PLoS ONE: Mekanisk Stress nedregulerer MHC klasse I ekspression på menneskelige kræftceller Membrane

Abstrakt

I vores krop celler kontinuerligt udsættes for fysiske kræfter, der kan regulere forskellige cellefunktioner såsom celledeling, differentiering og død . I dette arbejde anvendte vi to forskellige strategier for mekanisk stress cancerceller. Den kræft og raske cellepopulationer blev behandlet enten med mekanisk spænding leveret af en mikropumpe (fremstillet ved dyb røntgen nanolithography) eller ved ultralyd bølge stimuli. Der blev set en specifik nedregulering af Major Histocompatibility Complex (MHC) klasse I-molekyler ekspression på kræft cellemembranen i forhold til forskellige former for raske celler (fibroblaster, makrofager, dendritiske og lymfocytceller), stimulere cellerne med kræfter i området nano -newton, og tryk mellem 1 og 10 bar (1 bar = 100.000 Pascal), afhængig af de anordninger, der anvendes. Desuden Raman spektroskopi analyse, efter mekanisk behandling, i området mellem 700-1800 cm

-1, indikerede en relativ koncentration variation af MHC klasse I. PCA-analyse blev ligeledes udført for at skelne kontrol og stressede celler i forskellige cellelinier. Disse mekaniske inducerede fænotypiske ændringer øger tumor immunogenicitet, som afsløret af den tilhørende øget modtagelighed for Natural Killer (NK) celler cytotoksisk anerkendelse

Henvisning:. La Rocca R, Tallerico R, Talib Hassan A, Das G, Tadepally L, Matteucci M, et al. (2014) Mekanisk Stress nedregulerer MHC klasse I ekspression på humane Cancer cellemembranen. PLoS ONE 9 (12): e111758. doi: 10,1371 /journal.pone.0111758

Redaktør: Laurent Kreplak, Dalhousie University, Canada

Modtaget: 17. april, 2014 Accepteret: September 30, 2014; Udgivet: 26 December, 2014

Copyright: © 2014 La Rocca et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Ennio Carbone arbejde er blevet støttet af en UICC International Cancer Technology Transfer Fellowship, give AIRC-IG 10189, og give AIRC 15521. Rossana Tallerico er en post Doc tildeles af treårige stipendier “Luciana Selce” FIRC. Giovanni Cuda er blevet støttet af PON01_02834 Prometeo (Ministeriet for Uddannelse og Forskning) og PONa3_00435 Biomedpark @ UMG (ministeriet for uddannelse og forskning). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

I naturen celler kontinuerligt udsættes for fysiske, kemiske og biologiske belastninger. I fortiden, var fysiske forandringer i patologiske væv taget i betragtning af de læger som værdifulde diagnostiske indikatorer. Fysisk stress er involveret i patofysiologien af ​​adskillige humane sygdomme, såsom inflammation og cancer. I begge tilstande, er en ændring i den kemiske-fysiske ekstracellulær matrix (ECM) miljøet i forbindelse med patogenesen af ​​disse sygdomme. Desuden fysiske kræfter spiller en væsentlig rolle i metastaserende progression. I de seneste år, nye redskaber, såsom atomic force mikroskopi, er blevet udviklet til at analysere ændringer i celler elasticitet relateret til fysiske ændringer i den ekstracellulære matrix rum [1]. Endvidere at bestemme, hvor meget en celle kan deformeres, en enhed kaldet “optisk båre” blev udviklet [2]. I modsætning til andre værktøjer, er den optiske båre baseret på en dobbelt-stråle optisk fælde [3], [4], hvori to modstander og identisk laserstråler fælde en celle i midten. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at måle de elastiske og kontraktile egenskaber af mange celler, som det er kendt, at cellens evne til at optage er meget vigtigt for migration og proliferation [5]. Endvidere kan elasticitet og kontraktilitet af forskellige tumorceller ændre sig med udviklingen af ​​sygdommen, med en forøget elasticitet af kræft i forhold til de raske celler [6]. En relation mellem ECM stivhed og tumor transformation er blevet beskrevet [7]. Det er blevet vist, at ECM-medieret isometriske kræfter føles af integriner, som regulerer phosphorylering af mekanisk-transducer kinaser, såsom ERK og Rho [8]. Det er også blevet påvist, at tilvæksten af ​​exogene kræfter føre til en øget celleproliferation sats og inducere tumor-lignende fænotypiske ændringer. Endelig er inflammatorisk brystcancer vides at udøve en mekanisk belastning på grund af ECM ændringer, der kan føre til et højere metastatisk potentiale [9].

