PLoS ONE: Diagnostiske og prognostiske Utility af en DNA hypermethyleret Gene Signatur i prostatakræft

Abstrakte

Vi havde til formål at identificere en prostatakræft DNA hypermethylering microarray signatur (betegnet PHYMA), der adskiller prostatacancer fra godartet prostatahyperplasi (BPH), høj fra lav kvalitet og dødbringende fra ikke-dødelige kræftformer . Dette er et ikke-randomiseret retrospektiv undersøgelse i 111 lokale asiatiske mænd (87 prostatakræft og 24 BPH) behandlet 1995-2009 i vores institution. Archival prostata epitel var laser-capture mikrodissekeres og genomisk DNA ekstraheret og bisulfit-konverteret. Prøverne blev profileret hjælp Illumina GoldenGate Methylering microarray, med rå data behandlet af GenomeStudio. En klassifikation model blev genereret under anvendelse support vektormaskine, der består af en 55-probe DNA-methylering underskrift 46 gener. Modellen blev uafhængigt valideret på en intern test datasæt, som gav kræft afsløring sensitivitet og specificitet 95,3% og 100% med henholdsvis samlede nøjagtighed af 96,4%. Anden validering på en anden uafhængig vestlige kohorte gav 89,8% følsomhed og 66,7% specificitet, med samlede nøjagtighed af 88,7%. En PHYMA score blev udviklet til hver prøve baseret på tilstanden af ​​methylering i PHYMA signatur. Stigende PHYMA score var signifikant forbundet med højere Gleason score og Gleason primære kvalitet. Mænd med højere PHYMA scoringer har dårligere overlevelse på univariate (p = 0,0038, HR = 3,89) og multivariate analyser, når styret for (i) klinisk fase (p = 0,055, HR = 2,57), og (ii) klinisk fase og Gleason score ( p = 0,043, HR = 2,61). Vi yderligere udført bisulfit genomisk sekventering på 2 relativt ukendte gener til at demonstrere robusthed analyseresultater. PHYMA er således en signatur med høj følsomhed og specificitet for kræsne tumorer fra BPH, og har en potentiel rolle i tidlig opsporing og forudsige overlevelse

Henvisning:. Goh LK, Liem N, Vijayaraghavan A, Chen G, Lim PL, Tay KJ, et al. (2014) Diagnostiske og prognostiske Utility af en DNA hypermethyleret Gene Signatur i prostatakræft. PLoS ONE 9 (3): e91666. doi: 10,1371 /journal.pone.0091666

Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: Marts 20, 2013; Accepteret: 13 februar 2014; Udgivet: 13 marts 2014

Copyright: © 2014 Goh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret af National Medical Research Council Singapore (NMRC NIG /0033/2008) til HGS, Khoo Discovery Awards (KDP /2008/0002 og KDP /2009/0006) og Duke-NUS Signature Research Program fase 1 finansieret af agenturet for videnskab, teknologi og forskning (A * STAR), og Sundhedsministeriet, Singapore, at LKG. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest indfaldende kræft i USA med en anslået nye 238,590 diagnoser (153 tilfælde pr 100.000 per år). Som en dødsårsag, anslås det, på kun 29.720 tilfælde (12%) [1]. Denne uoverensstemmelse ses også i Singapore, Japan og Korea, hvor forholdet mellem forekomst til dødelighed er ca. 0,2 [2] og er stort set blevet tilskrevet overdreven diagnose af klinisk ubetydelige prostatacancere som følge af udbredt prostataspecifikt antigen (PSA ) test.

