PLoS ONE: Generering af monoklonalt antistof MS17-57 Målretning Udskilte alkalisk phosphatase ektopisk udtrykkes på overfladen af ​​Gastrointestinal Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Terapeutisk udvikling antistof er en af ​​de hurtigst voksende områder i den farmaceutiske industri. Generering af høj kvalitet monoklonale antistoffer mod en given terapeutisk mål er afgørende for en vellykket udvikling af lægemidler. Men på grund af immuntolerance, hvilket gør det vanskeligt at danne antistoffer ved anvendelse af traditionelle metoder.

Metodologi /forhold

Mixed fire humane gastrisk cancer (GC) cellelinier blev anvendt som immunogenet i A /J-mus; seksten meget positive hybridomaceller kolonier blev selekteret via fluorescensaktiveret cellesortering-high throughput screening (FACS-HTS) anvendelse af i alt 20.000 kolonier i tres-syv 96-brønds plader mod levende celler (blandede humane GC celler versus humane PBMC kontroller). MS17-57 og styre kommerciel alkalisk phosphatase (ALP) mAb’er blev anvendt til at bekræfte målantigener (AGS), der blev identificeret som ALP’er udtrykt på GC celleoverfladen gennem en kombination af western blot, immunfældning og massespektrometri (MS).

MS identificeret AGS er anerkendt af MS17-57 at være to varianter af et udskilt ALP, Palpe og IALP (placenta og tarm ALP). Disse proteiner hører til en hydrolaseenzym familie ansvarlig for at fjerne phosphatgrupper fra mange typer af molekyler. Immunofluorescens farvning hjælp MS17-57 demonstrerede højere farvning af gastrointestinal (GI) kræft væv sammenlignet med normale GI væv (

P

0,03), og bekræftede binding af MS17-57 at være begrænset til en funktionel epitop udtrykt på cancercellen overflade. Proliferationsassays under anvendelse af Palpe /IALP-udtrykkende GC cellelinier viste, at MS17-57 hæmmede cellevækst med 32 ± 8%. Transwell migration celle assays dokumenteret, at MS17-57 kan hæmme Palpe /IALP-udtrykkende GI cancer celle migration ved 25 ± 5%. MS17-57 mAb inhiberede tumorvækst i nøgne mus.

Konklusioner

Vores resultater viser, at Palpe og IALP kan ektopisk udtrykt på ekstracellulær matrix af GI cancere, og at MS17-57 rettet mod Palpe /IALP kan hæmme GI kræftceller vækst og migration

i

vitro

i

vivo

. Denne undersøgelse giver et eksempel på identifikation af kræft biomarkører, der repræsenterer lovende terapeutiske mål ved hjælp af mAb genereret gennem en roman HTS teknologi

Henvisning:. Li M, Gao J, Feng R, Wang Y, Chen X, Sun J, et al. (2013) Generation af monoklonalt antistof MS17-57 Målretning Udskilte alkalisk phosphatase ektopisk udtrykkes på overfladen af ​​Gastrointestinal Cancer Cells. PLoS ONE 8 (10): e77398. doi: 10,1371 /journal.pone.0077398

Redaktør: Nikki Pui Yue Lee, The University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: May 1, 2013; Accepteret: 3. september 2013; Udgivet: 15 oktober 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud nummer 81.201.596, 81.101.847, 81.172.324, 91.229.106, 31.270.963); Centrale projekter i National Science Teknologi Pillar Program Kina (2011BA203191); Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (12XD1403700, 12PJ1406300); Forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina (20110073110071); Key projekt af Shanghai Uddannelsesudvalg (12ZZ105). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Alle forfattere er opfindere af en verserende patentansøgning vedrørende immuniserende mus, forbereder MS17- 57 hybridoma og anvendelse af MS17-57 monoklonalt antistof til behandling af cancer. Forfatterne erklærer, at to forfattere var ansat af en kommerciel virksomhed, Shanghai MabStar, Inc. Forfatterne også erklære, at der er indgivet MS17-57 samt screeningsmetode til patentansøgning med titlen “Generation af anti-ektopisk udtrykte alkalisk fosfatase mAb, dens metode og applikationer “(en verserende patent), staten Intellectual Property Office af Folkerepublikken Kina (CN201310090565.9). Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. De andre fire mAbs vil blive patenteret, og resultaterne vil blive offentliggjort som godt.

