PLoS ONE: sinomenine sensibiliserer multiresistente Colon Cancer Cells (Caco-2) til doxorubicin ved nedregulering af MDR-1 Expression

Abstrakt

kemoresistens i multiresistente (MDR) celler end udtrykke P-glycoprotein ( P-gp) kodet af MDR1-genet, er en væsentlig hindring for vellykket kemoterapi for tyktarmskræft. Tidligere undersøgelser har indikeret, at sinomenine kan forøge absorptionen af ​​forskellige P-gp-substrater. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi effekten af ​​sinomenine på kemoresistens i colon cancerceller og udforskede den underliggende mekanisme. Vi udviklede multiresistent Caco-2 (MDR-Caco-2) celler ved eksponering af Caco-2-celler til stigende koncentrationer af doxorubicin. Vi identificerede overekspression af COX-2 og MDR-1-gener samt aktivering af NF-KB signalvej i MDR-Caco-2-celler. Vigtigere, fandt vi, at sinomenine forøger følsomheden af ​​MDR-Caco-2-celler i retning doxorubicin ved nedregulering MDR-1 og COX-2-ekspression gennem hæmning af NF-KB-signalvejen. Disse resultater giver en ny potentiel strategi for tilbageførsel af P-gp-medieret resistens anticancer narkotika

Henvisning:. Liu Z, Duan Z-J, Chang J-Y, Zhang Z-f, Chu R, Li Y-L, et al. (2014) sinomenine sensibiliserer multiresistente Colon Cancer Cells (Caco-2) til doxorubicin ved nedregulering af MDR-1 Expression. PLoS ONE 9 (6): e98560. doi: 10,1371 /journal.pone.0098560

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget 22. januar 2014 Accepteret: 5 maj 2014; Udgivet: 5 juni 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er en af ​​de mest almindelige maligne tumorer. gastrointestinal spor. I de senere år er forekomsten af ​​colorektal cancer signifikant øget i Kina [1]. Kirurgisk resektion er den optimale behandling for denne form for cancer, mens kemoterapi tjener som en af ​​de vigtige adjuvans-terapier til dens behandling. I øjeblikket er udviklingen af ​​multilægemiddelresistens (MDR), en fænotype, som cancerceller bliver resistente over for et bredt spektrum af kemoterapeutika [2], er en stor hindring i colorektal cancer kemoterapi. Det er blevet vist, at fremkomsten af ​​MDR i cancerceller er signifikant korreleret med overekspression af membranpumpe proteiner, herunder P-glycoprotein (P-gp) [3].

P-gp, kodes af MDR- 1-genet, er et medlem af den store ATP-bindende kassette proteinsuperfamilien [4]. P-gp er stand til at pumpe en stor mængde af forbindelser fra intracellulært til ekstra-cellulære sites. Når kræftceller støder kemoterapeutiske stoffer, fedtopløselige stoffer ind celler via koncentrationsgradient virkning. Efter binding til P-gp, er fedtopløselige stoffer konstant pumpes ydersiden af ​​cellen ved en proces drevet af ATP hydrolyse, overtalelse en kontinuerlig nedgang i intracellulære lægemiddelniveauer [5]. Følgelig er det lægemiddeltoksicitet på cancerceller gradvist svækket, hvorved de mister virkningsfuldhed og endelig frembringelse lægemiddelresistens i cancerceller.

sinomenine (7,8-didehydro-4-hydroxy-3,7-dimethoxy 17-methylmorphinae-6-en) er en af ​​flere alkaloider udvundet fra stammen af ​​

Sinomenium acutumRehder

Wilson (Menispermaceae), der har været anvendt traditionelt i Kina og Japan til behandling af forskellige reumatiske og artritiske sygdomme [6]. Det er værd at bemærke, at sinomenine kan øge den absorberende transport af digoxin (et prototypisk substrat for p-glycoprotein) og faldende dets sekretoriske [7] transport. Nogle undersøgelser tyder på, at sinomenine kan blokere aktiveringen af ​​NF-KB [8]. Den underliggende mekanisme af disse fænomener er fortsat uklar.

