PLoS ONE: Udvikling af en Multiplex autoantistof Test til påvisning af lungekræft

Abstrakte

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-dødsfald for både mænd og kvinder. Tidlig diagnose af lungekræft har en 5-års overlevelse på 48,8%, dog næsten 35% af fase I-patienter tilbagefald efter kirurgisk resektion, hvilket varsler en dårlig prognose. Derfor afsløre lungekræft i tidligt stadium og videre identificere de højrisikopatienter ville give mulighed for at give adjuverende behandling og muligvis øge overlevelsen. Der er betydelig dokumentation for, at immunsystemet producerer et autoantistof reaktion på neoplastiske celler. Påvisningen af ​​sådanne autoantistoffer er blevet vist at have diagnostisk og prognostisk værdi. Her tog vi fordel af high-throughput Luminex teknik til at multiplekse alt 14 tumorassocierede autoantigener til påvisning af autoantistof fra patienter sera. De 14 antigener blev udtrykt ved in vitro transkription /translationssystem med HaloTag ved N-terminus. Fusionsproteinerne blev derefter covalent immobiliseret på Luminex mikrosfærer konjugeret ved halogen-link ligand, hvilket således eliminerer procedure proteinrensningskonstruktionen. Serumprøver fra kræftpatienter og raske kontroller blev interagerede med mikrosfæren-antigen-komplekset til at måle autoantistofferne. Vi har udviklet en hurtig multiplex påvisningssystem til måling autoantistof signatur fra patientsera med minimal krydsreaktion. Et panel af syv autoantistofniveauer biomarkører har genereret en AUC 80% i adskille lungekræft fra raske kontrolpersoner. Denne undersøgelse er den første rapport ved at kombinere Luminex platform og HaloTag teknologi til at registrere humorale immunrespons hos kræftpatienter. På grund af fleksibiliteten af ​​Luminex teknologi, kan denne fremgangsmåde anvendes på andre tilstande, såsom infektiøs, neurologiske og metaboliske sygdomme. Man kan forestille at dette multipleks Luminex system samt panelet af syv biomarkører kunne bruges til at screene højrisiko-population med efterfølgende CT test baseret på blodprøve resultat

Henvisning:. Jia J, Wang W , Meng W, Ding M, Ma S, Wang X (2014) Udvikling af en Multiplex autoantistof Test til påvisning af lungekræft. PLoS ONE 9 (4): e95444. doi: 10,1371 /journal.pone.0095444

Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, USA

Modtaget: Oktober 6, 2013; Accepteret: 27 Marts 2014; Udgivet: 22 April, 2014

Copyright: © 2014 Jia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation (81172072), Science Foundation for Distinguished Young Scholars (R2101405), infrastruktur og Facility Development Program for Videnskab og Teknologi Institut for Zhejiang-provinsen (2011F10015), Major Videnskab og Teknologi Innovation Project of Hangzhou ( 20112313A01), Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-dødsfald for både mænd og kvinder over hele verden. I 2012 blev det anslået, at 226,160 mennesker ville blive diagnosticeret med lungekræft og 160,340 patienter vil dø af deres sygdom. Den nuværende 5-års samlet overlevelse for patienter er 16% indtil 2007, blandt de laveste af alle kræfttilfælde, der har forbedret marginalt i fortiden [1] årti. De fleste lungekræftpatienter er diagnosticeret på de sene /fjern etaper således med lav overlevelsesrate, på grund af manglen på opfattelige symptomer på den tidlige fase af tumorigenese [2].

De data antyder, at diagnosticere lungekræft når det er lille og lokalt definerede kan øge kur chance [3], [4]. Tidlig diagnose af lungekræft i væsentlig grad kan forbedre 5-årige overlevelsesrate på op til 48,8% i forhold til 3,3% af sene /fjern fase [5]. Derfor påvisning af tidlige fase lungekræft og identifikation af højrisikopatienter ville give potentielle adjuverende behandling og muligvis øge overlevelsen.