Introduktion

Gastrointestinal (GI) kræft er en af ​​de mest almindelige maligne tumorer hos mennesker med en høj risiko for dødelighed verdensplan [1]. Udviklingen af ​​terapeutiske antistoffer til at undersøge, vurdere, forebygge og behandle kræft er en af ​​de hurtigst voksende områder inden for forskning i både den akademiske arena og den farmaceutiske industri [2]. Frembringelsen af ​​høj kvalitet monoklonale antistoffer (mAb’er) mod kræft markører som terapeutiske mål er en vigtig vej til klinisk lægemiddeludvikling. Nogle kræft markører er kendte (for eksempel human epidermal vækstfaktor receptor 2 og vaskulær endotel vækstfaktor) er eller veludviklede, men de fleste er stadig ukendt eller uudviklet [3]. Der er derfor stor interesse i at generere mAb mod nye og ukendte cancer-targets. mAb mod specifikke tumor mål kan udvikles og identificeres ved hjælp af en række forskellige tilgange, herunder enzymmaerket (ELISA) -høj throughput screening (HTS), fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) -HTS, og

in vitro

in vivo

screening.

Identifikation af nye kræft biomarkører involveret i tumorigenese, kræft udvikling, eller forebyggelse af kræft fortsætter med at være af stor interesse på verdensplan [4,5]. På grund af fremskridt inden for proteomics og andre aspekter af molekylærbiologi, sådanne undersøgelser er stadig mere realistisk i nuværende æra end tidligere. Cutting-edge HTS teknologi er relativt veludviklet og er meget populær i mange fagområder [6,7].

Vi har derfor undersøgt generation af mAbs mod potentielt nye Ags på kræftcellen overfladen med en FACS- HTS metode. I denne undersøgelse fandt vi, at MS17-57 mAb’er kunne identificere placenta og intestinale alkaliske phosphataser (Palpe og IALP henholdsvis) som mål udtrykt på cancer cellemembranen. Vores strategi var at udnytte en hidtil ukendt fremgangsmåde til FACS-HTS og hybridomteknologi under anvendelse af en blanding af 4 levende GI cancercellelinier som immunogen [8], hypoteser, at i det mindste noget af mAb produceres sandsynligvis ville binde til konformationel epitop (er ) på celleoverfladen af ​​GI cancerceller. Dataene viste, at MS17-57 kunne binde til Palpe og IALP der blev ektopisk udtrykt på celleoverfladen, og kunne neutralisere ALP aktivitet både

in vitro

in vivo

. Disse resultater antyder, at Palpe og IALP udtrykt på GI tumor overflade med aberrant cancer cellemetabolisme og signalvejen, hvori de kan fremme væksten af ​​cancerceller og metastase. MS17-57 er et mAb med høj affinitet og specificitet, potentielt repræsenterer en nyttig reagens og et potentielt grundlag for en roman terapeutisk strategi i udviklingen af ​​kræft narkotika.

Vores fremtidige studier vil fokusere på den molekylære mekanisme MS17-57 inhibering af cancerceller proliferation og migrering via binding til Palpe /IALP på cancercellen overflade, og på afklaring intracellulære signalveje, der berøres af virkningen af ​​dette antistof. Formodning yderligere undersøgelser bekræfter de lovende resultater, der er beskrevet i disse indledende undersøgelser kunne antistof engineering af MS17-57 som en kimære eller humaniseret antistof til terapeutisk anvendelse skal forfølges. Salg

Materialer og Metoder

cellekulturer

GI cancer cellelinjer MKN45, BGC823, SGC7901, MKN28, AGS og GES-1 blev købt fra Institut for Biokemi og Cellebiologi , Shanghai Institutes for Life Science, Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og Riken Bioresource center (Tsukuba, Japan). De GI cancer cellelinjer MKN-74 [9] og TMK-1 [9] var høflighed af Dr. Gary K. Schwartz (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, USA), og KKLS celler [10] blev opnået fra Dr. Yukuta Takahashi (Cancer Research Institute, Kanazawa Universitet, Kanazawa, Japan). De gastrisk cancer cellelinjer ST-8 og ST-9 [11] var den høflighed af Drs. Bradley McIntyre og Paul F. Mansfield, University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX, USA). Alle andre cellelinier (SP2 /0, etc.) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Perifere, mononukleare blodceller (PBMC’er) blev opnået fra en rask frivillig med informeret samtykke.