På dette grundlag vi den hypotese, at mekanisk belastning enten kan påvirke ekspressionen af celle antigener eller inducere ekspressionen af ​​stress-inducerbare molekyler, såsom NKG2D receptorligander [10] i stand til at prime cytotoksiske effektor lymfocytter cellefunktioner.

i de sidste år opdagelsen af ​​immunoreceptors genkender stress inducerbare proteiner har udvidet vores viden om, hvordan immunsystemet primes [11], [12]. Disse observationer har fremmet vores interesse i kontrollerede stress afgivelsesindretninger, der kunne fremkalde en tumor immunogent fænotype i stand til at fremkalde et immunrespons, især når tumoren allerede er redigeret af cytotoksiske lymfocytter [13].

naturlige dræberceller er potente cytotoksiske lymfocytter kunne genkende frisk eksplanterede cancerceller [14] – [16] og til spontant lyserer visse tumormål [17] – [19]. De er reguleret af en hårfin balance mellem hæmmende receptorer erkendelse selv MHC klasse I molekyler, og aktivering receptorer for stress-inducerbare molekyler [20]. NK-celler har evnen til at identificere og dræbe viralt inficerede og maligne celler og samtidig skåne normale celler. NK celler forordningen Den var dårligt forstået, indtil slutningen af ​​1980’erne, da de “manglende selv” hypotese blev foreslået [21]. Ifølge denne hypotese, nedregulering af MHC klasse I molekyler under viral infektion eller malign transformation udløser NK-aktivering.

Her vi spørger, om behandlingen af ​​NK resistente kræftceller ved mekanisk belastning kunne tippe balancen mellem hæmmende og aktiverende tumor udtrykker molekyler til fordel for sidstnævnte, hvilket fører til NK-celleaktivering. I dette arbejde, vi brugte to forskellige procedurer for mekanisk stress kræft og normale celler under kontrollerede forhold. Vi sammenlignede de biologiske virkninger af mekaniske stimuli leveret enten af ​​en mikropumpe anordning udtrykkeligt udviklet til dette formål [22], til dem, der leveres af en chokbølger puls udstyr. Variationen i MHC klasse I molekyler før og efter mekanisk belastning blev overvåget både ved hjælp af Raman spektroskopi (i kombination med principal komponent analyse (PCA)) og ved hjælp af cytotoksiske målinger. Det ultimative mål for vores undersøgelse var at forstå, hvis de anvendte mekaniske kræfter kunne fremkalde og /eller modulere relevante biologiske celle funktioner, såsom deres immunogenicitet. Desuden undersøgte vi muligheden for at anvende adoptivt mekaniske manipulationer toswitch en tumor NK celle resistent fænotype i en modtagelig én.

Materialer og metoder

Mikropumpe enhed

At levere mekanisk belastning til tumorcellepopulationer anvendte vi en tidligere beskrevet mikropumpe [22] (S1A fig.) fremstillet ved hjælp ofdeep røntgen litografi (DXRL) teknik til specifikt behandle eukaryote celler uden at ødelægge dem. Tre millioner celler /ml blev mekanisk understreget i 1 time ved 48 cyklusser og styrken af ​​det maksimale tryk påført var omkring 10 bar. Dette blev vurderet ved måling prævalens pumpen ved anvendelse af vand som en væske. Derefter blev cellerne opsamlet i et 15 ml rør og blev analyseret ved flowcytometri og mikro Raman spektroskopi.