De nuværende metoder til diagnosticering af lungecancer kræver en biopsi og patologisk undersøgelse af væv normalt efter opdagelsen af ​​læsionen på brystet X-ray eller edb tomografi. Der er i øjeblikket ingen blodprøve til rådighed for lungekræft. Der er udviklet flere metoder til at identificere biomarkører til diagnosticering af lungecancer [6], [7]. Blandt disse har immunsystemet vist sig at producere autoantistoffer mod neoplastiske celler såvel som dysreguleret tumorassocierede antigener [8], [9], derfor påvisning af sådanne autoantistoffer har diagnostisk og prognostisk værdi [10], [11]. Vigtigst, eksisterer humorale immunreaktioner flere måneder eller år før de kliniske symptomer, således de autoantistoffer kan anvendes til tidlig diagnose af cancerpatienter [7], [9], [12]. Desuden er det rapporteret, at B-celler og B-celle-associerede antistoffer fremmer de novo carcinogenese [13], hvilket tyder på, at det humorale immunrespons kan spille en direkte rolle i udviklingen af ​​kræft.

(1) The HaloTag aminligander blev konjugeret til Luminex magnetiske perler via det aktiverede carboxylsyre med COOH radikale gruppe. Forskellige farver repræsenterer forskellige typer af Luminex-perler. (2) De rekombinante Halo-mærkede proteiner blev covalent immobiliseret på Luminex perler konjugeret med HaloTag ligand via reaktive chloralkan linkere på ligander. Hver perle blev immobiliseret med forskellige protein separat. (3) – (4) Som følge af den kovalente binding, hver perle-proteinkompleks gik enkeltvis gennem kraftigt vask og derefter kombineres for at gøre mikrosfæren pool. (5) protein-koblede mikrokugle pulje blev derefter ligeligt aliquotted i en 96-brønds plade. Hver brønd indeholder flere autoantigene biomarkører og kan anvendes til en enkelt serumprøve. (6) De autoantistoffer i sera bundet til antigenet konjugeret mikrokugler, og blev påvist ved R-phycoerythrin konjugeret anti-humant antistof. Signalet blev læst på Luminex 200 Bioanalyzer.

I denne undersøgelse beskrev vi en ikke-invasiv diagnostisk system på Luminex xMAP platform til at opdage serum autoantistof til diagnosticering af lungekræft. Kandidat- autoantigener blev udvalgt fra litteraturen og udtrykt ved in vitro transkription /translation system ved hjælp HaloTag ved N-terminus. Uden oprensning blev de rekombinante proteiner covalent immobiliseret på Luminex perle. Serumprøver blev inkuberet med vulsten-autoantigen komplekse at måle mængden af ​​autoantistoffer. Et panel af syv antigener, nemlig p53, NY-ESO-1, Livin, Ubiquilin1, BIRC, P62 og PRDX, blev anvendt i en multivariat statistisk model til at skelne cancerpatienter fra raske kontroller. Dette er den første undersøgelse detektere multiplex autoantistof på Luminex teknologi.

Materialer og metoder

ekspression af rekombinante proteiner

cDNA’erne for 14 autoantigener blev klonet i Flexi-vektoren ( Promega, USA) med en HaloTag ved N-terminus. Halo mærkede rekombinante proteiner blev udtrykt ved in vitro-transkription /translationssystem (Promega). Den HaloTag protein blev også produceret som negativ protein. Proteinerne blev påvist ved Western blot under anvendelse af kanin-anti-HaloTag antistof (Promega).

Western blot assay

Halo mærkede rekombinante proteiner blev udtrykt ved

in vitro

transkription /translation systemet, og derefter udsat for Western Blot. Kort fortalt blev i alt tre pi protein lysat læsset på 12% SDS-PAGE, så elektroforetisk overført til PVDF-membran (GE). Proteinet lysat med HaloTag proteinet kun (31 kDa) blev lastning som kontrol. Efter blokering blev membranerne blottet med kanin-anti-HaloTag antistof (Promega), efterfulgt af inkubation med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Proteintech). De protein signaler blev opdaget af ECL reagens (GE), og fotograferet ved hjælp af Alpha Innotech Fluor Chem FC2 chemiluminescens billedanalyse-system (Alpha Innotech).

patientserumprøver

Undersøgelsen blev godkendt af Institutional bestyrelse Zhejiang Academy of Medicine Sciences Review. Alle deltagere, der har givet sera fik skriftlige informerede samtykke.