Cyclooxygenase (COX), et hastighedsbegrænsende enzym, som katalyserer biosyntesen af ​​prostaglandiner (PG’er) fra substratet arachidonsyre (AA) og deltager i flere fysiologiske og patologiske begivenheder . I øjeblikket er der to isoformer af COX: COX-1 og COX-2. I de fleste væv, er COX-1 udtrykkes konstitutivt, hvorimod COX-2 induceres af vækstfaktorer, cytokiner, og carcinogener [9]. COX-2 er almindeligt påvises i mange typer af tumorvæv, herunder spiserøret, maven, colon, lever, galdeveje, bugspytkirtel, bryst, lunge og blære kræft [10]. Nylige resultater har vist, at COX-2-ekspression er positivt korreleret med P-gp-ekspression i tumorvæv [11]. Relevante undersøgelser har vist, at COX-2-inhibitorer forøge følsomheden af ​​cancerceller til kemoterapeutika ved at regulere aktiviteten af ​​P-gp [12], [13]. Det har vist sig, at celecoxib, en selektiv COX-2-inhibitor, kan nedregulere P-gp-ekspression i cancerceller ved at undertrykke ekspression af transkriptionsfaktorer, såsom NF-KB [14], [15]. Flere undersøgelser viste, at MDR-1-genet kan indeholde DNA bindingssteder for transkriptionsfaktor NF-KB [16], [17].

Nogle undersøgelser tyder på, at sinomenine inhiberer modning af monocytafledte dendritiske celler gennem blokering aktivering af NF-KB [8]. I den aktuelle undersøgelse testede vi den hypotese, at sinomenine kan forøge følsomheden af ​​cancerceller i retning antitumorlægemidler og undersøgt de potentielle molekylære mekanismer af denne virkning ved direkte vurdering af virkningen af ​​COX-2 og NF-KB pathways på P-gp-ekspression.

Materialer og metoder

Regents og antistoffer

sinomenine, celecoxib, doxorubicin, 3- (4, 5-dimethyl thiazol-2-yl) -2, 5- diphenyl tetra-zolium (MTT) og dimethylsulfoxid (DMSO) blev erhvervet fra Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og føtalt kalveserum (FCS) blev opnået fra GIBCO Life Technology (Grand Island, NY). PGE

2 og PGE

2 estimering kit blev købt fra Cayman Chemical Co., USA. Triton X-100 blev indkøbt fra Amresco, USA. P-glycoprotein (P-gp) muse anti-humant monoklonalt antistof, p-IkB-α (Ser 32/36) og IKB-α kanin-anti-humant polyklonalt antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) . NF-KB p65 kanin-anti-humant polyklonalt antistof blev opnået fra Proteintech Group, USA. Monoklonale muse-anti-beta-actin og polyklonalt kanin-anti-COX-2 blev opnået fra Biosyntese Biotechnology (Beijing, Kina). FITC-mærket ged anti-mus IgG og FITC-mærket gede-anti-kanin IgG blev erhvervet fra Amersham Pharmacia Biotech. (Piscataway, NJ).

Cell Culture

Caco-2-cellelinjer er ansat i denne undersøgelse blev købt fra det kinesiske Academy of Medical Sciences. Caco-2 celler blev dyrket i høj glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Gibco, Bethesda, MD, USA) dyrkningsmedier indeholdende 10% føtalt kalveserum ved 37 ° C med 5% CO

2. MDR-Caco-2-celler blev udviklet af eksponering af Caco-2-celler til stigende koncentrationer af doxorubicin (fra 0,1 uM til 1,6 uM i 7 dage). Så MDR-Caco-2 celler blev inkuberet uden doxorubicin i en uge før eksperimenter.

MTT kolorimetrisk analyse

Koncentrationen af ​​sinomenine, celecoxib ansøgning, PGE

2 og evnen til sinomenine at sensibilisere coloncancerceller dybt doxorubicin blev vurderet under anvendelse af MTT kolorimetrisk assay. Caco-2-celler og MDR-Caco-2-celler ved den logaritmiske blev opsamlet, inkuberet i en 96-brønds plade ved en koncentration på 2 × 10

4 celler per brønd og dyrket i 24 timer med DMEM suppleret med 10% FCS. Efter fastgørelsen af ​​cellerne til væggen, DMEM medium (uden FCS) indeholdende sinomenine (0, 50, 100, 300, 400, 500, 1000, 2000 uM), celecoxib (0, 5, 10, 15, 20, 25 , 30, 35 uM) og PGE