chokbølger enhed

Shock bølger anvendes i ortopædi og er i det væsentlige akustiske bølger med en mekanisk effekt. Når chokbølger passere gennem en væske, skaber trykforskelle er ansvarlige for dannelsen af ​​gasbobler (kavitation), der er berørt af de efterfølgende chokbølger og deformeret indtil implosion. Asymmetrisk kollaps af boblen forårsager dannelsen af ​​en vandstråle “jetstrøm”. Dette fænomen yderligere forbedrer den mekaniske virkning af chokbølgen forårsager mikro-læsioner, hvis størrelse er en funktion af antallet af pulser og flux af energi. Til behandling af tumorcellelinier blev brugt

Swiss Dolorclast enhed

(Electro Medical System-EMS, Italien) med en hånd-stykke high-energi (S1B Fig.).

Kræftceller blev dyrket i petriskåle og behandlet med chokbølger (500 skud) anvender en flux af energi på 1 bar. Efter behandling blev cellerne indsamlet og analyseret, og de opnåede data blev sammenlignet med de respektive kontroller.

Celler isolation og kultur

For stress eksperimenter mekaniske vi brugte forskellige former for cellelinjer. Primære celler Mel 59c, Mel 42a, Mel 42b, Mel 66b, Mel 137a og Mel 103b blev opnået fra frisk eksplanteret melanom hud metastatiske celler med få in vitro passager henholdsvis fra patienter 59, 42, 66, 137 og 103. Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og den etiske komité II i Heidelberg University (0.198,3 /2002). Sunde donorer PBL og relaterede rensede NK-celler blev genereret i overensstemmelse hermed med den etiske komité af University Magna Graecia of Catanzaro (49/2003). Undersøgelsen blev godkendt af UMG etiske komité (49/2003). Human nyre carcinom cellelinie (293T), human B lymfoblastoid cellelinie (IM9), og fibroblastceller blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Perifere blodlymfocytter (PBL’er) blev opnået fra raske donorer ved Ficoll-Paque (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) densitetsgradientcentrifugering de humane prøver blev indsamlet i overensstemmelse hermed med den etiske komité af University Magna Graecia of Catanzaro (49/2003). Celler blev dyrket i RPMI 1640 medium og i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma-Aldrich, St. Louis) og penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (100 mg /ml ) (Sigma-Aldrich, St. Louis) og blev holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Makrofager og dendritiske celler (DC) blev opnået fra mononukleære blodceller. Makrofager blev genereret fra monocytter vedhængende på pladen. Dendritiske celler (DC) blev etableret fra monocytter suppleret i 7 dage med 50 ng /ml granulocyt /makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA) og 1000 U /ml IL-4 [23] .

Natural Killer celle rensning

NK-celler blev opnået som beskrevet [24]. Kort fortalt blev humane NK lymfocytter oprenset fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), opnået fra raske donorer ved Ficoll-Paque densitetsgradientcentrifugering under anvendelse af NK Cell Isolation Kit og Vario MACS for udtømning af ikke-NK-celler (Miltenyi Biotec). Celler blev resuspenderet i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS, 3% humant serum, penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (100 ug /ml) og blev anvendt til cytotoksicitet assay. NK-celle renhed var mindst 95%.

Raman Spektroskopi

Microprobe Raman spektre blev ophidset af nær-IR-laser med 830 nm laser linje ved stuetemperatur (RT) i tilbagespredning geometri gennem en 100X mål (

NA

= 0,95) af Leica mikroskop (Model – DMLM). Alle data blev indsamlet med en laser effekt på 70-130 mW. Lasereffekten var altid valgt på en sådan måde for at undgå skader af celle. forventes ikke Denne laser magt til at forårsage nogen væsentlig stigning i prøvens temperatur på grund af den ekstremt lave absorptionskoefficient af celler på 830 nm. Desuden blev de celle-betingelser verificeret ved optisk billede før og efter målingerne. Adskillige celler af hver cellelinie blev probet i området fra 700-1800 cm