stigningen i påvisning af tidlig prostatakræft er ikke blevet ledsaget af nøjagtig bestemmelse af risiko for sygelighed og dødelighed. Dette har resulteret i over-behandling i nogle mænd og under behandling i andre. Gleason sortering, en energibesparende mikroskopisk evaluering af prostatakræft arkitektur beskrevet i 1966 af Donald Gleason, er forblevet grundpillen for prostatakræft prognosticering [3], [4]. Men klassificeringssystem, er underlagt inter-observatør forskelle og mangler præcision i prognosticering tidlige fase prostatacancer, som i stigende grad diagnosticeret [5], [6]. Det er blevet delvis behandlet af ændringer [7], inddragelse af tertiære scores [8], og brug af kliniske nomogrammer [9]. Markant fase migration til 80% af prostatakræft bliver diagnosticeret på et organ-indesluttede langt er sløvet effektiviteten af ​​disse værktøjer ved punktet for diagnosen. Aktiv overvågning, en strategi for selektivt at forsinke radikal behandling i meget lav risiko tidlig prostatakræft, indebærer hyppige opfølgning og årlige prostata biopsier – en kilde til betydelig angst og omkostninger [10]. Mens andre blod og væv biomarkører til prognosticate prostatakræft er i udvikling, nogle af dem er blevet grundigt valideret og ingen af ​​dem er i klinisk anvendelse [11].

Epigenetisk ændringer, som involverer mekanismer, der igangsætter og vedligeholder arvelige mønstre af genekspression uden at ændre sekvensen af ​​genomet, er en proces med flere lag af kompleksitet [12]. Disse omfatter histon modifikationer, kromatin remodeling, nukleosom belægning og DNA methylering. Af disse mekanismer, DNA-methylering er den mest velbeskrevne og undersøgt. Promotor hypermethylering og deraf følgende transkriptionel lyddæmpning har vist sig at være udbredt og er forbundet med hundredvis af gener i næsten alle kræftformer og har vist sig som et vigtigt indsatsområde for epigenetisk forskning [12], [13], [14]. Beviser fra tidligere undersøgelser har knyttet promotor hypermethylering af specifikke gener til patogenese og tumor progression i prostatakræft, f.eks

APC, RARa

, og

GSTP1

[15]. Men disse undersøgelser fokuseret på udvalgte methylerede gener snarere end global gen methylering, som begrænser sensitivitet og specificitet for diagnose og prognose. En diagnostisk eller prognostisk signatur involverer flere gener kan forbedre diskriminerende magt. Selvom molekylær signatur fra genekspression arrays viste lovende sensitivitet (93-97%) og specificitet (87-100%) [16], [17], stabiliteten af ​​DNA-materiale gør hypermethylering signatur en mere farbar vej, især for arkiverede paraffin- indlejrede vævsprøver. Mens en række undersøgelser har udnyttet genom bred methylering arrays [18], [19], [20], [21], [22], er resultaterne stadig begrænset til kandidatgener nærmer. Hurtige fremskridt i epigenetik har muliggjort udviklingen af ​​højkapacitetsmetoder at analysere methylering mønstre af prostatakræft gener for at belyse molekylære signaturer, der kan være surrogat for Gleason grading system.

Vores mål var at identificere unik global gen hypermethylering ændringer, der var kræft-specifikke og det ville diskriminere forskellige prostatakræft fænotyper. Vi brugte high-throughput DNA methylering microarrays og analyseret et stort antal gen loci i humane prostatakræft væv med målene for at identificere diagnostiske DNA hypermethylering signatur, der adskiller prostata (BPH), lav kvalitet og høj kvalitet prostatakræft med henblik på at skelne dødbringende fra ikke-dødelige prostatakræft.

Materialer og metoder

Study design og Patient inklusion

Godkendelse til denne undersøgelse blev leveret af SingHealth Centraliseret institutionelle Review Board B (godkendelsesnummer CIRB # 32B /2007). Behovet for samtykke blev givet afkald af gennemgangen bestyrelse på baggrund af den tilbagevirkende kraft af undersøgelsen og lange arkivers periode af de involverede væv.

Dette er et ikke-randomiseret retrospektiv undersøgelse af gen hypermethylering i prostatacancer og godartet prostatahyperplasi (BPH). Tilfælde af prostatakræft blev stratificeret baseret på scenen og lønklasse. Klinisk og patologisk iscenesættelse blev udført ved hjælp af 2007 AJCC TNM mellemstationer og histologiske sortering var baseret på Gleason klassificeringssystem [7].