2 (0, 10

-5, 10

-4, 10

-3, 10

-2, 10

-1, 1, 10 pM) blev suppleret ved et slutvolumen på 200 pl /brønd i 48 timer. Efter behandling blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket to gange med DMEM. Derefter 200 pi DMEM suppleret med 10% FBS og 10% MTT (5 mg /ml) blev tilsat. Efter inkubation i yderligere 4 timer blev reduceret intracellulær formazanprodukt opløst ved at erstatte 150 pi DMEM med det samme volumen DMSO. Den optiske densitet (OD) værdi blev detekteret ved en bølgelængde på 490 nm med en mikropladelæser (Bio-rad680, CA, USA). Fire dubletter blev designet til hver brønd, og middelværdien blev beregnet tre gange. Inhiberingshastigheden cellevækst blev beregnet ud fra følgende formel:. Cellevækstinhiberingen rate = (1 -OD værdi i studiegruppen /OD-værdi i kontrolgruppen) x 100%

væksthæmningstest blev udført for at vurdere evnen til sinomenine og celecoxib at sensibilisere Caco-2 og MDR-Caco-2 celler dybt doxorubicin. Efter fastgørelsen af ​​cellerne til væggen, DMEM medium (uden FCS) indeholdende sinomenine (500 uM), celecoxib (25 uM), sinomenine (500 uM) plus PGE

2 (1 uM) med en interval på 2 timer . Efter inkubation i 48 timer blev mediet udskiftet med DMEM (FCS-frit) indeholdende doxorubicin (1,6, 2,0, 2,4, 2,8, 3,2, 3,6, 4,0, 5,0, 6,0 uM) i 24 timer.

WST -1 celleproliferationsassay

Caco-2-celler og MDR-Caco-2-celler ved den logaritmiske blev opsamlet, inkuberet i en 96-brønds plade ved en koncentration på 2 × 10

4 celler per brønd og dyrket i 24 timer med DMEM suppleret med 10% FCS. Efter fastgørelsen af ​​cellerne til væggen, DMEM medium (uden FCS) indeholdende sinomenine (500 uM), celecoxib (25 uM), sinomenine (500 uM) plus PGE

2 (1 uM) med en interval på 2 timer . Efter inkubation i 48 timer blev mediet udskiftet med DMEM (FCS-frit) indeholdende doxorubicin (1,6, 2,0, 2,4, 2,8, 3,2, 3,6, 4,0, 5,0, 6,0 uM) i 24 timer. 10 pi af reagenset WST-1 blev tilsat (Roche Applied Science, Vilvoorde, Belgien) og inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. Den optiske densitet blev læst ved 450 nm ved mikropladelæser Labnet (Celbio, Milano, Italien). WST-1-data blev præsenteret som middel (± SD) af tredobbelte eksperimenter.

PGE

2 Estimation

MDR-Caco-2 og Caco-2-celler ved en densitet på 5 × 10

6 blev podet i 90 mm dyrkningsskåle. De blev inkuberet med eller uden snomenine (500 uM) i 48 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden blev dyrkningsmediet opsamlet til bestemmelse af mængden af ​​PGE

2 udskilt af disse celler og opbevaret ved) -80 ° C. Den kvantitative analyse af PGE

2 frigivet til mediet blev vurderet ved hjælp af PGE

2 immunoassay kit pr producentens anvisninger (Cayman Chemical Company, USA).

Immuncytokemi

Fordelingen af P-gp i cellemembranen og nuklear translokation af NF-KB p65 blev analyseret ved immuncytokemi som standardprocedurer. I korte træk blev Caco-2 og MDR-Caco-2-celler behandlet med sinomenine (500 uM) og kontrolmedium (uden sinomenine) i 48 timer og fikseret med 4% paraformaldehyd. Cellerne blev inkuberet med en P-glycoprotein (P-gp) muse-anti-humant monoklonalt antistof (1:200 fortynding) eller et NF-KB p65 kanin-anti-humant polyklonalt antistof (1:200 fortynding) i 1 time efterfulgt af inkubation med FITC-mærket ged anti-mus IgG (1:200 fortynding) eller FITC-mærket gede-anti-kanin IgG (1:200 fortynding) i 1 time hhv. Endelig blev cellerne undersøgt under et fluorescensmikroskop (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).

Real-time Relativ Kvantitativ revers transkriptase Polymerase Chain Reaction (PCR) Indhold

For at undersøge virkningen af ​​sinomenine og celecoxib på P-gp og COX-2-ekspression blev realtid relative kvantitative PCR udført. Celler blev udpladet i 6-brønds plader med DMEM suppleret med 10% FCS i 24 timer. Caco-2 og MDR-Caco-2-celler blev behandlet med sinomenine (500 uM) eller celecoxib (25 uM) i 48 timer.

