4A). Dette antyder, at bugspytkirtlen bidrag til deres serumniveauer er kun små. Dette vil sandsynligvis også tilfældet for miR-21, hvor stigninger i væv niveauer af 100 gange i løbet af bugspytkirtlen malign transformation i dyremodel ikke afspejles i øget serum niveauer (se figur 2A og 4A). I modsætning hertil er miR-10 og miR-155-niveauer i serum steg i bugspytkirtlen malign transformation i mus og hos patienter, der støtter den tanke, at det syge organ er en væsentlig bidragyder til serum niveauer af disse Mirs (se figur 4A og 5A).

Nylige undersøgelser fra Bartel laboratorium har vist, at den dominerende aktivitet af Mirs er at mindske target mRNA niveauer og fandt, at over 84% af MIR virkninger på protein produktionen skyldes denne udtynding af mål mRNA [48]. Således kan Mirs som er opreguleret i cirkulationen af ​​syge individer sammenfaldende med reducerede niveauer af target mRNA i det syge væv af oprindelse. Vi yderligere hypotese, at Mirs fundet at være steget i cirkulationen af ​​patienterne kunne være til stede ved meget højere niveauer i de syge tisses på grund af fortyndingen på deres kaste ind i blodet. Vi identificerede kandidat mRNA mål og en uvildig liste over under-udtrykte mRNA fra bugspytkirtelkræft versus normale væv indsamlet fra forskellige undersøgelser returnerede 154 mRNA, der kunne være kræft relevante MIR-mål. Disse blev matchet med miR panelet studerede her (tabel S3).

sæt gener vendt tilbage fra denne analyse indeholder

MLH1

forudsagt som mål for miR-155. Faktisk overekspression af miR-155 i cellelinjer resulterede i nedregulering af hMSH2, hMSH6, og hMLH1. Desuden blev en omvendt korrelation mellem ekspressionsniveauer af miR-155 og MLH1 eller MSH2 proteiner rapporteret for humane kolorektal kræft [61]. MLH1 er en mis-match reparation protein, der bidrager til akkumulering af genetiske fejl i forbindelse med familiær bugspytkirtelkræft og nogle sporadiske tilfælde [34]. Dens mRNA blev fundet nedreguleret i bugspytkirtelkræft prøver og en brøkdel af tabet af MLH1 mRNA-ekspression i pancreascancer er blevet tilskrevet promotor hypermethylering [62]. Vi observerede en signifikant omvendt forhold mellem ekspressionen af ​​MIR-155 og MLH1 mRNA i sammenligningen af ​​normale og cancer væv (figur 3A). Desuden blev FGFR1 mRNA fundet nedreguleret i human pancreas adenocarcinom (tabel S3) og vi observeret en signifikant nedregulering i muse PDAC model i forhold til normalt væv (figur 3B). Disse resultater med miR-10 og miR-155 og deres forudsete mål mRNA MLH1 og FGFR1 støtter idéen om en potentiel regulatorisk funktion af disse Mirs under ondartet progression.

I en ny serie dyreforsøg med potentiel direkte klinisk ansøgning har vi testede, om Mirs kunne tyde lægemiddeleffektivitet. Koncentrationen vifte af cirkulerende Mirs overvåget i denne eksperimenter er 10.000 gange og virkningen af ​​lægemiddelbehandlingen var relateret med koncentrationen forbehandlingen af ​​de otte Mirs overvågede (figur 4A). Efter gemcitabin MIR-16 blev fundet forøget i serummet ved 5-gange i PDAC samt kontroldyr. MIR-16-ekspression er associeret med apoptose [63], vækstsuppression gennem p53 [64] og tumor suppression [65]. Stigningen af ​​denne MIR-16 i kredsløbet cancer og kontroldyr matcher med den cytotoksiske aktivitet af lægemidlet på sundt væv. I modsætning til denne stigning, blev MIR-148b serumniveauer ikke påvirkes efter lægemiddelbehandling og serum MIR-10 og MIR-155 blev reduceret mest (30- og 60-fold) efter gemcitabin. Disse to Mirs var fundet forhøjede i serum af PDAC dyr i forhold til kontrol før initiering af medicinsk behandling. Desuden serumniveauer af miR-10 og miR-155 i behandlede dyr med PDAC faldt under serumniveauer af behandlede kontroldyr (figur 4A B) tyder dem som potentielle indikatorer for tumor specifikke virkninger af behandlingen. Samlet set resultaterne i denne eksperimentelle indstilling støtter idéen om en bugspytkirtelkræft selektiv effekt af gemcitabin selvom virkninger på homeostase af andre sunde væv også blev klart.