Bortset SP2 /0 myelomaceller og mAb hybridomaceller, alle celler blev dyrket i MD6, en hjemmelavet, serumfrit medium afledt fra Dubecco modificerede Eagles medium (Gibco BRL, Rockville, MD, USA) med 5% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) (Sigma, St. Louis, MO, USA), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De myeloma og hybridomceller blev dyrket på lignende måde, men uden kalvefosterserum. Myelom og hybridomceller blev dyrket i suspension. GI cancerceller blev dyrket til at overholde vævskulturkolber med 5% FBS /MD6 medium.

Patient Væv

Friske tumor prøver og tilstødende noncancerous væv (mucosa) af syv GC patienter, der gennemgår kirurgi var opnået fra Institut for Kirurgi for Shanghai Ruijing Hospital på Shanghai, Kina. Disse patienter havde ikke modtaget cytotoksisk kemoterapi eller strålebehandling inden operationen. Institutional Review Board protokoller blev observeret, og etisk godkendelse af undersøgelsen blev ydet af Research Ethics Committee of Ruijing Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Informeret skriftligt samtykke var opnået fra alle deltagere (herunder frivillige donorer) deltager i undersøgelsen.

Friske væv blev farvet med MS17-57 samt isotypekontrol mAb. De bindende signaler blev forstærket, mærket med fluoresceinisothiocyanat, og tælles af FACS-HTS.

Mus

Male A /J-mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) 6- 8 uger gamle, blev købt fra Nanjing Experimental Model Animal center, Nanjing Universitet, Nanjing, Kina, og fastholdes på dyret facilitet i Shanghai MabStar, Shanghai, Kina. Vedligeholdelsen af ​​A /J mus og eksperimentelle procedurer blev godkendt af Shanghai Dyrevelfærd og forskning etiske komité, Science and Technology udvalg af Shanghai Municipal regering, Kina og licensnummeret er SYXK (Hu) 2009-0087.

Mand JAX nøgne mus i alderen 4-8 uger blev købt fra Shanghai Experimental Model Animal center og vedligeholdes på Experimental Animal center i Shanghai Ruijing Hospital. Disse nøgne mus blev anvendt til forsøg med xenografter af human gastrisk cancer (GC) og metoderne ligner Sela gruppe tidligere beskrevet [12]. Vedligeholdelsen af ​​JAX nøgne mus og eksperimentelle procedurer blev godkendt af Shanghai Dyrevelfærd og forskning etiske komité, Science and Technology udvalg af Shanghai Municipal regering, Kina og licensnummeret er SYXK (Hu) 2011-0113.

Direkte Kræft Cell Vaccination

Hver A /J-mus blev injiceret subkutant på 5-10 sites samt en gang intraperitonealt (ip) med omkring 5-10×10

6 celler (lige store mængder af MKN45, BGC823, SGC7901, og MKN28 celler) i phosphatbufret saltvand (PBS; pH 7,4). Tre mus blev tildelt pr eksperimentel batch. To uger senere blev musene injiceret igen, i alt tre immuniseringer, plus en i.p. booster tre dage før fusion eksperimentet

Tre dage efter booster blev miltceller indsamlet ved operation fra en immuniseret mus aflives ved CO

2 indånding og alle bestræbelser blev taget for at mindske dyrs lidelser.; miltcellerne blev derefter fusioneret med myelomceller SP2 /0-celler [13,14] i 50% polyethylenglycol (pH 7,4) fusion opløsning til udvikling af mAb hybridomer. De fusionerede hybridomceller blev opretholdt i hypoxanthin-aminopterin-thymidin-medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), og 280 pl /brønd fusionerede celler (ca. 1-2 x 10

4 miltceller /brønd) blev opdelt i alikvoter i tres syv 96-brønds fladbundede vævskulturplader og inkuberet ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO

2 i 10 dage. Samtidig blev de fire GI cancercellelinjer dyrket i bulk i flere kolber.