Totalt RNA blev isoleret med TRIzol-reagens (Keygen Biotech Co, Ltd, Nanjing , Kina), i overensstemmelse med protokollen af ​​producenten. Det isolerede RNA blev kvantificeret ved spektrofotometri (optisk denisty 260/280 nm). MRNA’et blev dernæst revers-transkriberet til cDNA ifølge PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time indkøbt fra Takara Bio Inc. (Dalian, Kina).

Real-time relative kvantitative PCR blev udført under anvendelse af Applied Biosystems 7500 hurtigere Real-Time PCR System med SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) Master Mix købt fra Takara Bio Inc (Dalian, Kina) i tre eksemplarer for hver prøve og hvert gen. PCR’er blev udført under anvendelse af oligonukleotidprimerne anført i tabel 1, som beskriver størrelsen af ​​de forventede fragmenter. PCR betingelser var: denaturering ved 95 ° C i 30 s, efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 5 s og 30 s ved 60 ° C til annealing og 30 s ved 72 ° C i forlængelse. Resultaterne blev udtrykt som forholdet værdien af ​​CT værdi for target mRNA med den for β-actin mRNA (Ct prøve /Ctβ-actin).

Western blot-analyse

Western blots blev udført på grundlag af standardprocedurer. Kort fortalt blev høstede celler vasket to gange med kold PBS (pH 7,4). Nukleare ekstrakter blev isoleret ved hjælp af Nuclear /cytosol Fraktionering Kit (Keygen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Kina) i henhold til producentens anbefalinger. Totalt protein blev ekstraheret efter fabrikantens anvisninger i prøvesættet fra Nanjing Keygen Biotech. CO., LTD (Kina). Efter bestemmelse af proteinkoncentrationen af ​​prøver under anvendelse bicinchoninsyre (BCA) protein-assay, lige store mængder af protein prøver (30 ug protein) blev separeret på SDS-polyacrylamid geler (8% for P-gp, 15% for COX-2, 12% for NF-KB p65, p-IKB-α, IKB-α og beta-actin).

De separerede proteiner blev overført til en PVDF-membran. Efter blokering i 5% skummetmælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,05% Tween-20 (TTBS), blev PVDF-membranen inkuberet natten over i blokerende buffer med fortyndet primære antistoffer: anti-P-glycoprotein (1:500 fortynding), anti- p-IKB-α (Ser 32/36) og anti IkB-α (1:300 fortynding), anti-NF-KB p65 (1:400 fortynding), anti-COX-2 (1:500 fortynding) og anti -beta-actin (1:1000 fortynding), ved 4 ° C. Efterfølgende blev PVDF-membran vaskes tre gange med TTBS, efterfulgt af eksponering for det sekundære antistof: Peroxidase-konjugeret AffiniPure Goat Anti-Rabbit and anti-mus IgG (Biosyntese Biotechnology, Beijing, Kina, 1:2000 fortynding). Produktfraktionerne bånd blev fotograferet, og densiteten af ​​hvert produkt bånd blev kvantificeret ved ChemiDoc XRS dokumentationssystem (Bio-Rad Laboratories). Intensiteten af ​​hvert signal blev korrigeret ved anvendelse af de værdier, der opnås fra immunpåvisningen af ​​beta-actin.

Statistiske analyser

Data er præsenteret som gennemsnit ± SE. En foreløbig analyse var. for at fastslå, om de datasæt indrømmes med en normal. fordeling, og en beregning af varianshomogenitet blev udført under anvendelse Bartlett test. Organerne blandt forskellige prøver blev sammenlignet ved ANOVA, og multiple sammenligninger mellem grupperne blev udført ved anvendelse de mindst signifikante forskel (LSD) metode. Hvis F- værdier var signifikant (P 0,05), blev Dunnetts metode anvendt til at evaluere individuelle forskelle mellem midler, og P 0,05 blev betragtet som signifikant. Alle data blev statistisk analyseret ved hjælp af SPSS 11.5 software til Windows.

Resultater

Effekt af sinomenine, Celecoxib og PGE

2 på Caco-2 Levedygtighed

eksperimenter udført ved inkubering Caco-2-celler op til 48 timer med stigende koncentrationer sinomenine, afslørede, at denne forbindelse ikke påvirker Caco-2 cellelevedygtighed i koncentrationer på 500 uM eller mindre (fig. 1A). En koncentration på 500 uM blev valgt som koncentrationen ansøgning.

