PLoS ONE: karendotelvækstfaktor i cirkulation i kræftpatienter kan ikke være en Relevant Biomarkør

abstrakt

Baggrund

Niveauer af cirkulerende vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) er blevet anvendt bredt som biomarkør for angiogen aktivitet i cancer. Til dette formål blev der ikke standardiserede målinger i plasma og serum bruges, uden korrektion for kunstig VEGF frigivelse af blodplader aktiveret

ex vivo

. Vi hypotesen, at “sande” cirkulerende (c) VEGF niveauer i de fleste kræftpatienter er lave og relateret til kræft belastning eller tumor angiogenese.

Metode

Vi bestemt VEGF niveauer i mær drift, et medium, indeholder blodplade aktivering inhibitorer, i citrat plasma, og i isolerede blodplader i 16 raske forsøgspersoner, 18 patienter med metastatisk ikke-renal cancer (non-RCC) og 12 patienter med renalcellecarcinom (RCC). Hos ikke-RCC patienter, cirkulerende plasma VEGF var lavt og ligner VEGF niveauer i kontrol, hvis blodpladeaktivering blev minimeret under proceduren høst af mær drift medium. I citrat plasma, blev VEGF-niveauer forhøjet i ikke-RCC patienter, men dette kunne forklares ved en kombination af øget blodplade aktivering under blod høst, og ved en to-fold stigning i VEGF indholdet af individuelle blodplader (kontroller: 3,4 IU /10

6, ikke-RCC: 6.2 IU /10

6 blodplader, p = 0,001). I modsætning hertil blev der cVEGF niveauer i RCC patienter forhøjet (mær drift plasma: 64 pg /ml vs. 21 pg /ml, RCC vs. non-RCC, s 0,0001), og ikke relateret til blodplade VEGF koncentration

konklusioner

Vores resultater tyder på, at “sande” frit cVEGF niveauer er ikke forhøjet i de fleste kræftpatienter. Tidligere rapporterede forhøjede plasma VEGF niveauer i kræft synes at skyldes kunstig frigivelse fra aktiverede blodplader, som i kræft har en øget indhold VEGF, under proceduren blodet høst. Kun hos patienter med RCC, som er kendetegnet ved overdreven VEGF-produktion på grund af en specifik genetisk defekt, var cVEGF niveauer forhøjet. Denne observation kan være relateret til begrænset og selektiv succes anti-VEGF midler, såsom bevacizumab og sorafenib, som monoterapi i RCC i forhold til andre former for kræft

Henvisning:. Niers TMH, Richel DJ, Meijers JCM, Schlingemann RO (2011) karendotelvækstfaktor i cirkulation i kræftpatienter kan ikke være en Relevant biomarkør. PLoS ONE 6 (5): e19873. doi: 10,1371 /journal.pone.0019873

Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: April 15, 2010; Accepteret: 19. april, 2011; Udgivet: 26 maj, 2011

Copyright: © 2011 Niers et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) er det primære. regulator af angiogenese i tumorer [1] – [3]. Det er udgivet af cancerceller, hypoxiske celler og aktiverede blodplader og leukocytter [4] – [8]. Målcellerne af VEGF er primært vaskulære endotelceller, hvor det har stærke mitogene virkninger via højaffinitetsreceptorer flt-1 og KDR /FLK-1 [9], [10]. Som VEGF er et opløseligt diffunderbart peptid udskilt af tumorer, blev dets niveau i kredsløbet foreslået at afspejle den angiogene aktivitet af maligniteter. Derfor har man i de seneste år, cirkulerende niveauer af VEGF og andre angiogene faktorer er blevet bredt undersøgt som surrogatmarkører for angiogen aktivitet og prognose hos kræftpatienter, til overvågning behandling respons og til påvisning af tidlig tilbagefald [11].

Til dette formål blev VEGF-niveauer bestemt i serum eller plasma, der anvendes. Imidlertid indeholder serum høje niveauer af VEGF på grund af frigivelse af aktiverede blodplader under koagulering [5] – [7]. Derfor VEGF-niveauer i serum, der korrelerer tæt med blodpladetal [12], ikke afspejler den faktiske cirkulerende koncentration af VEGF in vivo. I citrat eller EDTA-plasma, hvor der forventes mindre trombocyt aktivering og efterfølgende VEGF frigivelse end i serum blev VEGF-niveauer fundet at være endnu højere hos kræftpatienter end hos kontroller, og det blev tolket som en afspejling af højere niveauer af VEGF i kredsløbet og højere angiogen aktivitet [13] – [15]. Men også af disse forfattere kunstig frigivelse af VEGF fra blodplader, eller ændret adfærd af blodplader i kræftpatienter, blev ikke udelukket som en kilde til øgede VEGF niveauer i plasmaprøver.