De patienter med lokaliseret lungekræft blev indsamlet ved Onkologisk Afdeling, Hangzhou første folks hospital fra august 2010 til marts 2012. I alt 117 patientprøver opfyldt følgende kriterier for denne undersøgelse: 1) fra biopsi-verificeret klinisk lokaliseret lungekræft, 2) ingen forudgående lungekræft behandling, 3) dato for serum trukket var umiddelbart før datoen for kirurgi, 4) ingen andre samtidige maligne sygdomme og autoimmune sygdomme. Af disse 117 prøver blev 44 prøver udvalgt tilfældigt til at blive brugt i udvikling og validering af Luminex platform, mens 25 prøver blev anvendt til biomarkør udvælgelse, og resten 48 prøver blev anvendt til multiplex biomarkør analyse. Ligeledes at tjene som kontrolpersoner, hospitalet forudsat 110 serumprøver i aldersgruppen 29-76 uden tidligere kræft indsamlet mellem 2011 og 2012. Disse 110 prøver blev også tilfældigt opdelt i tre grupper i denne undersøgelse, specielt 35 prøver for Luminex udvikling, 25 prøver til biomarkør udvælgelse og 50 prøver til multiplex analyse.

Konjugation af HaloTag Amine ligand til Luminex microsphere

den mindste mængde HaloTag Amine (O4) ligand (Promega, USA) til den maksimale konjugation effektivitet på Luminex mikrosfærer (Luminex Corp.) blev bestemt som følgende. I alt 5 × 10

6 Luminex magnetiske mikrosfærer konjugeret med en serie af fortynding af HaloTag Amine ligand: 0,0016 mg, 0,008 mg, 0,04 mg, 0,2 mg, 1 mg. Kort fortalt blev mikrokuglerne suspenderet i en opløsning af 100 mmol /L MES (pH 6,0), indeholdende 5 mg /ml 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (Thermo Scientific) og HaloTag Amine Ligand. Efter 2 timers inkubering i mørke blev mikrokuglerne vasket og resuspenderet i 100 mmol /L MES (pH 4,5) og opbevaret ved 4 ° C.

Luminex mikrokugler kombineret med HaloTag Ligand blev inkuberet med oprenset HaloTag protein i en serie af fortynding fra 0 ug til 5 ug. MFI (middel fluorescens intensitet) repræsenterer bindende signal og blev opdaget af anti-HaloTag antistof.

Udvikling og validering af protein-mikrosfæren Complex

ligand-mikrosfære kompleks i forskellige perle regioner blev separat inkuberet med rekombinante HaloTag fusionsproteiner ved omgivelsestemperatur i mørke i 60 minut. Efter inkubation blev mikrosfærerne vasket med PBS indeholdende 0,1% BSA og 0,5% Tween 20, og resuspenderet i PBS indeholdende 0,1% BSA til validering.

Mængden af ​​protein konjugeret til mikrosfæren blev målt ved anvendelse kommercielt antistof ( kanin-anti-P62-antistof, kanin-anti-p53-antistof, Santa Cruz) ud for hver målprotein. Kort fortalt, serielle fortyndinger af hvert antistof (området fra 0 til 5 ug /ml i PBS, 1% BSA) blev inkuberet med 3.000 mikrokugler konjugeret med forskellige proteiner i en plade med 96 brønde i 1 time. Efter vask med PBS /1% BSA, blev mikrokuglerne inkuberet med R-phycoerythrin konjugeret sekundært antistof i 30 minutter. Det resulterende kompleks blev igen vasket og resuspenderet i PBS /1% BSA før læsning på Luminex 200 Bioanalyzer (Luminex Corp). MFI værdi repræsenterer bindende signal.