De cytotoksiske virkninger af angivne forbindelser på Caco-2-celler blev bestemt ved MTT-assayet. blev udført tre uafhængige forsøg. Resultater udtrykkes som middel ± SE. Vehikelbehandlede celler blev anvendt som en normalisering kontrol. * P 0,5, ** P. 0,05

Dosis-respons og tid-kursus undersøgelser vist, at celecoxib, er en COX-2 specifik hæmmer ikke påvirke Caco-2 celledeling ved doser fra 0 til 25 pM (fig. 1B). Tidligere undersøgelser viser, at celecoxib regulerer MDR1-ekspression ved inhibering af COX-2-enzymaktivitet ved en koncentration på 25 uM. Så blev en dosis på 25 uM udvalgt til vores eksperimenter [18].

For at vurdere, om PGE

2 kan påvirke effekten af ​​sinomenine blev Caco-2 celler inkuberet med eller uden stigende koncentrationer (0 til 10 uM) af PGE

2, en COX-2 slutprodukt, demonstrerede, at denne forbindelse ikke påvirker Caco-2 cellelevedygtighed på ethvert testet koncentration (fig. 1C). Undersøgelser har vist, at PGE

2 regulerer MDR1 udtryk i en koncentration på 1 uM [12], [18], [19], og det er underforstået, at Akt er blokeret i mekanismen. Derfor valgte vi dosis på 1 uM i vores eksperimenter.

sinomenine og Celecoxib Enhanced doxorubicin-induceret Ctotoxicity både i Caco-2 og MDR-Caco-2 celler

For at vurdere, om sinomenine og celecoxib kan sensibilisere Caco-2 og MDR-Caco-2-celler over for de cytotoksiske virkninger af doxorubicin, Caco-2 og MDR-Caco-2-celler blev behandlet med doxorubicin (10

-5 til 10 uM) i fravær eller nærvær af sinomenine (500 uM), celecoxib (25 uM), eller sinomenine (500 uM) plus PGE

2 (1 uM) i 48 timer. Celleproliferation blev bestemt ved MTT-assayet (fig. 2 A og B) og WST-1 assay (fig. 2 C og D). Doxorubicin nedsat cellelevedygtighed dosisafhængigt både i Caco-2 og MDR-Caco-2-celler med en IC

50 værdi på ca. 2,41 ± 0,15 uM og 4,67 ± 0,12 uM (fig. 2 A), henholdsvis. I MTT-assay, samtidig behandling af Caco-2 celler med sinomenine, eller celecoxib, lysfølsomme Caco-2-celler over for de cytotoksiske virkninger af doxorubicin med et fald i IC

50 værdier fra 2,41 ± 0,15 um til 1,91 ± 0,16 uM og 1,85 ± 0,2 uM (fig. 2 A), henholdsvis. Alligevel samtidig behandling med sinomenine plus PGE

2 havde ingen virkning på følsomheden af ​​Caco-2 celler mod doxorubicin.

Caco-2 og MDR-Caco-2-celler blev behandlet i 48 timer med doxorubicin (10

-5 til 10 uM) alene eller i kombination med sinomenine (500 uM), celecoxib (25 uM), eller sinomenine (500 uM) plus PGE

2 (1 uM). Cellelevedygtighed blev derefter bestemt ved MTT-assayet. Ct gruppe (A og C) henviser til doxorubicin-behandlede Caco-2-gruppen og Ct-gruppe (B og D) henviser til doxorubicin-behandlede MDR-Caco-2-gruppen. Data er præsenteret som gennemsnit ± SE. (N = 3) af et repræsentativt eksperiment udført tre gange. ** P 0,01, * P 0,05, sammenlignet med doxorubicin-behandlet Caco-2-gruppe. ## P 0,01, # P. 0,05, sammenlignet med doxorubicin-behandlede MDR-Caco-2-gruppe på Airbnb

sinomenine og celecoxib også forbedret den cytotoksiske virkning af doxorubicin i MDR-Caco-2 celler, der faldt IC

50 værdi fra 4,67 ± 0,12 uM til 2,45 μ ± 0,14 uM og 2,56 uM ± 0,11 uM (fig. 2 B), henholdsvis. Overraskende, samtidig behandling med sinomenine plus PGE

2 havde en negativ effekt på følsomheden af ​​MDR-Caco-2 celler mod doxorubicin med en øget IC

50 værdi fra 4,67 ± 0,12 uM til 5,35 μ ± 0,13 uM.