Konklusion

miR ændringer i væv og de omløb viser bemærkelsesværdige ligheder mellem kræft i bugspytkirtlen hos patienter og P48-Cre /Kras

G12D musemodel af sygdommen. Ud over mimcry menneskelige molekylære patologi i musemodel kan signatur Mirs identificeret her også tjene som informative indikatorer for narkotika effekt i udviklingen af ​​desperat behov agent eller kombinationsbehandlinger single [42] af denne ødelæggende sygdom.

Materialer og metoder

mus væv analyse

Animal forsøgsprotokoller blev godkendt af Georgetown University Animal Care og brug Udvalg (GUACUC # 08-028). Den P48-Cre /LSL-Kras

G12D musemodel har tidligere [35] beskrevet. I kontrolgruppen, sen Panin og adenocarcinom grupper, mus blev aflivet ved 16 måneders alderen. Controls manglede enten KRAS

G12D eller P48-CRE allel. For den tidlige Panin gruppen blev mus på en måned gamle behandlet med caerulin og aflivet efter fire måneder efter en etableret protokol [66]. Pancreas blev halveret fra hale til hoved med den ene halvdel fikseret i formalin, og den anden halvdel nedfrosset i flydende nitrogen. En patolog scorede den højeste Panin klasse pr lobule af alle lobules tælles i et repræsentativt H omvendt: CGGAGAGTCTCATGGCACCGC. FGFR1 fremadrettet primer: GTAGCTCCCTACTGGACATCC; reverse primer:. GCATAGCGAACCTTGTAGCCTC

miR påvisning og kvantificering i menneskelige og mus blodprøver

Humane blodprøver blev opnået fra biorepository af Lombardi Cancer Center, der indsamler anonyme eksemplar fra kræft og ikke-kræft patienter til forskningsformål. Dataene blev analyseret anonymt. Museblod ( 0,1 ml) blev opsamlet via submandibulære blødning under anvendelse af en lancet [67]. Serum- eller plasmaprøver blev blandet i et forhold på 1:10 med Qiazol lysis reagens og vortexet. Lysatet blev ekstraheret med CHCI3, og den vandige fase blev yderligere behandlet for total RNA under anvendelse af miRNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) og beriget for miRNA hjælp af RT2 qPCR-Grade miRNA Isolation Kit, MA-01 (SABiosciences).

Gemcitabin behandling af dyr

Gemcitabin blev opnået fra hospitalet apotek og administreret til 22-23 måneder gamle P48-Cre /Kras

G12D eller alder matchede kontroldyr ved 40 mg /kg i 5 doser i løbet af en uge. Denne dosis på 200 mg /kg /uge var baseret på Refs. [49], [50]. Blod blev trukket før påbegyndelse af behandling ( 0,1 ml) og en dag efter den sidste dosis. Tilstedeværelsen af ​​PDAC blev bekræftet i P48-Cre /Kras

G12D ved obduktion histologiske analyse

Dataanalyse

databehandling metoder blev kodet i R (http:. //Www .r-project.org). Hierarkisk klyngedannelse blev udført baseret på gennemsnitsværdien centreret og skaleret MIR ekspressionsniveauer.