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge muligheden for, at kunstige VEGF frigivelse ved blodplader er den vigtigste kilde til VEGF i plasmaprøver, og at cirkulerende niveauer af VEGF hos cancerpatienter er lave og endog uden forbindelse cancer belastning eller angiogen aktivitet. Til dette formål, vi bestemt plasmaniveauer af VEGF med eller uden hæmning af blodplade aktivering og kvantificeres VEGF frigivelse fra blodplader in vitro, i kontrolpersoner uden kræft, patienter med metastatisk ikke-renalcellecarcinom patienter og patienter med metastatisk renalcellecarcinom. Salg

Materialer og Metoder

patienter og frivillige

Vi opnåede veneblod fra 16 raske frivillige (kontrol) og fra 30 kræftpatienter, adskilt i to patientgrupper: 18 patienter med metastatisk ikke-RCC (non-RCC) og 12 patienter med metastatisk RCC (RCC). RCC blev karakteriseret ved høje intra-tumor VEGF-produktion ved mutationer i von Hippel-Lindau tumorsuppressorgen med deraf følgende ubegrænset aktivitet af hypoxi inducerbar faktor 1α (HIF1α) forårsager høj VEGF transkription [16] – [20].

Vi undersøgte VEGF-niveauer i citrat plasma, mær drift plasma og i blodplader. Kendetegnene for frivillige og patienter er som følger: raske kontrolpersoner (kontroller) median alder, 53 [48-60]; kræftpatienter (Ikke-RCC-gruppe); median alder, 62 [57-72]; med cancer i bugspytkirtlen (7), cholangio (3), Papilli Vateri (2), spiserør (1), colon og rectum (2), melanom (1), ovarie (1), bryst (1). RCC (RCC-gruppe) median alder, 60 [56-65]; med følgende prognostiske grupper: 5 fattige-risiko, 5 mellemliggende risiko og 2 gunstig risikovurdering, i henhold til Motzer [21]. Alle kræftpatienter havde metastatisk sygdom. At skelne mellem i vivo blodpladeaktivering og kunstig in vitro trombocyt aktivering under plasma høst blev β-TG og PF4 målt i alle prøver. Blodprøver anvendt i denne undersøgelse blev afledt fra RCC patienter inkluderet i BAYER 43-9006 undersøgelse (godkendt af Medical Ethics Committee (METC 05-262), Academic Medical Center, University of Amsterdam), ikke-RCC patienter, der ikke indgår i en specifik undersøgelse, og frivillige. Fra alle frivillige og patienter særskilt skriftlig informeret samtykke blev opnået for blodprøve høst og angiogenese biomarkør bestemmelser.

Plasma præparater

Til sammenligning med standard citrat plasma indsamling, vi ansat en metode til (maksimalt) undgå kunstige ex vivo blodpladeaktivering ved blodprøvetagning uden tourniquet, og høst i et medium, der indeholder en blanding af antikoagulanter, som prostaglandin E

1 og theophyllin blev tilsat (mær drift medium). Derudover brugte vi et vigtigt redskab til at skelne mellem i vivo blodpladeaktivering og kunstig in vitro trombocyt aktivering, dvs. målinger af β-tromboglobulin (β-TG) og blodpladefaktor 4 (PF4) niveauer. Indsamling i mær drift plasma og samtidig brug af af trombocytaktiveringsmarkører skal give en præcis vurdering af de cirkulerende niveauer af VEGF in vivo.

Fra hver patient eller frivilligt veneblod blev taget med en microperfuser (diameter 1 mm, Microflex , Vycon, Ecouen, Frankrig) og opdelt i forskellige rør. Plast (polypropylen) blod opsamlingsrør blev fyldt med 400 pi af en opløsning indeholdende: prostaglandin E

1 (94 nM), Na

2 CO

3 (0,63 mM), EDTA (90 mM) og theophylin ( 10 mM) (mær drift-medium). Blodprøver (4 ml) blev opsamlet i disse mær drift rør i et åbent system, dråbe for dråbe uden brug af en årepresse på (maksimalt) undgå blodpladeaktivering ex vivo. Blod opsamlet i mær drift rørene blev straks anbragt på is (i modsætning til citrat og EDTA blodprøver som blev holdt ved stuetemperatur). Blodplade-depleteret mær drift plasma blev fremstillet ved centrifugering i 60 minutter ved 1700 g ved 4 ° C inden for 1 time efter opsamling.