For at teste detektionen evne Luminex systemet, 44 cancer og 35 sundhed kontrolsera prøver blev tilfældigt udvalgt, og NY-ESO-1 autoantistof blev målt ved Luminexe system. Kort beskrevet forskellige mikrosfærer konjugeret med rekombinant NY-ESO-1 og HaloTag separat blev kombineret og opdelt i alikvoter i en 96-brønds plade. De serumprøver blev fortyndet ved 1:200 i PBS /1% BSA og inkuberet med perlerne natten over ved 4 ° C under omrystning. Autoantistoffet signaler blev derefter detekteret ved R-phycoerythrin konjugeret anti-humant polyklonalt antistof (Rockland) i 0,5 timer med konstant omrøring. Efter tre vaske blev reaktionen kompleks resuspenderes i PBS /1% BSA til læsning på Luminex 200 Bioanalyzer. MFI-værdier var repræsenteret ved MFI (NY-ESO-1) minus MFI (HaloTag).

De fluorescens intensiteter blev også sammenlignet med et kommercielt ELISA-kit (Biovalue, USA). Forsøget blev udført ifølge producentens instruktion.

Påvisning af autoantistof i serum

Forskellige mikrosfærer konjugeret med rekombinante proteiner og HaloTag separat blev kombineret og opdelt i alikvoter i en 96-brønds plade til påvisning af autoantistof i serum. De serumprøver blev fortyndet ved 1:200 i PBS /1% BSA og inkuberet med perlerne natten over ved 4 ° C under omrystning. Autoantistoffet signaler blev derefter detekteret ved Luminex som tidligere beskrevet.

Statistical Analysis

Både univariate og multivariate analyser blev anvendt. Forskelle mellem to grupper blev vurderet ved Students t-test. Sammenhængen mellem enkelt-plex og multi-plex systemer eller mellem ELISA og Luminex single-plex-system blev evalueret ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficient (R). Klasse forudsigelse blev undersøgt ved hjælp af BRB-Array Tools pakke (version 3.6) findes på https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html. Alle beregninger blev udført ved hjælp af sproget R statistisk programmering (https://cran.r-project.org/) og BioConductor pakker. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af softwaren SPSS 13.0 (SPSS), GraphPad Prism 5.0, og Excel. p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Den generelle holdning af undersøgelsen er afbildet i fig.. 1

For at covalent immobilisere rekombinante proteiner til Lumimex mikrosfæren, den HaloTag amin ligand blev først konjugeret til Luminex mikrokuglerne via den aktiverede carboxylsyre med COOH radikal gruppe ved forskellige koncentrationer (fig. 2A). Koblingseffektiviteten forøget på en koncentrationsafhængig måde, som påvist ved HaloTag standard protein (fig. 2A). Desuden MFI nået til plateauet ved 0,2 mg og 1 mg af amin ligand, der angiver mætning af aminen ligand på perleoverfladen. I denne undersøgelse blev 0,2 mg ligand anvendes til at konjugere mikrosfæren.

(A) Titrering af HaloTag Amine Ligand konjugeret på Luminex mikrosfærer. Det oprensede HaloTag standard protein blev anvendt til at påvise effektiviteten af ​​konjugation i en serie af koncentrationer. MFI (gennemsnitlig fluorescensintensitet) repræsenterer den bindende signal detekteres af anti-HaloTag antistof. (B) Validering af Luminex mikrosfære kompleks kombineret med HaloTag Amine ligand. Luminex perler blev koblet med 0,2 mg af HaloTag Ligand og signalerne blev påvist som (A).

Luminex mikrosfære konjugeret med 0,2 mg af amin ligand blev yderligere bekræftet under anvendelse HaloTag standard protein ved forskellige koncentration. Dataene viste, at den maksimale MFI selv på 1,25 ug af standard protein viser den optimale konjugation tilstand (fig. 2B).