Fluorescens-aktiveret cellesortering med high-throughput screening (FACS-HTS)

FACSCalibur-HTS-systemet (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) blev anvendt til at screene de selektive hybridomaer fra store mængder fusionsproteiner celler /kolonier i fusionen plader. Op til 200 screening og tæller screening (kræftceller versus normale celler) plader kunne anvendes i en sådan screening assay. Celler fra alle fire GC linjer blev høstet, blandet, og opdelt i portioner (ca. 1×10

6 celler /brønd) i 96-brønds U-bundede plader (67 plader) .Den samme antal humane perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) fra en rask frivillig blev adskilt ved anvendelse af den humane lymfocyt-separering opløsning Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, USA) og opdelt i alikvoter i 96-brønds U-bundede plader (yderligere 67 plader for counter screening). Supernatanten (80 pl /brønd) fra hver af de 67 fusion pladerne blev overført til GC celleplader navngivet fra 1 til 67 efter at disse celler var blevet blokeret med 2,0% bovint serumalbumin (BSA) /PBS blokeringsbuffer i pladerne. Supernatant fra de samme fusion pladerne blev på lignende måde overført til PBMC-plader. Efter GC celle og PBMC Pladerne blev vasket tre gange med blokerende buffer, det sekundære antistof [gede-anti-muse-immunglobulin G (IgG) Fc konjugeret med fluoresceinisothiocyanat] blev opdelt i alikvoter i begge GC celleplader og PBMC plader (100 pl /brønd) og inkuberet på is eller i køleskab ved 4 ° C i 30 minutter, og igen vasket tre gange med blokeringsbuffer. De fluorescerende farvede celler blev fikseret i 1,5% paraformaldehyd /PBS. Procentdelen af ​​farvet top celle skift og betyder fluorescensintensitet (MFI) blev løbende overvåget af FACS-HTS system til 134 screening og counter-screening 96 brønde U-bundplader. Hybridomakolonier udviser kraftig binding og specificitet for GC-celler (og ingen binding til PBMC’er) blev udvalgt til ekspansiv vækst, vænnet fra konditioneret medium, og subklonet.

mAb Generation

Supernatanter blev opsamlet fra udvalgte hybridomkloner og oprenses under anvendelse af protein-A Sepharose-søjler (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Vi valgte den oprensede MS17-57 mAb for yderligere analyse, der blev filtreret gennem et 0,2 um membran, steriliseret, og opdelt i alikvoter i kryorør holdt ved 4 ° C til anvendelse i cellekulturer eller

in vivo

undersøgelser (beskrevet under). Blandingen af ​​mAb i PBS og 50% glycerol blev frosset ved -20 ° C i langtidsopbevaring.

Mus IgG isotypebestemmelse

Vi brugte en mus mAb isotypebestemmelse kit (Isostrip, RochePharma AG , Reinach, Schweiz) til at karakterisere isotypen af ​​muse MS17-57 mAb (IgG).

cDNA Sekventering af den variable region af MS17-57

Vi anvendte en RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) for at isolere total RNA fra MS17-57 hybridomceller. Den MS17-57 cDNA-bibliotek blev skabt ud fra mRNA i revers transkription reaktioner med en SuperScript III første-streng (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). De MS17-57 IgG Fab-fragment Ag-bindende variable regioner blev amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR) med 21 par af tung-kæde- og let-kæde-primere, som blev indhentet fra mus IgG Library Primer Set (Progen Biotechnik, Heidelberg, Tyskland). PCR-produkter blev anvendt til DNA-sekventering, som blev udført af Lee Lu lab på MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA. Komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er) og rammeaftaler regioner (FWRs) af MS17-57 blev identificeret ved hjælp af ressourcer til rådighed på National Center for Biotechnology Information hjemmesider og fastlæggelse af opstillinger af cDNA og aminosyresekvenser [15-18].