Blod blev også opsamlet i rør fyldt med citrat og i rør fyldt med EDTA under anvendelse af en tourniquet ( Becton Dickinson vacutainere Systems, Breda, Holland). Citrat blodprøver blev centrifugeret inden for 30 minutter i 15 minutter ved 1000 g for at opnå plasma. EDTA-blod trukket på samme måde, blev anvendt til at måle det samlede antal af blodplader. Til måling VEGF, PF4 og β-TG inden blodpladerne blev EDTA-blod anvendes på hvilke blodplader blev ødelagt ved en kombination af Triton (2% Triton X-100), sonikering i 15 sekunder på is (mikrospids, Branson, amplitude 50% ) og centrifugering i 5 minutter ved 14.000 rpm i en mikro-centrifuge. Blodplade-depleteret mær drift plasma blev anvendt til måling VEGF, PF4 og β-TG-koncentrationer. Citrat plasma blev brugt til at måle VEGF og PF4 niveauer.

Målinger af blodplader aktivering markører og VEGF

PF4 og β-TG-koncentrationer inden blodplader lignende og ved trombocytaktivering de er udgivet i lignende mængder [22], [23]. Fordi PF4 clearance fra plasma er meget hurtigere end p-TG clearance (t½ for PF4 er flere minutter og for β-TG 100 minutter) [22], [23] en normal eller kun lidt forhøjet PF4 niveau og høj β-TG niveau tyder in vivo blodpladeaktivering, hvorimod en høj β-TG-niveau i kombination med et højt PF4 niveau tyder in vitro (ex vivo) blodpladeaktivering. Alle prøver blev derfor testet for VEGF, β-TG og PF4 anvendelse af kommercielt tilgængelige sandwich enzymmaerket assays (ELISA) fra Roche (Asserachrom β-TG og Asserachrom PF4, Roche, Mannheim, Tyskland) og R . D Systems, Abingdon, UK)

Inddrivelse af VEGF

for at udelukke, at mær drift eller citrat medium påvirker målingen af ​​VEGF-niveauer ved ELISA, kendte koncentrationer af rekombinant human VEGF (standard tilvejebragt i assaykittet) blev tilsat til serum, mær drift plasma og citrat plasmaprøver at producere VEGF koncentrationer på 250, 62,5, 31,2, 7,8 og 3,9 pg /ml. Prøverne blev fortyndet med assaybuffer, og koncentrationen af ​​VEGF blev bestemt ved ELISA.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med computerprogrammet SPSS-version 12.0 (SPSS, Gorinchem, Holland) og med GraphPad Prism software (GraphPad Prism, San Diego, CA, USA). VEGF, PF4 og β-TG-koncentrationer i raske frivillige og cancerpatienter blev sammenlignet under anvendelse af Mann-Whitney U-test (uparrede, ikke-normalt fordelte grupper). Værdier er præsenteret som median og interkvartile område [T25-T75].

Resultater

Plasma og blodplader VEGF niveauer

I de tre patientgrupper, VEGF-niveauer i citrat plasma ( Figur 1A) var signifikant højere end i mær drift plasma (figur 1B). VEGF niveauer i citrat plasma var signifikant højere i begge grupper af kræftpatienter sammenlignet med raske kontrolpersoner, men i mær drift plasma var dette kun tilfældet for patienter med RCC. Indholdet af isolerede blodplader VEGF, en velkendt reservoir for VEGF, var to gange højere i begge kræft patientgrupper end i kontrollerne (tabel 1 og figur 1C).

A) VEGF-niveauer, der måles i citrat plasma for cancer patienter sammenlignet med raske personer. B) VEGF-niveauer målt i mær drift plasma af kræftpatienter sammenlignet med raske personer. C) VEGF niveauer målt i blodplader af kræftpatienter versus raske personer. Barer repræsenterer medianerne.

I RCC patienter, VEGF niveauer i mær drift plasma var betydeligt højere end hos ikke-RCC patienter, hvorimod blodplader VEGF indholdet ikke var forskellig mellem disse grupper. VEGF-niveauer i citrat plasma, mær drift plasma og blodplader i gruppen patienter er vist i tabel 1 og figur 1. Disse målinger blev ikke påvirket af typen af ​​mediet, som nyttiggørelse af VEGF var 100-107% i mær drift plasma, 73 % -107% i citrat plasma og 78-100% i serum.

In vitro

blodpladeaktivering

på grund af sin lave halveringstid in vivo, PF4-niveauer i blodprøver er et mål for kunstige ex vivo blodpladeaktivering. I vores undersøgelse, hos både raske kontroller og cancerpatienter PF4 koncentrationerne var 50-100 gange højere i standard citrat plasma (opsamlet med tourniquet) end i mær drift plasma (opsamlet uden tourniquet) (tabel 2). Dette viser, at graden af ​​kunstige ex-vivo blodpladeaktivering er meget afhængig af metoden til høst, og at kunstig blodpladeaktivering i mær drift plasma er lav, og i citrat plasmaprøver er høj.