-1 ved punkt kortlægning målinger, der indsamler forskellige spektre ved forskellige placering dækker hele celleoverfladen. For hver cellelinie 5-celler blev tilfældigt valgt til punkt kortlægning. Raman spektre af forskellige celler af hver cellelinjer blev derefter opsamlet og anvendt til statistisk analyse (Spectra viser ikke signifikant forskellige fra hinanden [25], [26]). Den statistiske analyse (med standardafvigelse fejl) blev udført i 10 Raman spektre for hver cellelinie. Det er bemærkelsesværdigt at påpege det, at målingerne for kontrol og stressede celler af hver cellelinje blev udført på samme dag for at undgå enhver variation i instrumental respons. Spectral udjævning blev udført for alle individuelle Raman spektre ved hjælp af tråden 2.0 PS9 software følger med Renishaw Raman spektrometer. Kurvetilpasningsproceduren af ​​spektrene blev udført under anvendelse kombineret Gaussisk og Lorentz-funktion.

Principal Component Analysis

I det sidste årti multivariate teknikker er ofte blevet anvendt til analyse af store Raman datasæt [27] , [28]. Blandt disse teknikker, har principal komponent analyse (PCA) vist sig at være en af ​​de mest robuste og pålidelige metoder [29], [30]. Når PCA anvendes på Raman spektre, er hver Raman frekvens betragtes som en variabel, hvis værdi ændringer i hele indspillede spektre, således at hele datasættet udgør en

N

dimensionale rum, hvor

N

er antallet af målte frekvenser (

N

er typisk meget store). Hovedformålet med PCA er dimensionalitet-reduktion uden tab af information. Dette opnås gennem diagonalisering af kovariansmatricen af ​​spektre: egenvektorerne definerer endimensionale (1D) akser i

N

-space og de tilsvarende egenværdier udtrykker mængden af ​​total varians forklaret af hver egenvektor. Egenvektorerne er de såkaldte hovedkomponenter (PC’ere), mens egenværdierne navngives latente. Den første principale komponent er 1D akse, langs hvilken den største mængde af varians tages i betragtning (dvs. aksen med den største latent værdi); den anden hovedkomponent er aksen (vinkelret på den første), som udgør den største tilbageværende varians (dvs. aksen med den næststørste latente), og så fremdeles for de følgende komponenter. På denne måde, fra en

N

-Variable datasæt vi er reduceret til et par-variable datasæt, uden at miste betydelig del af oplysningerne. PCA-analyse blev udført under anvendelse af software udviklet af P. Candeloro et al. [31].

immunofluorescensbestemmelse

Efter hver behandling blev cellerne opsamlet i rør og blev inkuberet med humant serum i 15 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev cellerne vasket tre gange i PBS 1X og efterfølgende inkuberet i 30 minutter i mørke ved 4 ° C, med følgende mAb’er: W6 /32 (anti-MHC klasse I, IgG2a; BioLegend, San Diego, CA); klon BAM 195 (anti-MICA, IgG1) og mAb 6D4 (anti-MICA /B, IgG1), blev venligst stillet til rådighed af Veronika Groh (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA); M295 (anti-ULBP1, lgG1), M310 (anti-ULBP2, lgG1), M550 (anti-ULBP3 IgG3) og M478 (anti-ULBP4, lgG1) blev venligst Givet af D. Cosman, (Amgen Inc. Seattle, WA ); mAb L95 (anti-PVR, IgG1) og mAb L14 (anti-nectin-2, IgG2a) venligst stillet til rådighed af A. Moretta (University of Genova, Genova, Italien). Efter to gange vask blev celler farvet med det sekundære mAb’er FITC gede anti-mus IgG (Jackson Immuno Research, Baltimore, USA) i 30 minutter ved 4 ° C i mørke. Derefter blev cellerne igen vasket to gange og analyseret ved FACSCalibur flowcytometri (BD Bioscience, San Diego, CA, USA). Til intracellulær farvning blev celler fikseret i Cytofix og permeabiliseret ved Cytoperm (BD Biosciences). Cellerne blev farvet med de specifikke mAb’er efterfulgt af FITC-konjugeret anti-muse-IgG-antistoffer (Jackson Immuno Research, Baltimore, USA) og blev analyseret. Resultaterne blev analyseret ved hjælp af Cell Quest (BD Biosciences) eller FlowJo softwareversion 9.3.1.