Indirekte ELISA

Ag (protein) (0,2 ug /ml i PBS) blev coatet på Immulon-II HB 96-brønds ELISA-plader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og inkuberet i en våd -boks natten over ved stuetemperatur (RT). Ag-overtrukne plader blev vasket og blokeret med 1,0% BSA /PBS-Tween 20 (PBST) puffer, og 100 pi af primære antistoffer individuelt fortyndet i 1,0% BSA /PBST blev tilsat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur og vasket med PBST. Efter vask, 100 pi fortyndet (1: 2.500) peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret gede-anti-muse-IgG-Fc polyklonalt sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Efter yderligere vask med PBST, 150 pi peroxidasesubstrat (tetramethylbenzidin i 0,02 M [6,0] citrat /acetatpuffer og 0,003% H

2O

2) blev tilsat til hver brønd til fremkaldelse af farven af ​​binding signaler; udvikling blev stoppet ved tilsætning af 50 pi 0,2 M H

2SO

4 til hver brønd. Absorbansen (optisk tæthed; OD) af reaktionsprodukterne pladerne blev aflæst ved 450 nm med turbiditeten henvisning indstillet til 620 nm.

Immuocytochemical Analyse med Cytospin Slides

For at gøre 1×10

6 GC celler i 50 uL /​​hver, cytospin kammer huller blev spundet på slides og fikseret med 4% paraformaldehyd /PBS løsning, dehydreret med 70% ethanol og lufttørret. Objektglas blev rehydreret i PBST i en flad position i 5 minutter og derefter inkuberet i 10% gedeserum /PBS. Objektglas blev inkuberet med primære antistoffer i en passende fortynding i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C, skyllet i PBST to gange i 5 minutter /hver i vandret stilling. Objektglas blev derefter inkuberet med HRP-mærket sekundært antistof (gede-anti-muse IgG-Fc-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories) ved 1: 500 fortynding i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. Detection mAb-farvning på cancerceller blev udført med 0,125% aminoethylcarbazol kromogent substrat i 5-10 minutter ved stuetemperatur, og mAb farvede cytospin objektglas blev modfarvet med Gills hematoxylin (Dako, Carpinteria, CA, USA). Anti-fade monteringsmedium (Vector Labs, Burlingame, CA, USA) blev anvendt til at montere objektglassene.

cancercelleproliferation inhiberingsassay

cancercelleproliferation inhiberingsassay blev udført under anvendelse Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Santa Clara, CA, USA) og var baseret på påvisning af dehydrogenase aktivitet i levedygtige celler. I alt 5000 celler /150 pi valgt BGC823, MKN45, eller begge typer af celler fra 4 GC anvendte cellelinier i immunisering, blev dispenseret i hver brønd på plader med 96 brønde for hver af quadruplicated testbetingelser. Plader blev præ-inkuberet i 24 timer i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO

2. 50 pl /brønd af MS17-57 (8 og 2 ug /ml), et irrelevant (isotypekontrol) mAb’er (30 og 8 pg /ml) og en medium alene (blanke kontrol) blev sat til testplader i fire eksemplarer for at reducere variation. Forsøgsresultaterne Pladerne blev inkuberet ved anvendelse af de samme betingelser som den præ-inkubering. CCK-8-opløsning blev sat til pladerne (10 pl /brønd), tages som en plade for hver testbetingelse per dag fra dag 1 til 7. Pladerne blev inkuberet i 3 timer og absorbansen ved 450 nm blev målt under anvendelse af en VERSAmax mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

cancer Cell migration inhiberingsassay

inhiberingen af ​​chemotaxic cancer cellemigrering blev vurderet ved hjælp af QCM 24 brønde kolorimetrisk cellemigrationsassay ( EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Ved stuetemperatur, 300 pi af cellesuspensionen (1,0 x 10

5 celler /ml i MD6), med eller uden hver 5, 10, og 20 ug /ml MS17-57 plus irrelevante mAbs tilsat til hver insert, blev tilsat til hver af de 24 brønde i migrationskammeret, og 500 pi MD6 med 5% kalvefosterserum blev tilsat til hver brønd i det nedre kammer. Testpladerne blev inkuberet i en vævsdyrkningsinkubator ved 37 ° C med 5% CO