For hurtigt screene kandidatlandene autoantigener, blev et panel af 14 proteiner udtrykt af

in vitro

transkription /translationssystem. Efter bekræftet ved Western blot (fig. 3A) blev de rekombinante fusionsproteiner med den HaloTag direkte inkuberet med mikrosfæren-ligandkomplekset uden proteinoprensning. Den kovalente binding mellem HaloTag og ligand former hurtigt under generelle fysiologiske betingelser og er meget specifikke og væsentlige irreversibel, hvilket gav et kompleks, der er stabilt selv under stringente betingelser. Proteinmængden immobiliseret til den enkelte Luminex mikrosfæren blev derefter undersøgt under anvendelse af kommercielle antistoffer mod de tilsvarende antigen-proteiner. Som vist i fig. 3B, MFI signaler blev målt på en koncentrationsafhængig måde påvist ved anti-P62 og anti-HaloTag antistoffer.

(A) Den repræsentative Western Blot af de rekombinante autoantigener med HaloTag ved N-terminus udtrykt ved in vitro transkription /translationssystem. (B) Validering af Luminex mikrokugler kombineret med de rekombinante HaloTag proteiner. De immobiliserede proteiner blev påvist ved anti-P62 og anti-HaloTag antistoffer separat og signalerne var på en koncentrationsafhængig måde. (C) Sammenligning af NY-ESO-1 autoantistof i sera påvises ved Luminex og ELISA. I alt 44 lungekræft og 35 raske kontroller blev udvalgt tilfældigt til at sammenligne NY-ESO-1 autoantistof målt ved Luminex systemet og ELISA-assay. R

2 = 0,92 indikerer høj korrelation mellem Luminex og ELISA-platforme med at opdage NY-ESO-1 autoantistof.

For at undersøge om Luminex systemet kan registrere autoantistof fra menneskelige prøve, 44 lunge cancer og 35 raske serumprøver blev tilfældigt udvalgt og NY-ESO-1 autoantistof blev sammenlignet ved anvendelse af Luminex systemet og en kommerciel ELISA-kit (Biovalue, USA). Begge assay-platforme detekteret signifikant større mængde af NY-ESO-1 autoantistof hos cancerpatienter i sammenligning med raske kontroller (fig. 3C). Unær lineær regressionsanalyse viste, at korrelationskoefficienten (Pearson R) var 0,92 for NY-ESO-1 antistoffer målt ved både Luminex og ELISA-teknikker, hvilket antyder, at to metoder havde en høj grad af enighed i detektion NY-ESO-1 autoantistof (

s

. 0,01)

Vi næste udviklet multiplex Luminex systemet. Fire protein-mikrosfære-komplekser (NY-ESO-1, p53, P62, og PRDX) samt en HaloTag konjugeret vulst som reference kontrol var ligeligt kombineret og fordelt i en 96-brønds plade. Den anti-p53 antistof blev anvendt til at detektere p53 mikrosfære i denne multiplex system. Dataene viste, at MFI signaler blev stærkt korreleret med dem af de enkelte vulst (enkelt-plex) (fig. 4A), hvilket viser multiplex system er gyldig for autoantistoffer detektion. Derudover, undtagen p53 mikrosfære, alle andre mikrosfærer herunder NY-ESO-1, P62, PRDX produceret baggrundssignaler indikerer der var ingen krydsreaktivitet mellem perlerne i dette multipleks (Fig. 4B).

(a) Sammenligning af p53 koblede perler i singleplex (individuel perle) og multiplex (flere perler) system. MFI-værdi blev detekteret ved en serie fortynding af p53 antistof. (B) nr krydsreaktivitet mellem forskellige biomarkører i multiplex system. Et multipleks system indeholdende fem mikrokugler kombineret med NY-ESO-1, p53, P62, PRDX og HaloTag separat inkuberet med p53-antistof, og kun de p53 mikrokugler omsættes med anti-p53-antistof, mens andre mikrosfærer detekteret baggrunden MFI-værdier. (C) Signalet korrelation af p53 mikrokugler i singleplex og multiplex system. (D) Samme som (C), men under anvendelse af P62 koblede mikrokugler.