cytotoksicitet assay

For cytotoksicitetsassays den tumor eller raske celler som mål og NK-lymfocytter som effektor celler blev anvendt. Efter mekanisk belastning behandling blev målcellerne inkuberet med det fluorescerende CFDA (carboxyfluorescein-diacetat, Life Technologies, NY, USA) i 30 minutter ved 37 ° C, derefter vasket to gange og inkuberet med NK-celler i tre timer i inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2. Detaljerne i den protokol, blev beskrevet fra McGinnes et al [32]. Flowcytometret blev brugt til at analysere prøverne.

Real Time

I alt cellulære RNA fra fire forskellige melanom primærelementer og to raske celler blev isoleret ved hjælp Trizol (Life Technologies).

Kort fortalt, 1 ug totalt RNA revers transkriberet under anvendelse af Superscript III Reverse Transcript Kit (Life Technologies) ifølge producentens anbefalinger; cDNA’erne blev amplificeret under anvendelse iTaq Universal SYBER Green Supermix (BioRad, Segrate (MI), Italien) i nærvær af specifikke primere som tidligere [33] beskrevne. Følgende primere blev anvendt: MHC-I- FW, 5’CCTTGTGTGGGACTGAGAGG -3; MHC-I-RV, 5’CAGAGATGGAGACACCTCAGC 3 ‘. Ekspressionen af ​​housekeeping-gen glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt til at normalisere prøver, og den relative kvantificering af HLA klasse I blev udført anvendelse af 2

-ΔΔCt metode [34]. Følgende primere blev anvendt: GAPDH-FW, 5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3 ‘, GAPDH-RV 5′-TCACGCCACAGTTTCCCGGA -3’ Salg

Western Blotting

sekretionen af ​​MHC klasse I molekyler. i det konditionerede medium blev bekræftet ved Western blot analyse. Til Western blotting blev cellerne dyrket i 100 cm skåle vasket med 0,1 M phosphat-pufret saltvand (pH 7,4) (Life Technologies), og derefter blev 2 ml serumfrit RPMI tilsat. Efter stress behandling, blev mediet høstet. Celler medium proteiner koncentration for hver stressede prøve blev målt i tre eksemplarer ved anvendelse af farvestof-bindende protein (Bio-Rad) med humant serumalbumin (Life Technologies) som standardkurve.

For hvert eksperimentelt punkt, 50 ug celle -kultur mellemstore proteiner blev overført til sterile rør indeholdende kold acetone (20%, vægt /volumen) og udfældet i 30 minutter på is, efterfulgt af centrifugering ved 15.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C.

supernatanten blev dekanteret, og pelleten vasket med afkølet acetone efterfulgt af fjernelse af al acetone. Pelleten blev efterfølgende opløst i LB [31,25 mmol /l Tris-HCI (pH 6,8), 1,25% SDS, 6,25% glycerol, 0,06% bromphenolblåt, og 5% h-mercaptoethanol], opløst ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Salg

Efter tilsætning af det blokerende blandingen [5% (w /v) mælk i PBS (pH 7,4) og 0,05% Tween 20] blev membranen inkuberet med en 1:100 fortynding af muse anti -HLA antistof, klon W6 /32 (BioLegend,). Signalet blev påvist med anti-muse peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (1:5000; Santa Cruz Biotechnology). Membranen blev udviklet af forøget kemiluminescens-Western blot-påvisningsreagenser ifølge producentens instruktioner (Santa Cruz Biotechnology).

membranen blev inkuberet med Ponceau S rød farvningsopløsning (Sigma-Aldrich) for at sikre ensartet gel loading. blev ikke anvendt, fordi det er dybest set umuligt at finde en “housekeeping” protein i serumfrit medium celler, som kunne anvendes som en konstant henvisning en intern kontrol. Ponceau S med fordel kan anvendes i løbet af actin detektion for kvalitet eller lig belastning kontrol i Western blotting; Desuden har den en yderligere fordel, dvs. at den ikke er afhængig af et enkelt protein til normalisering eller lastning kontrol. Dette omgår den mulighed, at de “husholdning” proteiner, der anvendes til dette formål faktisk kan variere i nogle tilstande, eller at de er mættet ved niveauerne af lastning nødvendige til påvisning af lav-ekspressionsprodukter eller at de ikke er påviselige som i vores eksempel [35 ].