2 i 24 timer, og ikke-migrerende celler blev forsigtigt fjernet fra det indre af indsatsene med en vatpind. Celler på den nedre overflade af membranen blev farvet ved at dyppe inserterne i krystalviolet (et nukleinsyre farvestof) farvningsopløsning (500 uL /​​brønd) i 20 minutter. Indsatsene blev skyllet i vand flere gange, fik lov til at lufttørre, og fotograferet. De farvede celler blev opdelt i alikvoter i 96-brønds plade og tælles af VERSAmax mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

tumorvækst i Balb /C nøgne mus Salg

Antitumoraktiviteten af MS17-57 blev undersøgt med xenotransplantater af humant GC i Balb /C nøgne mus som beskrevet tidligere [12]. Kort fortalt, 1 x 10

6 valgt BGC823 eller MKN45 celler i MD6 med eller uden MS17-57 plus irrelevante mAb’er blev injiceret i.p. i hver mus. Denne injektion produceret tumorer i alle musene ved 6 uger efter celleimplantation, og vægten af ​​tumor nodule af hver var ca. 0,3-1,0 gram, der afhænger af, hvor mange indledende celler blev inokuleret. Behandling med MS17-57, irrelevante mAbs, og PBS (som medium blindprøvekontrol) (alle ip) startede dagen efter kræft celle injektion (dvs. på dag 1) og blev gentaget på dag 15 og 29. Hver behandlingsgruppe bestod af på mindst fire dyr. Antallet af tumorknuder blev talt, og knuden diameter blev målt én gang. Musene blev aflivet ved CO2 inhalation på dag 48 og blev gjort alle bestræbelser på at forbedre dyrenes lidelser.

Immunopræcipitering (IP) og massespektrometri (MS) Analyse

For indirekte IP, magnetiske Dynabeads overtrukket med protein-A (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) blev inkuberet med 50 ug MS17-57 i 30 minutter ved stuetemperatur med konstant omrystning. Perlerne blev derefter vasket og inkuberet med lysat af udvalgte BGC823 eller MKN45 GC celler, som lysaterne blev fortyndet på passende vis. Inkubation fandt sted i nærvær af 0,1% Triton X-100 i radioimmunpræcipitationsanalyse ekstrakter (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). mAb mod anti-β-actin (ca. 42 kDa i natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese [SDS-PAGE] gel) blev anvendt som en intern kalibreringsstandard. Lysatet blev successivt udsat for MS17-57-belagte kugler i 30 minutter med rotation. Bundne perler blev vasket med 0,5% Triton X-100 efterfulgt af vand. Prøverne blev elueret ved opvarmning i kogt vand med 50 pl /hver eluat Laemmli denaturerende prøvepuffer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Derefter blev prøverne belastet og separeret på 10% Bis-Tris-gel (Bio-Rad) i 1 × 2 – (

N

-morpholino) ethansulfonsyre løbebuffer og SDS-PAGE. Gelen blev farvet med en sølvfarve (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). De farvede target bånd blev skåret og analyseret med et ProteinChip apparatserie 4000 (Enterprise Edition) massespektrometer (Bio-Rad).

Direkte IP blev udført under anvendelse af Dynabeads antistof kobling kit (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) til direkte par perlerne med MS17-57. De resterende trin var de samme som beskrevet for indirekte IP.

mRNA-ekspression ved kvantitativ revers transkription (QRT) -PCR Analyse

Ekstraktion af totalt RNA fra 10 GI cancercellelinier blev udført med TRIzol reagens (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) [19]. RNA blev kvantificeret under anvendelse af A260 /A280-nm absorption ratio. At konvertere RNA til cDNA, blev en 1 pi af den samlede RNA-prøve, der anvendes i en revers transkriptionsreaktion med RNase inhibitor (Invitrogen), SuperScript III revers transkriptase (Invitrogen), dithiothreitol og første streng puffer. Blandingerne af prøverne blev inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter og derefter ved 42 ° C i 50 minutter. Reaktionen blev deaktiveret ved 70 ° C i 15 minutter.

