PLoS ONE: gennemlæsning af for tidlige termineringskodoner i adenomatøs polypose Coli Gene Gendanner dets biologiske aktivitet i humane cancerceller

Abstrakt

APC tumorsuppressorgen ofte muteret i human colorectal cancer, med nonsens mutationer tegner sig for 30% af alle mutationer i dette gen. Genindførelse af WT APC-genet i kræftceller reducerer generelt tumorigenicitet eller inducerer apoptose. I denne undersøgelse udforskede vi muligheden for at anvende lægemidler til at inducere præmatur termineringskodon (PTC) gennemlæsning (aminoglycosider, negamycin), som et middel til reaktivering endogent APC. Ved at kvantificere gennemlæsning af 11 nonsense mutationer i APC, var vi i stand til at identificere dem, der giver de højeste niveauer af gennemlæsning efter behandling. For disse mutationer, demonstrerede vi, at aminoglycosid eller negamycin behandling førte til en genopretning af den biologiske aktivitet af APC i cancer-cellelinjer, og viste, at niveauet af APC-aktiviteten var proportionalt med niveauet af induceret gennemlæsning. Disse resultater viser, at der bør overvejes behandling med gennemlæsning inducere som en potentiel strategi til behandling af cancere forårsaget af nonsense mutationer APC-genet. De giver også et rationelt grundlag for identifikation af mutationer, som reagerer på gennemlæsning inducere

Henvisning:. Floquet C, Rousset JP, Bidou L (2011) gennemlæsning af Præmature termineringskodoner i adenomatøs polypose Coli Gene Gendanner dets biologiske aktivitet i Human cancerceller. PLoS ONE 6 (8): e24125. doi: 10,1371 /journal.pone.0024125

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Februar 2, 2011; Accepteret: 4. august, 2011; Udgivet: 31 August, 2011

Copyright: © 2011 Floquet et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra foreningen pour la Recherche sur le Cancer (ARC No. 5016 til JPR) og Association Française contre les Myopati (kontrakt 13986). CF blev finansieret delvist af det franske ministerium for uddannelse og forskning og delvist af et fællesskab fra Ligue Nationale Contre le Cancer. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

APC (adenomatøs polypose coli) tumorsuppressorgen koder et 311 kDa multidomain protein med bindingssteder for mange partnere, herunder mikrotubuli, Axin og beta-catenin [1]. Dette protein fungerer som en negativ regulator af Wnt-vejen, som er impliceret i transaktivering af målgener, såsom onkogenet c-myc og cyclin D1-genet [2]. APC-genet er muteret i 80% af coloncancere og mutationer forekommer tidligt i udviklingen af ​​de fleste polyploide kolorektale cancere. Det er blevet vist, at genindførelsen af ​​vildtype-APC-gen i cancerceller generelt reducerer tumorigenicitet eller inducerer apoptose [3], [4]. Samlet set 30% af alle mutationer i dette gen er nonsense mutationer [5].

I de sidste par år har visse antibiotika blevet vist at interferere med pattedyr ribosom, inducerer gennemlæsning af præmature stopkodoner (PTC ). Aminoglycosider er de antibiotika hyppigst undersøgt i denne henseende, og flere undersøgelser har antydet, at disse lægemidler kunne anvendes i innovative strategier til behandling af genetiske sygdomme forårsaget af sense-mutationer (for en oversigt [6], [7], [8]) . Dipeptidet antibiotikum negamycin er ikke strukturelt beslægtet med aminoglycosider [9], og har vist sig at være mere effektiv end gentamicin til at fremme gennemlæsning af nogle nonsense mutation [10]. Dette stof kan således udgøre et attraktivt alternativ behandling til patienter, der bærer en nonsense mutation.