ATM /ATR signaleringskaskade analyse

Etoposid (Sigma, St. Louis, MO, USA) blev opløst i DMSO og tilsat ved den endelige koncentration 5 uM i 1 time. Hele cellelysater blev fremstillet ud fra frisk opsamlede celler ved anvendelse af en lysepuffer (20 mM Tris-HCI pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40, 400 mM NaCl) suppleret med proteasehæmmer blanding (Calbiochem, Merck Darmstadt , Tyskland), 0,5 mM PMSF og 2 mM natriumorthovanadat. Lysater blev inkuberet på is i 15 minutter og centrifugeret ved 13000 rpm i 10 min. Proteinkoncentration fra supernatanter blev bestemt ved Biorad assayet (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). For immunoblots blev prøver lagt i Laemmli-buffer på 6% eller 10% Tris-glycin SDS /PAGE-geler, overført til nitrocellulosemembraner og hybridiseret med egnede antistoffer ved 1:1000 fortynding. Blots blev udviklet af forøget kemiluminescens (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Tyskland). Antistoffer: muse-anti-phosphoAtm (Ser 1981) kanin-anti-phosphoChk1 (Ser 345), kanin-anti-phosphoChk2 (Thr 387), kanin-anti-phospho JNK (Thr183 /Tyr185) (Cell Signaling, New York, NY, USA), kanin anti-p53 og muse-anti-MCM7 (Santa Cruz).

Statistisk analyse

Alle resultater blev rapporteret som gennemsnit ± SEM. Signifikansniveau blev bestemt ved Mann – Whitney-test. En værdi * p ≤ 0,05, ** p≤0,001 og **** p≤0,0001 blev betragtet som statistisk signifikant. Data blev udtrykt som gange ændring i forhold til kontrol, indstillet som 1.

Resultater

For at forstå de potentielle virkninger af mekanisk belastning på celle immunogenicitet, kræft og sunde celler blev mekanisk stresset med en mikropumpe enheds- og chokbølger.

de forandringer som følge af den mikropumpe leveret stress blev analyseret ved Raman spektroskopi. Raman målinger blev udført for de respektive celler (Mel 59c, Mel 42a, Mel 103a og 293 T-cellelinie) i PBS-opløsning i det spektrale område mellem 700 til 1800 cm

-1. Raman spektre med standardafvigelse error bar for kontrol (tryksvage) celler og mekanisk påvirkede celler i PBS-pufferopløsning er vist i fig. 1. Raman spektre af disse celler ligner karakteristiske Raman spektre af de fleste levende celler. Alle spektre viser forskellige toppe ved ca. 780, 850, 1003 1125, 1445, og 1660 cm

-1. Typiske bands i disse spektre (fig. 1) er forbundet til nukleotid kropsbygning (600-800 cm

-1), molekylær skelet geometri og fosfat-relaterede vibrationer (800-1200 cm

-1), nukleotider ( 1200-1600 cm

-1), og CC og CH

x tilstande på grund af proteiner og lipider [36]. De amid vibrationer, såsom amid I-bånd (på grund af C = O stretching, 1650-1700 cm

-1) og amid III bånd (grundet CN strækning, og NH bøjning, omkring 1250 cm

– 1) i proteiner er lette at skelne [37]. Amidet I bånd i området mellem 1650-1700 cm

-1 giver også meget vigtige oplysninger om bekræftelse status for sekundær struktur (α-helix, β-sheet og random coil struktur) af proteiner. Forskellige aminosyrer kan genkendes eksplicit ved ca. 1003 1011 og 1032 cm

-1 i Raman-spektret [37].