Som blodplader aktivering er forbundet med VEGF frigivelse, mær drift plasma VEGF-niveauer afspejler sandsynligvis de cirkulerende niveauer af VEGF, mens de øgede niveauer af VEGF i citrat plasma oftest forårsaget af ex vivo blodpladeaktivering. Denne mulighed er stærkt støttet af den signifikant korrelation, som vi observeret mellem PF4 og VEGF-niveauer i de enkelte citrat plasmaprøver (figur 2).

VEGF og PF4 målt i citrat plasma korreleret signifikant (r = 0,457, p = 0,008 ).

i mær drift plasma, fandt vi to gange højere PF4 værdier hos kræftpatienter sammenlignet med raske kontroller. Dette indikerer, at blodplader fra cancerpatienter er mere tilbøjelige til at blive aktiveret. Dog kan en øget PF4 koncentration i de enkelte blodplader kræftpatienter også have bidraget til den øgede PF4 koncentration i mær drift plasma (Figur 3).

A) β-TG og PF4 målt i mær drift plasma af kræftpatienter sammenlignet til kontrol. B) β-TG og PF4 målt i blodplader af kræftpatienter i forhold til kontrolgruppen. Barer repræsenterer medianerne.

En høj β-TG-niveau i kombination med en lav PF4 niveau i mær drift plasma er en indikation af in vivo blodpladeaktivering. Vi var i stand til at påvise en sådan in vivo blodpladeaktivering i vores patienter med kræft, som β-TG i mær drift plasma viste ikke en stigning uafhængig af stigningen i PF4.

Diskussion

Vores undersøgelse viser, at ‘sande’ cirkulerende niveauer af VEGF, bestemt ved målinger i mær drift plasma, er lave i de fleste patienter med metastatisk cancer, og at de ikke adskiller sig væsentligt fra cirkulerende VEGF-niveauer i kontrol. De forhøjede VEGF niveauer i citrat plasmaprøver korrelerer med PF4, en markør for ex vivo blodpladeaktivering, tyder på, at frigivelsen af ​​VEGF fra blodplader under proceduren høsten er ansvarlig for VEGF niveauer i disse prøver. Derudover observerede vi, at enkelte blodplader hos cancerpatienter har en to gange højere indhold af VEGF sammenlignet med raske kontroller. Vores resultater viser, at VEGF-niveauer i blodprøver er meget afhængige af metoden til indsamling og blodplader VEGF indhold, og spørgsmålstegn ved relevansen af ​​’cirkulerer’ VEGF som biomarkør. Vores resultater ikke udelukke, at kunstigt forhøjede VEGF niveauer i citrat plasmaprøver, som en kombineret måling af blodplader activatibility og blodplader VEGF indhold, kunne ikke være en meningsfuld surrogat markør for visse aspekter af tumor biologi.

En markeret stigning i plasma-VEGF-niveauer er blevet observeret i forskellige typer af kræft ansætte forskellige indsamlings- og beslutsomhed metoder [11]. En række undersøgelser rapporteret en sammenhæng mellem trombocyttal og serum VEGF [24], [25], og højere serum VEGF-niveauer pr blodplader hos kræftpatienter [26], [27]. Dette er i overensstemmelse med vores resultater og den kendte funktion af blodplader som en vigtig reservoir for VEGF. Blodpladeafledt VEGF kan have en vigtig patologisk rolle i cancer grundet thrombin induceret blodpladeaktivering og efterfølgende lokal frigivelse af VEGF, inducere vaskulær permeabilitet, endotelcelleaktivering og angiogenese, fremme koagulation og formidling cancer [4], [28] – [30 ].

i den foreliggende undersøgelse vurderede vi to forskellige metoder til plasmaindsamlingscentret for VEGF måling i raske kontroller og cancerpatienter. Virkningen af ​​brugen af ​​en årepresse og indsamling medium (citrat versus mær drift) på VEGF-niveauer blev demonstreret hos raske kontroller og kræftpatienter. Ingen signifikante forskelle blev påvist i mær drift VEGF niveauer mellem raske kontrolpersoner og ikke-RCC kræftpatienter.