I en nylig undersøgelse, vi viste, at selv en beskeden aminoglycosid-induceret gennemlæsning niveau (6%) udløste apoptose af cancerceller, der huser en sludder -mutated p53-genet [11]. Disse resultater gav proof-of-concept at gennemlæsning induktorer kan anvendes i behandlingen af ​​cancere forbundet med tilstedeværelsen af ​​en nonsense mutation i et tumorsuppressorgen. I den foreliggende undersøgelse, undersøger vi muligheden for at udvide denne tilgang til kræft knyttet til en nonsens mutation i APC-genet. For nylig Zilberberg et al viste, at gennemlæsning inducere forbedret kliniske symptomer på tumorigenese i en musemodel bærer en nonsense mutation i APC-genet. Imidlertid blev forbindelsen mellem det lavere niveau af tumor udvikling og PTC gennemlæsning ikke er etableret [12]. Det bliver stadig mere tydeligt, at kun en delmængde af nonsense mutationer ville drage fordel af gentamicin behandling, afhængig af deres nukleotid kontekst [13], [14], [15], [16].

Vi vurderede gennemlæsning effektivitet for 11 nonsense mutationer involveret i kolorektal cancer, med henblik på at identificere de nonsense mutationer i APC-genet den mest lydhøre over for gennemlæsning-fremkaldende behandlinger. For mutationerne med de højeste gennemlæsning niveauer, herunder en endogen mutation, antibiotisk behandling resulterede i genvinding af den biologiske aktivitet af APC.

Resultater og Diskussion

Identifikation af APC-sense-mutationer, som reagerer på aminoglycosid behandling

Vi studerede 11 nonsense mutationer findes i 23% af cancerceller, der bærer en nonsense mutation i APC-genet (T. Soussi, personlig kommunikation). Gennemlæsning effektivitet har vist sig at afhænge af naturen af ​​de sekvenser der omgiver stopkodonet [13], [17], [18], [19]. Således for hver mutation, vi indsat en region, der omfatter de omgivende forbindelse (27 nukleotider) i den dobbelte reporter vektor pAC99 (tabel 1). Gennemlæsning blev kvantificeret i NIH3T3-celler transient transficeret med dobbelt reporter vektor, i nærvær eller fravær af gentamicin (figur 1). Gennemlæsning varierede fra 0,01% (Q1131X) til 0,2% (L360X) for basal gennemlæsning, og fra 0,09% (APC Q789X) til 1,6% (L360X) i nærvær af 800 ug /ml gentamicin. Lignende variationer i basale gennemlæsning niveauer og lydhørhed over for aminoglykosider er blevet rapporteret i flere tidligere undersøgelser [13], [18]. Vi testede også et andet antibiotikum, amikacin, hvilket gav gennemlæsning niveauer svarende til eller lavere end dem, der opnås med gentamicin (data ikke vist). Dette resultat er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse fra Howard et al, der har sammenlignet gennemlæsning aktivitet af flere aminoglycosider [20].

gennemlæsning effektiviteter for 11 nonsense mutationer i APC-genet blev vurderet i NIH3T3-celler med og uden gentamicin ( 800 ug /ml) behandling i 24 timer. To nonsense mutationer (L360X og R1114X) viste niveauer af gentamicin-induceret gennemlæsning af mere end 0,5%. Betyder værdier præsenteres sammen med standardfejlen af ​​middelværdien (SEM) (n = 5).

Vi vurderede, om gennemlæsning niveauer var ens i celler af colon oprindelse, ved også at evaluere den gennemlæsning instrueret af hver nonsense mutation i cancer colorectal DLD-1-cellelinien. De opnåede resultater svarede til dem for NIH3T3 celler (data ikke vist).

For yderligere karakterisering, vi fokuserede på de L360X og R1114X nonsense mutationer, som viste de højeste niveauer af gennemlæsning i overværelse af aminoglykosid gentamicin (1,6% og 0,7%, henholdsvis). For de to udvalgte nonsense mutationer, vi kvantificeret gennemlæsning opnåede niveauer i nærvær af forskellige koncentrationer af G418 (geneticin), fordi dette antibiotikum er den mest potente gennemlæsning inducer af aminoglycosider [11], [21], [22]. Begge nonsense mutationer viste en dosisafhængig reaktion på G418, hvilket resulterer i gennemlæsning mængder større end dem, der observeres for gentamicin, til 2,3% for L360X og 1,8% for R1114X (figur 2 A og 2B henholdsvis). De gennemlæsning niveauer opnået i nærvær af dipeptidet negamycin var lavere end (L360X) eller lignende (R1114X) til dem, der opnås med gentamicin (figur 2 A og 2B henholdsvis).