Dernæst forsøgte at teste korrelationen af ​​både single- og multi-plex Luminex systemer ved at sammenligne autoantistoffet signaler af tilfældigt udvalgte serumprøver detekteres af begge systemer separat. Som vist i fig. 4C og fig. 4D, korrelationskoefficienten (Pearson r) var 0,84 for p53 mikrosfære (

s

0,01), mens 0,81 for p62 mikrosfære (

s

0,01), The Pearson r var også over 0,80 for andre protein-mikrosfære-komplekser (data ikke vist), hvilket indikerer den høje korrelation mellem single- og multi-plex systemer.

Baseret på multiplex Luminex systemet, screenede vi et panel af 14 kandidat autoantigener til detektere de cirkulerende antistoffer fra uafhængige 25 lungekræft og 25 raske kontrol tilfældigt udvalgt fra prøven kohorte i denne undersøgelse. Syv autoantigener, herunder P62, BIRC, Livin-1, p53, PRDX, NY-ESO-1 og Ubiquilin, produceret de bemærkelsesværdigt højere MFI signaler i lungekræftpatienter sammenlignet med raske kontroller (Mann-Whitney p værdi 0,05) (Fig . 5).

Derefter bestemte vi, om panelet i 7 biomarkører kan anvendes til noninvasiv detektion af lungecancerpatienter. Vi screenede uafhængige 48 lungekræft og 50 kontrol serumprøver med forskellige lungekræft typer og stadier af Luminex multiplex system. De grundlæggende parametre for de 48 kræftpatienter og 50 kontroller er opsummeret i tabel 1, herunder alder, køn, rygning og drikke status. Efter separation i kræft og kontrol klasser blev nøjagtigheden af ​​binære udfald forudsigelse estimeret ved hjælp af forskellige machine learning algoritmer til rådighed på BRB Array Tools. Hver prøve værdi for hver af disse 7 biomarkører blev multipliceret med de tilsvarende koefficienter afledt af univariate logistiske regressioner på uddannelse sæt med kræft /kontrol som en binær respons variabel, og derefter værdierne blev i alt. De oprettede index scores blev derefter vurderet af ROC-kurve, som gav en ren indeks for en test nøjagtighed ved at plotte følsomhed mod 1- specificitet for hvert resultat værdi af testen. Tre prædiktionsalgoritmen blev anvendt til frembringelse ROC, herunder forbindelse kovariant prædiktor (CCP), diagonal lineær diskriminant analyse (DLDA), og Bayesian forbindelse kovariant prædiktor (BCCP). Især analysen gav en meget sammenlignelig ROC for alle tre algoritmer med AUC på 0,82 (CCP), 0,81 (DLDA), 0,81 (BCCP) (fig. 6), hvilket viser den stærke evnen til skelnen af ​​de 7 biomarkører. Ingen sammenhæng med alder, køn, rygning eller drikke status blev observeret for denne biomarkør panel.

Diskussion

Påvisning af de cirkulerende antistoffer mod tumor associerede antigener er en lovende tilgang til tidlig diagnosticering af kræft, og de teknologier er ofte blevet udviklet [14], [15]. Til dato ELISA er den konventionelle metode til påvisning af autoantistof i serum, men dens anvendelse på multiplexing autoantistof signatur er begrænset. For nylig blev protein microarray og Luminex xMAP teknologier vedtaget til måling af serologisk autoantistof panel [16], [17].

Luminex xMAP er en høj hele platform med overlegen følsomhed og specificitet end ELISA [18], [19 ], [20]. I denne undersøgelse, beskrev vi en simpel Luminex metode baseret på HaloTag teknologi til at registrere de autoantistoffer fra patient sera. De HaloTag proteiner blev covalent bundet til chloralkan linkere konjugeret til mikrosfærerne [21], [22]. På grund af den specifikke covalent binding, er de rå Halo-mærkede fusion proteinlysater selektivt immobiliseret til Luminex perler og efterfølgende gennemgår kraftig vasketrin, således at springe den kedelige proteinoprensning procedure.