WST-1 assay IC

50 værdien af ​​Caco-2 celler faldt fra 2,33 ± 0,14 uM til 1,85 ± 0,13 uM og 1,88 ± 0,21 uM (fig. 2 C). Men samtidig behandling med sinomenine plus PGE

2 svækket følsomheden af ​​Caco-2 celler dybt doxorubicin med et fald i IC

50 værdier fra 2,33 ± 0,14 uM til 2,55 ± 0,17 uM (fig. 2 C). Sinomenine og celecoxib også forbedret den cytotoksiske virkning af doxorubicin i MDR-Caco-2 celler, der faldt IC

50 værdi fra 4,55 ± 0,19 uM til 2,55 μ ± 0,25 uM og 2,52 uM ± 0,18 uM (fig. 2 D) , henholdsvis. Utroligt, samtidig behandling med sinomenine plus PGE

2 havde en negativ effekt på følsomheden af ​​MDR-Caco-2 celler mod doxorubicin med en øget IC

50 værdi fra 4,55 ± 0,19 uM til 5,15 u-± 0,14 uM (fig. 2 D).

sinomenine Nedsat PGE

2 Slip

nærmere at undersøge inddragelsen af ​​COX-2, PGE

2, en COX-2 slutprodukt, frigivet fra Caco-2 og MDR-Caco-2-celler blev bestemt ved ELISA-metoden. Resultaterne viser klart en betydelig stigning i PGE

2 etager i MDR-Caco-2 celler i forhold til Caco-2 celler og et markant fald i niveauet af PGE2 i MDR-Caco-2 celler behandlet med sinomenine (Fig. 3).

MDR-Caco-2 og Caco-2 celler blev dyrket i 48 timer i nærvær eller fravær af 500 uM sinomenine, som angivet, og høstet. Supernatanter derefter indsamlet til PGE

2 måling. Data er præsenteret som gennemsnit ± SE. (N = 3) af et repræsentativt eksperiment udført tre gange. Sammenlignet med Caco-2 celler, PGE

2 niveauer i MDR-Caco-2 celler signifikant forøgede (P 0,01), som i væsentlig grad faldt i MDR-Caco-2 celler behandlet med sinomenine (P 0,01).

sinomenine og Celecoxib nedreguleret ekspression af P-gp /MDR1 i MDR-Caco-2 celler

for at forstå den mekanisme af resistens udviklet i MDR-Caco-2 celler, og er involveret i sinomenine og celecoxib sensibiliserende MDR-Caco-2 celler mod doxorubicin, immunfluorescens cytokemi, kvantitativ real-time PCR, og western blotting mekanisme blev udført. Resultaterne viste overekspression af MDR1-mRNA og protein faldt betydeligt i nærværelse af sinomenine og celecoxib (fig. 4).

multiresistent Caco-2 (MDR-Caco-2) -celler blev udviklet af eksponering af Caco -2 celler til stigende koncentrationer af doxorubicin (fra 0,1 uM til 1,6 uM i 7 dage). MDR-Caco-2-celler blev inkuberet uden doxorubicin i en uge før eksperimenter. Derefter MDR-Caco-2-celler blev behandlet med eller uden sinomenine (500 uM) og celecoxib (25 uM) i 48 timer. (A) immunocytokemi målrettet P-gp (grøn). (B) Western blot-analyse af sinomenine og celecoxib medieret virkning på P-gp-ekspression i Caco-2-celler og MDR-Caco-2-celler. Antistof mod beta-actin blev anvendt for at sikre lige belastning af protein i hver bane. (C) De relative band densitetsværdier i P-gp udtryk baner er beskrevet i baren chat. (D) Real-time PCR-analyse af MDR1 ekspression i Caco-2-celler og MDR-Caco-2-celler behandlet med eller uden sinomenine. Beta-actin blev anvendt som den interne reference til påvisning af MDR1-ekspression. Alle resultaterne ovenfor er udtrykt som middel ± SE (n = 3) af tre uafhængige forsøg. *, P 0,05 og **, P 0,01 sammenlignet med MDR-Caco-2-gruppe på Airbnb

sinomenine nedreguleret ekspression af COX-2 i MDR-Caco-2 celler

for at forstå den rolle COX-2 i udviklingen af ​​resistens, og virkningen af ​​sinomenine på COX-2-ekspression, Caco-2 og MDR-Caco-2-celler blev behandlet med eller uden sinomenine og celecoxib, en COX-2 specifik inhibitor, ved kvantitativ realtids-PCR og western blotting. Resultaterne viste, at COX-2 overudtrykkes i MDR-Caco-2-celler og sinomenine undertrykte COX-2-ekspression (fig. 5). Ud over, at celecoxib har ingen virkning på ekspressionen. Vi kan udlede, at celecoxib, som en COX-2 specifik inhibitor, inhiberer funktionen af ​​COX-2 frem for regulering af dets ekspression.