(A) gennemlæsning effektiviteter for APC L360X nonsense mutationer blev bestemt i DLD-1-celler i nærvær af G418 (10, 25, 50, 100 og 200 ug /ml), negamycin (1 mg /ml), amikacin (2 mg /ml) eller gentamicin (800 ug /ml). (B) gennemlæsning effektiviteter for APC R1114X nonsense mutationer blev bestemt i NIH3T3-celler i nærvær af G418 (50, 100 og 200 ug /ml) eller negamycin (1 mg /ml). De gennemlæsning effektivitet i DLD-1-celler var i overensstemmelse med dem i NIH3T3-celler (data ikke vist). (C) aminoglycosid behandling restaureret APC-aktiviteten. APC-binding til beta-catenin (reppression af pTOPGlow reporter) genoprettes ved behandlingen af ​​DLD-1 celler transient transficeret med cDNA APC L360X med G418 (10, 25, 50, 100 og 200 ug /ml), negamycin (1 mg /ml), amikacin (2 mg /ml) eller gentamicin (800 ug /ml). (D) APC-binding til beta-catenin (undertrykkelse af pTOPGlow reporter) genoprettes ved behandlingen af ​​LoVo celler, der bærer APC R1114X med G418 (50, 100 og 200 ug /ml) eller negamycin (1 mg /ml). Som kontrol blev LoVo-celler cotransficeret med den pTOPGlow reporterplasmidet og enten APC-targeting siRNA (siRNA APC) eller et ikke-targeting siRNA (siRNA NT) og behandlet med G418 (200 ug /ml). (E) Effekt af siRNA targeting APC mRNA. Vi transient transficeret LoVo celler med et siRNA targeting (siRNA APC) eller ej målretning (siRNA NT) APC-mRNA. Kvantitativ PCR blev anvendt til at bestemme mRNA-niveauer. Resultater er udtrykt i forhold til mængden af ​​mRNA i nærværelse af siRNA NT. Middelværdier præsenteres sammen med SEM (n = 3).

gennemlæsning niveau afhænger af arten af ​​den stopkodonet og det omkringliggende nukleotid sammenhæng, men reglerne for gennemlæsning niveau er komplekse og forblive skal bestemmes for pattedyrsceller. Tilstedeværelsen af ​​en C-rest umiddelbart efter stopkodonet (4) er korreleret med en høj grad af gennemlæsning, skønt dette ikke synes at være den eneste determinant for gennemlæsning niveau. Adskillige undersøgelser har også vist, at kun få nonsense mutationer give “betydeligt” gennemlæsning i nærvær af gentamicin. I denne undersøgelse kun to af de elleve nonsense testede L360X og R1114X mutationer, vises gentamicin-induceret gennemlæsning mængder større end 0,5%, men kun L360X havde en C-rest i 4 position. Den R1114X mutationen ville derfor have været kasseret, hvis dette havde været den eneste kriterium, der anvendes til at identificere mutationer, reagerer godt til gennemlæsning inducere. Vores tilgang giver således en rationel strategi til at identificere patienter, der kan have gavn af behandling med gennemlæsning inducere.