Raman spektre for kontrol og stresset cancercellelinier (Mel 59c (A), Mel 42a (B), Mel 103b (C) og 293T (D)) med standardafvigelse error bar. De spektre blev udført før og efter mekanisk belastning med mikropumpe.

Variationen af ​​relativ koncentration af protein i forskellige celler blev beregnet ved hjælp af kurvetilpasning disse to regioner af proteinbånd ved ca. 1440 og 1650 cm

-1. Fig. 2 viser, for forskellige celletyper, variationen i relative intensitet af cellemembranprotein /lipid (1440 cm

-1) og α-helix (1650 cm

-1) band før og efter anvendelsen af ​​mekanisk spænding . Et klart fald af protein mængde og dens α-helix sekundær struktur blev observeret ved mekanisk belastning celle behandling.

Normaliseret område af bånd centreret omkring 1440 (øverst) og 1670 cm

-1 (ned) for alle cellelinier, der viser variationen af ​​koncentrationen protein og relative indhold α-helix over celleoverfladen.

En meget klart billede kan afsløres fra variationen af ​​sekundær struktur efter anvendelse af mekanisk belastning. Det viser reduktionen af ​​α-helix sekundær struktur amid I bånd for alle cellerne med mekanisk belastning. Denne tendens er ikke klart observeret i Mel 42a celler, som spektret er meget støjende (fig. 1B). Endvidere på dyb analyse har det vist sig, at Mel 59c og 293 T-celler sig på tilsvarende måde. Alle de undersøgte cellelinjer viser en faldende sekundær struktur på mekanisk belastning. Quenching af α-helix struktur og en forøgelse af fluorescens baggrund samt kan tydeligt iagttages. Disse ændringer i Raman spektre er i overensstemmelse med vores tidligere rapporterede resultater på klasse I afsløring MHC af Raman spektroskopi [38].

Desuden er Principal Component Analysis (PCA) udføres for at skelne den stressede til at styre celler hver celle linjer. PCA, en statistisk analyse, reducerer dimensionalitet af multi-dimensional datasæt, holde karakteristisk for alle spektrene [31]. De reducerede dimension punkter i hvert spektrum beskrives af et begrænset antal variabler, kaldet hovedkomponenter (pc’er). Disse pc’er optage det meste af den spektrale information. Fig. 3 repræsenterer PCA analyse (PC1 vs. PC2, PC2 vs. PC3 og PC1 vs. PC3) af alle cellelinierne i området fra 700 til 1800 cm

-1. De fyldte blokke er for kontrol celler mens de tomme blokke er forbundet understrege celler. Stress celler kan være godt skelnes fra kontrolceller og endvidere hver cellelinier kan findes i-grupperet tydeligt i figuren. Disse resultater viser en interessant og vigtig måde at skelne mellem celler og også hvis cellerne er blevet forstyrret eksternt

PCA analyse på kontrol- og stress celler til forskellige cellelinjer.; Mel 42a, Mel 59c, Mel 103b og 293T. a) PC1 vs. PC2, b) PC2 vs. PC3 og c) PC1 vs. PC3.

For at bekræfte, at den mekaniske belastning inducerer en nedregulering af MHC klasse I på cellerne overflade udførte vi en immunofænotype assay for alle de forskellige celletyper.

efter 1 bar power behandling, blev observeret efter Mikropumpe og chokbølger, en klar reduktion af MHC klasse i-niveauer på tumorceller membran (fig. 4A), mens der sås ingen ændringer når raske celler, fibroblast, makrofag, dendritiske og lymfocytter celler, var stressede (fig. 4B). Statistiske analyser blev udført på tumorceller (melanom og IM9 cellelinjer, fig. 4C) og raske celler (fibroblast, makrofag, dendritiske og lymfocytter celler, fig. 4D).