MDR-Caco-2-celler blev inkuberet uden doxorubicin i en uge før eksperimenter. Derefter MDR-Caco-2-celler blev behandlet med eller uden sinomenine (500 uM) og celecoxib (25 uM) i 48 timer. (A) Western blot-analyse af sinomenine og celecoxib medieret virkning på COX-2 ekspression i Caco-2-celler og MDR-Caco-2-celler. Antistof mod beta-actin blev anvendt for at sikre lige belastning af protein i hver bane. (B) De relative band densitetsværdier i COX-2-ekspression baner er beskrevet i bar chat. (C) Real-time PCR-analyse af COX-2 ekspression i Caco-2-celler og MDR-Caco-2-celler behandlet med eller uden sinomenine og celecoxib. Beta-actin blev anvendt som den interne reference til påvisning af COX-2-ekspression. Alle resultaterne ovenfor er udtrykt som middel ± SE (n = 3) af tre uafhængige forsøg. *, P 0,05 og **, P. 0,01 sammenlignet med MDR-Caco-2-gruppe på Airbnb

sinomenine og Celecoxib Nedsat NF-KB-aktivering

P-gp udtryk har været klart korreleret med NF-κ B-aktivering [17], [20], [21], som er medieret af phosphorylering af IKB-α. Efterfølgende aktiveret NF-KB p65 subunit translokerer til kernen og binder til DNA-sted, som til sidst aktiverer transkription af MDR-1 [22]. For at forstå den mekanisme, hvorved sinomenine og celecoxib forbedre følsomheden af ​​MDR-Caco-2 celler mod doxorubicin, immunfluorescens cytokemi, kvantitativ real-time PCR, og western blotting blev udført for at detektere p65-underenhed med nukleart og cytoplasmatisk p-IKB-α og IKB-α. Resultaterne viste, at NF-KB-vejen blev aktiveret i MDR-Caco-2-celler, mens sinomenine og celecoxib undertrykt aktiveringen af ​​NF-KB-vejen i MDR-Caco-2-celler (fig. 6).

derefter MDR-Caco-2-celler blev behandlet med eller uden sinomenine (500 uM) og celecoxib (25 uM) i 48 timer. (A) immunocytokemi målretning P65 (grøn). (B) Western blot-analyse af sinomenine og celecoxib medieret virkning på nuklear translokation af P65 i Caco-2-celler og MDR-Caco-2-celler. Antistof mod beta-actin blev anvendt for at sikre lige belastning af protein i hver bane. (C) De relative band density værdier i de nukleare udtryk P65 baner er beskrevet i baren chat. (D) De relative band density værdier i de cytoplasmatiske p-IKB-a baner er beskrevet i baren chat. Alle resultaterne ovenfor er udtrykt som middel ± SE (n = 3) af tre uafhængige forsøg. *, P 0,05 og **, P. 0,01 sammenlignet med MDR-Caco-2-gruppe på Airbnb

Diskussion

Kemoterapi tjener som en af ​​de vigtige behandlinger for tyktarmskræft. Langsigtet kemoterapi uundgåeligt fører til resistens over for lægemidler, og det er blevet en stor udfordring for triumf kemoterapi. Fremkomsten af ​​medikamentresistens kan korrelere med en stigning i udstrømningspumpe aktivitet, et fald i lægemiddelabsorption, aktivering af afgiftning enzymer, ombygninger i drug targets og en reduktion i celle apoptose [23]. Tidligere undersøgelser på efflukspumpen har vist, at P-gp, kodes af MDR-1-genet, spiller en vigtig rolle, da det pumper lægemiddelstof uden at reducere cytotoksicitet præsenteret af cancerceller og forøger modstanden af ​​carcinoma for kemoterapi. Dog kan lægemiddelresistens præsenteret af cancerceller effektivt vendes ved at undertrykke P-gp-ekspression og funktion [24], [25], [26].