Inddrivelse af APC biologisk aktivitet fra APC L360X cDNA efter aminoglycosid behandling

Vi derefter undersøgt, om aminoglycosid behandling inducerede detekterbare niveauer af biologisk aktivitet for en APC protein fremstillet fra et cDNA bærer L360X mutation. Aktiv APC medierer binding af beta-catenin i cytoplasmaet, hvilket således forhindrer interaktionen af ​​dette molekyle med transaktivering faktor TCF kræves til ekspression af målgener. APC-protein-aktivitet blev evalueret ved bestemmelse af evnen af ​​dette protein til at binde beta-catenin, under anvendelse af en reporterkonstruktion indeholdende TCF /beta-catenin bindingssteder indsat opstrøms for luciferase ildflue-genet (pTopGlow) [23]. I dette reportersystem, samspillet mellem aktive APC og beta-catenin resulterer i inhibering af ildflueluciferase ekspression.

DLD-1-celler mangler den funktionelle APC-protein (APC del 1 bp 1406) blev transficeret med pCMV ekspressionsvektor indeholdende enten WT eller L360X mutant APC-cDNA sammen med pTopGlow (figur 2C). Transfektion med WT APC vektor resulterede i niveauer af ildflue ekspression en tiendedel, der opnås efter transfektion med en tom vektor. Uden behandling, L360X viste tilbageværende aktivitetsniveau, sandsynligvis på grund af den ufuldstændige tab af funktion af denne allel, som residual aktivitet også er blevet påvist for mutationer i nærliggende positioner [23]. Den højeste dosis af G418 faldt luciferaseaktivitet med en faktor på 2,5, hvilket viser produktion af et funktionelt APC protein på aminoglycosid behandling. G418 undertrykt luciferaseaktivitet på en dosis-afhængig måde korreleres med gennemlæsning niveauer målt i DLD-1 celler (figur 2A). Behandling med aminoglykosider gentamicin eller amikacin, eller med negamycin udløses også undertrykkelsen af ​​luciferaseaktivitet, hvilket indikerer syntesen af ​​et aktivt APC-protein (figur 2C). For hver behandling blev protein-aktivitet korrelerede med niveauet af gennemlæsning niveau målt i dobbelt reporter-system (figur 2A og 2C). Vi brugte Spearmans parametrisk korrelation test (to-halet) for at vurdere betydningen af ​​denne sammenhæng. Vi fandt, at der var en stærk, meget signifikant korrelation (rs = -0,95, p 0,0001) mellem gennemlæsning niveau og faldet i luciferaseaktivitet. Således kan både aminoglycosid og dipeptidet negamycin kan inducere APC biologisk aktivitet fra en mutant cDNA og aktivitetsniveauet er proportional med gennemlæsning niveau. Som kontrol brugte vi pFopGlow vektor, der indeholder muteret TCF /beta-catenin bindingssteder. Med denne vektor, blev ingen signifikant ændring observeret efter aminoglycosid eller negamycin behandling (data ikke vist).

Inddrivelse af APC biologisk aktivitet fra den endogene R1114X APC-gen efter aminoglycosid behandling

Vi derefter undersøgt, om aminoglycosidet behandling af endogene nonsense mutationer giver samme resultat. LoVo celler (APC R1114X) blev transficeret med reporterplasmidet pTopGlow og venstre ubehandlet eller behandlet med G418 eller negamycin. Aktiviteten af ​​luciferase firefly reportergenet var maksimal i fravær af behandling og blev sat til 100%, hvilket afspejler den manglende aktivitet af APC-proteinet. Behandling med negamycin og G418 faldt pTopGlow ildflueluciferaseaktivitet, til 50% og 18% referenceværdien, henholdsvis (figur 2D). Aktivitetsniveau blev korreleret med gennemlæsning effektivitet (figur 2B). Overraskende, gentamicin behandling trods fremme niveauer af gennemlæsning ligner dem opnået med negamycin, ikke faldt pTopGlow ildflueluciferaseaktivitet (data ikke vist). Således gennemlæsning effektivitet er ikke den eneste faktor til genopretning af fuld længde protein-aktivitet. Faktisk PTC gennemlæsning svarer til inkorporering af en nær-beslægtet aminoacyl tRNA [24], [25], [26], [27] (supplement til to af de tre nukleotider af et stop codon), potentielt resulterer i udskiftning af den normale rest af en aminosyre uforenelig med stabiliteten eller aktiviteten af ​​proteinet i fuld længde [10]. Det er muligt, at forskellige aminosyrer er inkorporeret i stedet for stopcodonen i nærvær af disse to lægemidler, med kun negamycin behandling, der fører til inkorporeringen af ​​(en) aminosyre (r) er forenelig med den biologiske aktivitet af proteinet. kan denne situation opstå på grund af de forskellige former for aktivitet af disse stoffer: aminoglycosider synes udelukkende at binde til dekodning center [28], hvorimod negamycin har vist sig at binde ikke kun til den A-stedet af den lille ribosomale underenhed [9], men også til væggen af ​​det vordende kæde exit tunnel af den store ribosomale underenhed [29]. Vi kunne derfor forvente, at delmængde af naturlige suppressor tRNA’er udvalgt til at være anderledes efter aminoglycosid og negamycin behandlinger.