Panel A viser formindskelsen af ​​MHC klasse i molekyler ekspression på cancerceller (5 melanom og en lymfoblastoide cellelinjer) efter mekanisk belastning behandling ved hjælp af mikropumpe (øverste del) og chokbølger (nedre del) sammenlignet med ubehandlede celler. Panel B rapporterer virkningen af ​​mekanisk belastning på nogle sunde celler (fibroblaster og makrofager) af MHC klasse I med de to nævnte behandlinger. Den tilhørende isotopiske kontrol MFI gav samme overlap signal til alle cellelinjer, der anvendes, derfor er udeladt. Panel C betegner den statistiske værdi af gange formindskelse af MHC-I udføres på melanomceller (n = 4 særskilt forsøg med mikropumpe og n = 4 separate eksperiment med chokbølger; p 0,05) og IM9-celler (n = 10 separat forsøg med chokbølger; p 0,0001). Den gange formindskelse af MHC-I blev afledt af Median Fluorescence Intensity (MFI) på MHC-I-molekyler før og efter behandling af melanom og IM9 cellelinier. Panelet D viser de statistiske værdier, der opnås fra forskellige forsøg (n = 3) for hver type af raske celler. Fibroblasterne og PBL’er blev understreget med mikropumpe mens blev makrofager og dendritiske celler behandlet med chokbølger. Værdien rapporteret i panel D er ikke statistisk signifikant.

De andre immunogene molekyler analyseret, såsom glimmer, MICB, ULBPs, PVR og nectin-2, viste ikke signifikante ændringer mellem kontrol og stressede celler med chokbølger (S2 fig.). For at forstå virkningen af ​​den reducerede MHC klasse I-ekspression på mekanisk stressede tumorceller immunogenicitet, blev funktionelle analyser udført under anvendelse af begge enheder, Mikropumpe og chokbølger. Heri blev NK-celler modtagelighed mekanisk belastede tumormålceller end deres tryksvage kontrol med klassiske cytotoksicitetsassays. En klar og reproducerbar forøgelse af NK modtagelighed blev observeret efter mekanisk belastning behandling. Rækken af ​​stigende NK lysis procentdel på tumorceller var mellem 30-70% (fig. 5A-E), mens raske celler, dvs. fibroblast (fig. 5F), reagerede ikke på mekanisk belastning behandling. Resultaterne viser, at mekanisk belastning forbedrer NK anerkendelse for tumor med statistisk signifikans (fig. 5G-H), men ikke for raske celler. Mekanisk belastning skifter tumor-fænotypen fra at være NK resistente over for NK modtagelige. Denne ændring i NK modtagelighed korrelerer med tumor specifikke MHC-klasse I tab. MHC klasse I molekyler er de mest potente inhibitoriske ligander for NK-receptorer. Den MHC klasse I nedregulering på tumorceller udløse NK svar i overensstemmelse hermed med “Missing self hypotese” [21]. Dataene her indsamlede indikerer, at en afgivelse af MHC-I forekommer efter mekanisk belastning fra tumorcelleoverfladen, er dette ikke tilfældet for raske celler. Vores fund viser en immunologisk relevant effekt af mekanisk stress på tumor modtagelighed for cytotoksisk angreb

NK-celle genkendelse af forskellige tumor celle mål på forskellige E /T (effektor /mål) ratio:. 59c, 42a, 66b ( melanom celle linjer), 293T (nyre karcinom) og IM9 (lymphoblastoidcell linjer) før (grå) og efter (sort) mekanisk belastning. The Mel 42a, Mel 66b, fibroblastceller (panel B, E og F) blev behandlet med den mikropumpe, Mel 59c, IM9, blev 293 T-celler (panel A, C og D) understreget med chokbølger. Som raske målceller, i dette tilfælde er vist fibroblaster. rapporteres repræsentative eksperimenter for hver celletype. Paneler G og H vis de statistiske afledt fra tre forskellige funktionelle assays, under anvendelse af NK-lymfocytter som effektorer celler (E) og IM9 og melanomceller var mål (T). IM9 målceller blev behandlet med de chokbølger (panel G: n = 3, p = 0,0325), mens de Melanom målceller blev understreget med mikropumpe (panel H, n = 3, p = 0,0186). E /T-forholdet 12/1, s. 0,05

Den øgede celle cytotoksicitet observeret i klassiske NK cytotoksicitetsassays ikke skyldtes ved passiv target celledød induceret ved mekaniske stress behandlinger, men snarere af aktiv NK