De fremadrettede og bagudrettede primere IALP, Palpe, og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (5′-TCCATCTTCGGGTTGGCCCCC-3 ‘og 5’-TCCGTGGGTCTCGGACGACAG-3 «5’CCTGGGTGCTGCTCCTGCTGGG-3 ‘og 5′-CGTAGACACCCCCATCCCGTCAC-3′; og 5’-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 ‘og 5′-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3’, henholdsvis) blev syntetiseret og anvendt i en real-time PCR-reaktion med SYBR grønne reagenser (Life Science, Hercules, CA, USA) og fyldt på en 96-brønds plade. Blandingen af ​​prøver blev kørt i en CFX96 Touch real-time PCR detection system (Bio-Rad) under følgende betingelser: 93 ° C i 2 minutter for pre-denaturering, 93 ° C i 1 min til denaturering, 55 ° C i 1 min til annealing, 72 ° C i 1 min for forlængelse i 40 cykler og 72 ° C i 7 min ved den endelige inkubation. Data blev analyseret ved hjælp af Opticon Monitor software (Life Science, Hercules, CA, USA).

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS software (IBM). Data blev udtrykt som middelværdi ± standardfejl af midlerne. Forskelle blev analyseret ved t-test;

P

værdier 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

MS17-57 Hybridoma blev genereret ved immunisering med levende GC Celler

Efter principper. af mAb generation [10], brugte vi en blanding af levende MKN45, BGC823, SGC7901, og MKN28 GC celler som immunogenet at immunisere a /J-mus tre gange. Inden den endelige boost blev serum fra en hale-blødning af hver immuniseret mus opsamlet. SGC7901 og BGC823 celler blev tilfældigt udvalgt fra de fire GC cellelinier, der blev brugt i levende celler immunisering. Humane PBMC’er isoleret fra helblod fra en rask donor blev anvendt som en noncancer kontrol. Humane GC-celler og PBMC’er blev bundet med serum fra hver immuniserede mus og med ikke-immuniseret museserum for kontrol (figur 1). Alle tre mus i hver cellelinje udviste bindende signaler til GC cellelinjer og PBMC’er, selvom PBMC’er havde relativt svagere signaler.

Humane PBMC’er blev isoleret fra helblod fra en udvalgt rask donor for normal celle kontrol. MKN45, BGC823, SGC7901, og MKN28 celler blev anvendt i forsøgene, men SGC7901 og BGC823 cellelinjer blev tilfældigt udvalgt som eksempler i denne figur. MFI var højere i disse celler end i PBMC’er. Alle tre mus udviste et kraftigt immunrespons mod de humane GC cellelinier.

Miltceller fra fire humane GC cellelinier immuniserede mus blev fusioneret med muse myelom SP2 /0-celler til at generere antistoffet hybridomet. FACS-HTS blev anvendt til at screene for stærkere Ag binding fra en stor pulje af bindemidler (dvs. mAb’er) i hybridomet repertoire. MAb’erne bundet primært til de konformationelle epitoper på overfladen af ​​levende cancerceller. Anvendelse af FACS-HTS, valgte vi hybridomakolonier med stærke bindende signaler anvendelse af i alt 20.000 kolonier i tres-syv 96-brønds plader mod de blandede levende GC-celler og normale humane PBMC’er (counter screening celler). Efter disse hybridomceller blev vænnet fra selektionsmedium blev de fem hybridomaer med de højeste bindingssignaler udvalgt til subkloning og antistof affinitetsoprensning. Vi valgte MS17-57 klon til yderligere undersøgelse. (De fire andre mAbs vil blive vurderet på et senere tidspunkt.)

MS17-57 Karakterisering

Vi karakteriseret MS17-57 mAb med en række forskellige metoder. Information om IgG1 for den tunge kæde og κ for den lette kæde blev opnået fra muse-antistof isotypebestemmelse [20]. De variable regioner (let kæde og tunge kæde) i Fab-fragmentet af MS17-57 blev sekventeret for DNA- og aminosyrer (figur 2). De unikke Ag-bindende regioner viste, at CDR’erne mellem FWRs af de tunge og lette kæder var til stede i den variable region af Fab-fragment som MS17-57 identitet.

FWRs er placeret mellem CDR’er.