Som for de andre testede mutation, luciferaseekspression fra pFopGlow huser muteret TCF /beta-catenin bindingssteder blev ikke signifikant påvirket ved behandling med antibiotika (data ikke vist). Vi kontrolleret, at aktiv APC protein var faktisk ansvarlig for den observerede fald i ildflue luciferase udtryk, ved hjælp af en siRNA specifikt rettet APC mRNA. Vi først brugt RT-PCR at kontrollere, at siRNA effektivt faldt APC mRNA-niveauer (figur 2E). LoVo-celler blev cotransficeret med pTOPGlow reporterplasmidet og siRNA målretning eller ikke målretning APC.

Efter G418 behandling (200 ug /ml), APC-targeting siRNA gav et fald i luciferaseaktivitet to gange lavere end observeret i fravær af siRNA, mens den ikke specifikke siRNA havde ingen virkning på luciferase hæmning (figur 2D). Således blev virkningen på reporter-system detekteres specifikt i nærvær af APC-mRNA hvilket indikerer, at den er medieret af et aktivt APC-protein.

I disse to mutanter, undersøgte vi evnen af ​​aminoglycosid behandling for at genoprette produktionen af fuld-længde APC-protein. Vi var i stand til at detektere fuldlængde APC-protein i HeLa-celler (APC WT), men dette protein var ikke spores efter lægemiddelbehandling i enten LoVo celler (R1114X) eller DLD-1 celler transficeret med L360X cDNA (figur 3). Denne mangel på detektion var sandsynligvis på grund af begrænsninger i teknikken til at påvise små mængder af en stor (311 kDa) protein. Disse resultater antyder, at lave niveauer af APC-protein kan være tilstrækkelig til at regulere aktiviteten af ​​TCF /beta-catenin transkriptionel kompleks.

LoVo celler forblev ubehandlede eller blev behandlet med G418 (200 ug /ml) i 72 timer. Western blots blev probet med FE-9 antistof rettet mod den N-terminale ende af APC. De trunkerede former svarende til de muterede alleler er til stede i LoVo-celler er angivet med pile. Et uddrag fra HeLa-celler (APC WT) blev anvendt som en kontrol; et bånd blev detekteret ved 311 kDa.