sinomenine, en bioaktiv alkaloid stammer fra

Sinomenium acutum

, anvendes til behandling af reumatiske og artritiske sygdomme i Kina. Sinomenine har en række funktioner, herunder anti-inflammation og immunsuppression [27], [28]. Tidligere undersøgelser har indikeret, at sinomenine faldt udstrømningen af ​​prototypiske p-gp-substrater, såsom digoxin og paeoniflorin [6], [7], og sinomenine sig selv kan være et substrat for P-gp [29]. Så reguleringsmetoder for sinomenine til P-gp forblev ukendt. Vores resultater viste, at sinomenine nedregulerede P-gp-ekspression i MDR-Caco-2-celler (fig. 4) og et forstærket følsomhed MDR-Caco-2 celler dybt doxorubicin (fig. 2). Nogle undersøgelser har indikeret, at sinomenine inhiberede ekspressionen af ​​COX-2 [30], [31]. I overensstemmelse med disse resultater, vores resultater manifesteret at sinomenine nedreguleret COX-2 ekspression i MDR-Caco-2-celler (fig. 4) og faldt PGE

2, en ende produktion af COX-2, frigivet fra MDR-Caco- 2-celler (fig. 3).

COX-2, en af ​​det hastighedsbegrænsende enzym i metabolismen af ​​arachidonsyre til prostaglandiner, overudtrykkes i mange humane primære og metastatiske neoplasmer [32]. Hvorvidt COX-2 er involveret i udviklingen af ​​resistens lægemidler er karakteriseret ved P-gp overekspression er kontroversiel. Mange undersøgelser har vist, at COX-2-ekspression er korreleret med P-gp-ekspression [33], [34]. Det forlyder, at adenovirus transfektion af COX-2-genet opregulerer MDR-1 genekspression i rotte-glomerulus-celler og opretholdes toksiciteten af ​​adriamycin mod renale celler. I nærvær af COX-2-inhibitor NS-398, blev MDR-1-genet ekspressionsniveauer væsentligt reduceret og cytotoksiciteten af ​​adriamycin blev forbedret [35]. I overensstemmelse med disse resultater, fandt vi, at ekspression af både COX-2 og P-gp er væsentligt forbedret i MDR-Caco-2-celler. Celecoxib, en COX-2 specifik inhibitor, nedregulerede P-gp-ekspression i MDR-Caco-2-celler og sensibiliseret MDR-Caco-2 celler dybt doxorubicin. Som anført ovenfor sinomenine inhiberede ekspressionen af ​​COX-2 og P-gp. Derudover, når MDR-Caco-2-celler blev behandlet med sinomenine plus PGE

2, sinomenine undladt at forbedre toksiciteten af ​​doxorubicin i retning MDR-Caco-2-celler (fig. 2).

Tidligere undersøgelser viste at MDR-1-genet indeholder bindingssteder for NF-KB, som kan korrelere med MDR-1-genekspression [16], [17].

NF-KB eksisterer generelt som en heterodimer af p50 og p65-polypeptider , bundet i cytoplasmaet af inhibitorproteinet IKB [36], [37]. Efter cellulær stimulering med en række cytokiner eller patogener, er IKB phosphoryleret af IKB kinase (IKK) komplekset ved seriner 32 og 36, derefter nedbrydes af 26S proteosom. Efterfølgende NF-KB translokerer til kernen, hvor det binder til regulatoriske elementer i promotorregionen af ​​målgener. Der er tegn på, at NF-KB var nedstrøms for COX-2 [38], ikke desto mindre, undersøgelser har indikeret, at nedreguleringen af ​​COX-2-ekspression kunne inhibere NF-KB [39], [40]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at sinomenine og celecoxib undertrykt aktiveringen af ​​NF-KB-vejen i MDR-Caco-2-celler (fig. 6).

Som konklusion har vi udviklet en multiresistent Caco-2 (MDR-Caco-2) cellelinie ved eksponering af Caco-2-celler til stigende koncentrationer af doxorubicin, som overudtrykkes både P-gp og COX-2. Sinomenine nedreguleret ekspression af MDR1-mRNA og protein via NF-KB-vejen, og inhiberede ekspressionen af ​​COX-2, som blev korreleret med P-gp-ekspression. Vores resultater derfor forudsat ny indsigt i reguleringen af ​​P-gp udtryk i multiresistente celler og foreslået nye potentielle strategier for tilbageførsel af P-gp-medieret resistens anticancer narkotika. Dog kan andre signalmolekyler også deltage i reguleringen af ​​aktiviteten af ​​MDR-Caco-2 celler og dermed bidrage til multiresistente udvikling. er behov for yderligere undersøgelser for at undersøge, hvordan COX-2, NF-KB og andre signalmolekyler interagerer i udviklingen af ​​P-gp-medieret multiresistent i kræftceller.