MS17-57 Binding til lysater af GI Cancer Cells

for at definere nogle biologiske funktioner i MS17-57 mAb, lysater af MKN45, BGC823 og GES-1 cellelinjer (sidstnævnte genereret og udødeliggjort fra normale mave mucosale celler og transformeret med Simian virus 40) [21] blev individuelt coatet på ELISA-plader. Det oprensede MS17-57 tilføjet på pladen plus sekundært antistof-HRP amplificerede de bindende signaler (figur 3). Denne indirekte ELISA viste, at MS17-57 stadig kunne binde specifikt til det denaturerede mål (E) cellemembranprotein fra kræft cellelysater. MKN45 celler udtrykte MS17-57 målet på et højere niveau end BGC823 eller GES-1 celler gjorde, hvilket indikerer, at målet ekspressionsniveauerne kan variere mellem cellelinjer.

MKN45, BGC823, SGC7901, og MKN28 celler blev anvendt i forsøgene, men MKN45 og BGC823 cellelinjer blev tilfældigt udvalgt som eksempler i denne figur. MS17-57 udtrykte stærke bindende signaler til MKN45 celler og moderate bindende signaler til BGC823 celler og GES-1 celler. Cellelysater blev coatet med 1,0 ug /ml PBS på Immulon-II HB 96-brønds ELISA-plader (100 pi /brønd). Protein- koncentrationer af disse cellelysater var afbalanceret, men ikke for de bindende mål (AGS), som kan være en stor variation. Irrelevant mAb blev anvendt som en isotypekontrol.

Lokalisering af MS17-57 Mål på cancerceller

MS17-57 bundet til alle fire GC cellelinjer anvendes til immunisering, selvom bindingen signaler var ikke af samme intensitet (figur 4A). Ekspressionsniveauet af MS17-57 mål var højest i MKN45 celler og lavest i SGC7901 celler. Svarende til de kontrarevolutionære-screening resultater, har MS17-57 mAb ikke binder til humane PBMC’er. Det bandt til nogle andre typer af GC-celler (figur 4B), men ikke GI celler (figur 4C). Således er målet (r) MS17-57 ikke universelt udtryk, selv om de synes at være mere almindelige i GC celler end GI celler.

A.MS17-57 bundet til alle fire GC cellelinjer, der var anvendes til levende celler immunisering. B. MS17-57 udstillet stærke bindende signaler i GES-1 og AGS celler, men ingen bindende signal i humane PBMC’er. C. MS17-57 ikke binder til humane PBMC’er eller nogen af ​​de fem GI tumorceller. Irrelevant mAb blev anvendt som mAb isotypekontrol.

Frisk tumorvæv og tilstødende noncancerous væv fra seks GC patienter blev farvet for MS17-57 og isotypekontrol mAb og derefter kvantificeret med dosisafhængig bindende i FACS-HTS. Samlet set bindende signal MS17-57 var stærkere i tumorvæv end i noncancerous væv (

P

0,03) (tabel 1 og figur 5). Dette forsøg viste, at MS17-57 kan binde sig til sine mål i deres naturlige form på overfladen af ​​friske tumorprøver.

GC Patient

Tissue

mAb

MFI

% Stained Peak

trækkes MFI

2

Normalized MFI

3

Patient-1TumorIsotype Ctrl6.150.5113.0611.56MS17-5719.2118.23NormalIsotype Ctrl11.620.3215.898.76MS17-5727.5111.58Patient-2TumorIsotype Ctrl10.962.836.155.78MS17- 5717.1111.94NormalIsotype Ctrl28.3110.48-12.592.06MS17-5715.728.26Patient-3 * TumorIsotype Ctrl —- MS17-57 – NormalIsotype Ctrl —- MS17-57 – Patient-4TumorIsotype Ctrl3.760.18.2711.83MS17-5712.0313 NormalIsotype Ctrl4.90.861.294.67MS17-576.193.82Patient-5TumorIsotype Ctrl8.583.2-0.53.48MS17-578.084.02NormalIsotype Ctrl9.515.32-4.651.89MS17-574.861.08Patient-6TumorIsotype Ctrl7.95.488.317.59MS17-5716.217.63NormalIsotype Ctrl10.3310.213 pylori

.