Konklusion

I denne undersøgelse undersøgte vi evnen hos gennemlæsning-inducerende molekyler for at inducere produktion af et funktionelt APC-protein i celler, der bærer forskellige nonsense mutationer i APC-genet. Biologisk aktivitet blev påvist for de to nonsense mutationer mest reagerer på aminoglycosid behandling (R1114X og L360X) og denne aktivitet var direkte proportional med de gennemlæsning niveauer målt med et dobbelt reporter system. Denne undersøgelse viser, at gennemlæsning induktorer som aminoglycosid og negamycin kan genaktivere APC tumorsuppressorgen i cancerceller. Det giver en rationel strategi til at identificere patienter, der kan reagere og derfor mere tilbøjelige til at have gavn af behandling med gennemlæste inducere. En nylig undersøgelse har givet proof-of-princippet om, at re-ekspressionen af ​​en fuld-længde APC protein efter behandling med gennemlæsning inducere reducerer tumorstørrelse i en xenograft mus [12]. Desuden har vi for nyligt vist, at behandling af celler, der bærer en nonsense mutation i p53 tumorsuppressorgenet fører til re-ekspression af et protein i fuld længde i stand til at udløse apoptose i tumorceller i kultur [11]. Alle disse data antyder, at molekyler, der inducerer stopkodon gennemlæsning potentielt kunne anvendes ikke blot til behandling af genetiske sygdomme, men også at sprede den eksisterende arsenal af behandlinger for cancer og som et rationelt grundlag for udvikling af nye individualiserede behandlingsstrategier.

Materialer og metoder Salg

cellelinier og cellekultur

Alle celler blev dyrket i DMEM plus GlutaMAX (Invitrogen), suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS, Invitrogen) og 100 E /ml penicillin /streptomycin. Celler blev inkuberet i en fugtig atmosfære indeholdende 5,5% CO

2, ved 37 ° C. NIH3T3 (venligst stillet til rådighed af Marc Sitbon) celler er embryonale musefibroblaster. LoVo (APC R1114X og del 1 bp 1430 venligt tilvejebragt af Françoise Praz, [30]) og DLD-1 (APC del 1 bp 1406, venligt tilvejebragt af Françoise Praz, [31]) celler er epitelceller afledt fra en human colorektal adenocarcinom. HeLa (APC WT) celler er epitelceller afledt fra en human cervix-adenocarcinom (venligst tilvejebragt af Fabrice Lejeune).

gennemlæsning kvantificering i cellekultur

Komplementære oligonucleotider svarende til sense-mutationer indlejret i deres naturlige kontekst (sekvenser i tabel 1) blev annealet og ligeret ind i pAC99 dual reporterplasmidet, som tidligere beskrevet [32]. Denne dobbelte reporter tillader kvantificering af stopkodon gennemlæsning, gennem måling af luciferase og beta-galactosidase (intern kalibrering) aktiviteter, som tidligere beskrevet [16]. De gennemlæsning niveauer af nonsense mutationer blev analyseret i nærvær eller fravær af gentamicin. NIH3T3-celler blev elektroporeret med 20 ug reporterplasmid og den følgende dag blev cellerne skyllet og frisk medium, med eller uden gentamicin, amikacin, negamycin eller G418 tilskud, blev tilsat. I disse eksperimenter blev der ikke celletoksicitet blev observeret for de doser antibiotika, som anvendes. Fireogtyve timer senere blev celler høstet og lyseret med trypsin-EDTA (Invitrogen). Beta-galactosidase og luciferaseaktiviteter blev analyseret som tidligere beskrevet [32]. Gennemlæsning effektivitet blev bedømt ved at beregne forholdet mellem luciferase til beta-galactosidase-aktivitet opnået med testen konstruktionen og normalisere det med hensyn til forholdet opnået med en in-frame kontrol konstrukt. For hver konstruktion blev udført mindst fem uafhængige transfektionsforsøg. For gennemlæsning kvantificering i DLD-1, blev den samme protokol anvendt, bortset fra at calciumphosphatmetoden blev anvendt til transfektion. For hver konstruktion, blev udført mindst tre uafhængige transfektionsforsøg.

Expression plasmidkonstruktioner

pCMV APC WT blev venligst stillet til rådighed af Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins Oncology Center Baltimore). Dirigeret mutagenese blev udført på et fragment af genet APC at skabe APC L360X nonsense mutation (pCMV APC L360X). Sekvensen af ​​re-indsatte fragment blev verificeret.