Det er velkendt, at multiplexing enkelte biomarkører (dvs. autoantistof profilering) i væsentlig grad kan øge følsomheden og specificiteten af ​​kræft biomarkører i at diskriminere de kræftpatienter fra raske kontrolpersoner [23]. Formålet med denne undersøgelse var at drage fordel af Luminex teknik til at multiplekse et panel af 14 tumorassocierede autoantigener ved detektering lungekræftpatienter. Disse autoantigener blev udvalgt baseret på deres præstationer i skelne cancere fra raske kontroller er beskrevet i litteraturen. For eksempel blev p53 autoantistof detekteret i ca. 15% af kræftpatienter [24], [25]. Ubiquilin 1 viste sig at være en lovende biomarkør for lungekræft med en AUC på over 0,7 [26]. Livin-1 autoantistoffer blev rapporteret i 19 af 37 lungekræftpatienter (51,3%) [27]. Desuden blev 25 (47%) af 53 NSCLC-patienter testet positive for autoantistoffer mod PRDX i seraene [28]. Autoantistof til NY-ESO-1, BIRC, og P62 blev også påvist i patienter med lungecancer med 20%, 19,5% og 18,8% sensitivitet henholdsvis [29], [30], [31].

Multiplex den tumor-associerede antigener er blevet grundigt undersøgt ved ELISA [32], [33], [34], [35], [36] eller microarray [37]. Denne undersøgelse er den første rapport ved at kombinere Luminex platform og HaloTag teknologi til at registrere humorale immunrespons i patienter med lungecancer. Panelet af 7 biomarkører opnået over 80% nøjagtighed i at opdage lungekræft fra raske kontrolpersoner. Disse autoantistoffer har imidlertid ingen sammenhæng med tumor histologier, stadier og typer på grund af grænsen for stikprøvestørrelsen. Derfor vil opfølgende undersøgelse kræves i en stor patient kohorte med en blanding af tumor typer og stadier at validere resultaterne af autoantistoffer tværs tumor histologier og typer, især sammenhængen mellem sygdom malignitet og autoantistof titer. Man kan forestille at dette multipleks Luminex system samt panelet af syv biomarkører kunne anvendes til at screene den høje risikogrupper med efterfølgende CT test baseret på blodprøve resultat.

Udnyttelse immunresponset på tumorer giver en unik mulighed for at udvikle nye værktøjer til serologisk påvisning af kræft samt en bly til terapi. En test baseret på påvisningen af ​​autoantistoffer til tumorantigener i sera fra patienter kunne være af stor betydning for tidlig påvisning af kræft på grund af den langvarige tidsforløbet af carcinogenese og fordi et påviseligt niveau af antistoffer mod kræftfremkaldende stimulus kunne danne længe før tumoren fænotype opstår. Ligesom andre kræftformer, lungekræft udvikler sig som resultaterne af afsporing af heterogene og multiple regulatoriske processer. Derfor er det ikke en enkelt biomarkør, der skal belyses. Multipleksede biomarkør mønstre har en væsentlig højere positiv prædiktiv værdi end enlige markører i kræsne syge patienter fra kontroller ikke-kræft.

autoantistof test lover godt, men meget mere forskning med omfattende prøver er forpligtet til at bekræfte testens pålidelighed og at tilpasse teknikken til masse-screening. Derudover vil lægerne også nødt til at lære, hvis tidlig diagnose forbedrer resultatet for patienter med lungekræft, og dermed hjælpe til at producere antistoffer til sygdomsbehandling. Derfor bygge bro mellem grundforskning og klinisk praksis repræsenterer det vigtigste mål i den nærmeste fremtid at gøre det muligt for læger at skræddersy strategier risiko justeret screening og behandling for nuværende patienter med lungecancer.