I RCC patienter, mær drift VEGF niveauer signifikant højere sammenlignet med kontrolgruppen, hvilket antyder, at VEGF i disse patienter er virkelig forhøjet i cirkulation. RCC er kendetegnet ved høj intra-tumor VEGF produktion ved homozygote mutationer i von Hippel-Lindau tumorsuppressorgen med deraf følgende ubegrænset aktivitet af hypoxi inducerbar faktor 1α (HIF1α) forårsager høj VEGF transkription [20] – [26]. I mange af disse patienter, de andre celler i kroppen er heterozygote for VHL-mutationen. Disse genetiske aspekter kan forklare, hvorfor RCC patienter har forskellige cirkulerende VEGF niveauer end de ikke-RCC patienter undersøgt.

Vores resultater er i overensstemmelse med den selektive succes af anti-VEGF tilgange i behandlingen af ​​RCC forhold til andre typer af cancer [31]. Faktisk bevacizumab (Avastin; Genentech, South San Francisco, CA) et antistof, som binder til alle isoformer af humant cVEGF [32] frembragte en signifikant forlængelse af tiden til sygdomsprogression sammenlignet med placebo i patienter med RCC [33]. Dette i modsætning til de fleste andre tumortyper, hvor bevacizumab er enten ikke effektive eller kun havde signifikant antitumor effekt, når de anvendes i kombination med kemoterapi i stedet for som monoterapi (handler mere som kemoterapi-forstærker) [34]. Den ligefremme forklaring på den klinisk relevant aktivitet af bevacizumab som monoterapi i RCC kunne være de specifikke roller defekt hypoxisk signalering og VEGF overekspression i patogenesen af ​​disse tumorer.

Vi observerede, at in vitro trombocyt aktivering under samlingen procedure bidrager til højere citrat- plasma VEGF-niveauer. Dette blev påvist ved den høje frigivelse af PF4 fra blodplader i citrat forhold til mær drift plasma, og signifikant positiv korrelation mellem PF4 og VEGF-niveauer i de enkelte citrat plasmaprøver. De dobbelte højere niveauer af PF4 i mær drift plasma i kræftpatienter sammenlignet med kontroller tyder på, at også den optimale indsamlingsmetode nogle blodpladeaktivering stadig forekommer, men endnu vigtigere dette viser, at blodplader i kræftpatienter bliver lettere aktiveres end blodplader fra raske kontrolpersoner .

på linje med andre undersøgelser viste vi, at trombocyt VEGF indhold er højere hos kræftpatienter [26], [27], [35]. På baggrund af vores resultater i mær drift plasma, dette tyder på, at ex vivo frigivelse af VEGF ved blodplader er ændret hos kræftpatienter, skyldes både en stigning i trombocyttal VEGF indhold såvel som til en højere activatibility af blodplader i kræftpatienter. Højere blodplade VEGF indhold kan stamme fra øget belastning i knoglemarven eller skyldes en VEGF latrintømning funktion af blodplader [6], [35], [36]. En sådan fjernende funktion ville tjene til at fjerne overskydende VEGF, lokalt produceret i tumorvæv, fra kredsløbet. Det er bemærkelsesværdigt, at stigningen i blodplader VEGF indhold i både vores patientgrupper var omkring to gange sammenlignet med kontroller, på trods af de meget højere VEGF niveauer i mær drift plasma fra RCC patienter. Derfor, hvis blodplader virkelig har en latrintømning funktion for VEGF, i RCC denne latrintømning funktion synes at mislykkes på grund af for høj VEGF produktion, hvilket fører til cirkulerende VEGF. Endvidere i modsætning til cirkulerende frie VEGF, kan VEGF indhold i blodplader være meningsfuldt interessant potentiel biomarkør for VEGF og /eller angiogenese aktivitet hos cancerpatienter, som har brug for yderligere undersøgelser.

Som konklusion gratis VEGF niveauer er lav eller fraværende i cirkulationen i de fleste cancerpatienter, med undtagelse af RCC, en cancer type med overdreven VEGF-produktion skyldes en specifik genetisk defekt. Citrat VEGF niveauer ikke afspejler de faktiske cirkulerende VEGF niveauer, men er resultatet af ex vivo blodpladeaktivering og efterfølgende VEGF frigivelse fra blodplader, som har et større indhold af VEGF i kræftpatienter. Forhøjede citrat VEGF niveauer i kræftpatienter, som har vidt blevet anvendt som en biomarkør for tumor angiogenese, er forårsaget af artefakter og ændret blodplader adfærd i forbindelse med systemisk sygdom.

Tak

Vi står i gæld til fru MA Weijne og fru WF Kopatz for hjælp og samarbejde; Professor Dr. H. R. Buller for kritisk læsning dette manuskript forud for indsendelse og til patienter og frivillige inkluderet i undersøgelsen for deres tillid og støtte.