Western-blot-analyse

LoVo-celler blev behandlet med G418 (200 ug /ml) i 72 timer. Mediet blev udskiftet, og frisk antibiotika blev tilsat hver dag. Cellerne blev behandlet som beskrevet tidligere [11]. Totale proteinniveauer blev bestemt med Bradford reagens (Biorad) og ekstrakter blev denatureret ved inkubering i Laemmli-puffer i 5 minutter ved 90 ° C. Vi udsatte 100 ug totalt protein SDS-PAGE i NuPAGE Novex 3/8% Tris /Acetat færdigstøbte geler (Invitrogen). Proteiner blev overført til nitrocellulosemembraner natten over, som anbefalet af fabrikanten. Membraner blev mættet ved inkubering i 1 time i TBS suppleret med 5% fedtfri mælkepulver, og inkuberet med det primære monoklonale antistof, FE-9 (N-terminal epitopkortlægning mellem aminosyreresterne 1 og 35 i APC, Calbiochem, 1 /100). Membraner blev vasket tre gange i TBS suppleret med 1% fedtfri mælkepulver og inkuberet med det sekundære antistof (peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse-IgG (1/2500) eller alkalisk phosphatase-konjugeret anti-muse-IgG (1/7000) Promega ) i 45 minutter. De blev vasket seks gange og kemiluminescens blev påvist med ECL western blotting-påvisningsreagenser (Amersham, GE Healthcare).

Protein aktivitetsassays

Den biologiske aktivitet af APC blev anslået med pTOPGlow vektoren (venligt leveret af Dr. Marc Van de Wetering, Universitetshospital Utrecht, Holland).

DLD-1 celler blev cotransficeret med pCMV L360X (4 pg), pTOPGlow eller pFOPGlow (10 ug) og pCMVLacZ (2 ug) ved calciumphosphatmetoden. Hver DNA-præcipitatet blev delt mellem to brønde i en seks-brønds plade. Antibiotika (10 ug /ml til 200 ug /ml G418, 800 ug /ml gentamicin, 2 mg /ml amikacin; 1 mg /ml negamycin) blev tilsat umiddelbart efter transfektion, bortset G418, som blev tilsat dagen efter. Mediet blev erstattet dagligt og friske antibiotika blev tilsat. Vi forberedt proteinekstrakter 48 timer efter transfektion og målte enzymatiske aktiviteter

I LoVo celler, antibiotika. (G418 i koncentrationer på 50, 100 og 200 ug /ml; 1 mg /ml negamycin) blev tilsat dagen før transfektion og på hver efterfølgende dag. LoVo-celler blev cotransficeret ved calciumphosphatmetoden, med TOPGlow eller FOPGlow (10 ug) og pCMVLacZ (2,8 ug) for at normalisere for transfektionseffektivitet, cellelevedygtighed og protein ekstraktion variabilitet. Hver DNA-præcipitatet blev delt mellem to brønde i en seks-brønds plade. Tre dage efter transfektion blev proteinekstrakter fremstilledes og enzymatiske aktiviteter blev målt.

For hver cellelinje, blev udført mindst tre uafhængige transfektionsforsøg.

siRNA transfektioner

LoVo celler, protein-aktivitet blev bestemt som beskrevet ovenfor. Celler blev transficeret med siRNA rettet mod mRNA APC (Dharmacon ON-TARGET plus J-003.869-12) eller NS, nontargeting (Dharmacon ON-TARGET plus styre siRNA # 1), i overværelse af DharmaFECT Duo (Thermo Scientific 1.3 ug siRNA pr brønd af en seks-brønds plade), 24 timer efter deres oprindelige transfektion som beskrevet ovenfor. Transficerede celler blev straks inkuberet i medium med eller uden G418 (200 ug /ml) tilskud. Tre dage efter transfektion blev cellerne høstet, og luciferase og beta-galactosidase aktiviteter blev analyseret som beskrevet ovenfor. blev udført mindst fire uafhængige transfektionsforsøg.

Tak

Vi vil gerne takke alle medlemmer af laboratoriet og Mounira Amor-Guéret (Institut Curie, CNRS, Orsay) til nyttige diskussioner. Vi takker også Julie Frugier til teknisk bistand.