Paraffin indlejret arkivering væv af lokale asiatiske befolkning blev opnået fra enkelt institution (Singapore General Hospital) . Væv til kræfttilfælde blev opnået fra patienter med tidlig klinisk lokaliseret prostatacancer og avancerede metastatisk prostatakræft. Væv fra førstnævnte gruppe blev opnået fra mænd, der gennemgik radikal prostatektomi; væv fra sidstnævnte gruppe blev opnået fra mænd, som gennemgik transuretral resektion af prostata og bilateral orchiektomi samtidig. Regional lymfeknude metastaser blev opdaget af maven-bækken CT og MR scanninger og knoklet metastatisk sygdom blev bekræftet ved positiv technetium

99 knogleskanninger. Patienter, som gennemgik stråling eller androgen deprivation terapi før transuretral resektion blev ikke inkluderet. BPH sager blev opnået fra transuretral resektion hos mænd med benign prostata udvidelsen og PSA 4 ng /ml pre-operativt og godartet status blev bekræftet histologisk. Kontrol væv blev opnået fra BPH, som BPH er almindelig i den kohorte, mænd er modtagelige for prostatakræft, og det er stadig den mest almindelige differentialdiagnose i disse mænd. Vi brugte ikke tilstødende normale væv hos mænd med prostatakræft at undgå mulige felt ændre virkninger [23].

Prøvetagning

Karakteren og stadium af hver prøve blev først bekræftet under hæmatoxylin og eosinfarve af patologen. Cancer rige områder var mærket og prostata epitel isoleret ved laser capture mikrodissektions teknikker under anvendelse af Zeiss P.A.L.M. systemet (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Tyskland). Patient demografiske og tumor-profil, herunder alder, præ-operativ PSA-niveau, klinisk og patologisk stadium, og patologisk Gleason kvalitet blev opnået. Varigheden af ​​opfølgning, og tid til biokemisk recidiv og kræft dødelighed blev registreret.

DNA Udvinding og Sample Profilering

Genomisk DNA blev ekstraheret ved hjælp af 300 pi fordøjelse bufferopløsning (50 mM Tris HCI, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20) med 20 pi proteinase K (20 mg /ml, Qiagen, Valencia, CA). Prøverne blev inkuberet ved 55 ° C i 48 timer i en roterende ovn. Proteinase K blev inaktiveret efter inkubation ved 94 ° C i 10 minutter og centrifugeret kort i 5 minutter ved 260

g

. Mængden af ​​ekstraheret DNA blev vurderet ved realtids-PCR som tidligere beskrevet [24]. For at optimere DNA konvertering og reducere variation mellem prøver, 500 nanogram af genomisk DNA var bisulfit-omregnet ved hjælp af EZ DNA Methylering kit (Zymo Research, Orange, CA) i henhold til producentens anbefalinger. Omdannelse med bisulfit af genomisk DNA resulterer i ikke-methyleret cytosin omdannes til uracil, mens methylerede cytosiner forbliver uændrede. Prøverne blev derefter profileret på Illumina GoldenGate BeadArray henhold til producentens specifikationer. Kort fortalt, bisulfit-konverterede DNA undergår hybridisering til allelspecifik oligonukleotid og locus-specifikke oligonukleotid, der er afhængig af C /T-polymorfisme ved hvert CpG site. Fluorescensmærkede PCR-primere af Cy3 blev anvendt til at amplificere ikke-methyleret template-DNA, hvorimod Cy5 mærkede primere blev anvendt til at amplificere methyleret template-DNA. Intensiteten af ​​de 2 fluorescenssignaler blev analyseret på en Sentrix Array Matrix, og niveauet af methylering på CpG-locus blev målt ved β-værdi, hvor β = [max (Cy

5 fotos, 0)] /(