PLoS ONE: C26 Kræft-induceret muskelsvind Er IKKβ-afhængig og NF-kappaB-Independent

Abstrakt

Eksisterende data tyder på, at NF-kappaB signalering er en vigtig regulator af kræft-induceret skeletmuskelsvind. Imidlertid identifikation af komponenterne i denne signalvej og de NF-KB transkriptionsfaktorer, som regulerer wasting er langt fra komplet. I musklerne i C26 tumor bærende mus, overekspression af dominant negativ (D. N.) blokeret IKKβ muskelsvind med 69% og kBa super repressor blokeret spilde med 41%. I modsætning hertil overekspression af D.N. IKKα eller D.N. NIK blokere ikke C26-induceret spilde. Overraskende overekspression af D.N. p65 eller D.N. c-Rel påvirkede ikke signifikant muskelsvind. Genom-dækkende mRNA-ekspression arrays viste opregulering af mange gener tidligere impliceret i muskelatrofi. For at teste om disse opreguleres gener var direkte mål for NF-KB transkriptionsfaktorer, sammenlignede vi hele genomet p65 binding til DNA i kontrol og kakektiske muskel under anvendelse chip-sekventering. Bioinformatisk analyse af chip-sekventering data fra kontrol og C26 muskler viste meget lidt p65 binding til gener i kakeksi og lidt at antyde, at opreguleret p65 bindende påvirkninger genekspressionen forbundet med muskel baseret kakeksi. De p65 Chip-seq data stemmer overens med vores fund af nogen signifikant ændring i protein-binding til en NF-KB oligonukleotid i en gelforskydningsassay, manglende aktivering af en NF-KB-afhængigt reportergen, og ingen virkning af dnp65 overekspression i muskler af tumorbærende mus. Taget sammen viser disse data understøtter ideen om, at selv om inhibering af kBa, og især IKKβ, blokerer kræft-induceret wasting, den alternative NF-KB-signalvejen er ikke påkrævet. Desuden downstream NF-KB transkriptionsfaktorer, p65 og c-Rel synes ikke at regulere transkriptionelle forandringer som følge af den C26 tumoren. Disse data er i overensstemmelse med den voksende mængde litteratur viser, at der er NF-KB-uafhængige substrater af IKKβ og kBa der regulerer fysiologiske processer

Henvisning:. Cornwell EW, Mirbod A, Wu CL, Kandarian SC, Jackman RW (2014) C26 Kræft-induceret muskelsvind Er IKKβ-afhængig og NF-kappaB-Independent. PLoS ONE 9 (1): e87776. doi: 10,1371 /journal.pone.0087776

Redaktør: Imed Eddine Gallouzi, McGill University, Canada

Modtaget: Juli 9, 2013; Accepteret: December 30, 2013; Udgivet: 29 Jan 2014

Copyright: © 2014 Cornwell et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) award AR060217. (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm.) De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Konkurrerende interesser :. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cachexi er en metabolisk tilstand forbundet med mange kroniske sygdomme, og det er præget af alvorlige spild af skeletmuskulatur og fedtvæv, som ikke kan vendes ved at øge kalorieindtag [1]. Cancer kakeksi ses i de fleste avancerede cancere, men det er mest almindeligt ses i kræft i lungerne og øvre GI-kanal [1]. Kræftpatienter med kakeksi har en lavere livskvalitet på grund af kompromitteret immunfunktion, insulinresistens, svaghed og træthed [2]. Patienter med selv mild kakeksi kan ikke tåle kemoterapi, hvilket yderligere forværrer deres sygdom [3]. Cachexi skønnes at bidrage til dødsfald af ca. 30% af kræftpatienter [4]. For alle alvoren af ​​denne lidelse, behandlinger forblive palliativ. Da de mere alvorlige konsekvenser af kakeksi synes at opholde sig med skeletmuskulaturen tab [1], at udvikle en bedre forståelse af den cellulære signalering mekanismer og genregulering i muskel kunne give nye terapeutiske strategier til behandling af denne tilstand.

Forskning på forskellige typer af kræft har foreslået en rolle for NF-KB-signalering og NF-KB transkriptionel regulering i muskelsvind [5], [6], [7]. Inhibering af den klassiske NF-KB-vejen, ved overekspression af IkappaBalpha super repressor (IκBαSR), blokerede muskelsvind i Lewis lungecarcinom (LLC) tumorbærende mus med 50% [5]. Den prototypiske NF-KB transkriptionsfaktoren, p65 (Rel A), udviste forøget binding i et ELISA-baseret NF-KB oligonucleotid-assay i muskel fra mus med LLC. Den øgede binding blev vendt, da IκBαSR blev overudtrykt i muskel, tyder på, at p65 er en NF-KB-transskription faktor involveret i muskelsvind grund af kræft, i hvert fald i mus med LLC [5]. Phosphorylering af p65 i serin 536, menes at forøge transskriptionel aktivitet, er forøget i muskel fra C26 tumorbærende mus [6], og i muskler fra mennesker med pancreascancer [8]. På den anden side har nogle resultater om betydningen af ​​NF-KB transkriptionsfaktorer i kakeksi været usikker. For eksempel viste gel shift-assays små stigninger i binding af transkriptionsfaktorer til en NF-KB oligonukleotid i muskler fra C26 tumorbærende mus [6], [9], og i et andet studie var der ingen stigning i protein binding til et NF- KB oligonukleotid i kakektiske rotter med Yoshida ascites hepatoma [10]. Det er muligt, at forskellige typer af kræft inducerer muskelsvind via forskellige cellulære mekanismer. Ikke desto mindre har kun en NF-KB-signalering protein (kBa) og en NF-KB-transskription faktor (p65) blevet undersøgt i kræft-induceret muskelsvind, og vi kender ikke atrofi fremkaldende gener, der målrettet af NF-KB-transskription faktorer.

formålet med den foreliggende undersøgelse var at identificere de kendte mammale NF-KB signalproteiner og NF-KB transkriptionsfaktorer, som regulerer muskelsvind grund af kræft. Et andet formål var at identificere de NF-KB target gener på en genom-plan med henblik på at afgøre, om en NF-KB transkriptionel netværk regulerer kræft-induceret muskelsvind. Vi testede, om NF-KB signalproteiner er nødvendige for muskelsvind ved overekspression dominant negativ (D. N.) former for opstrøms NF-KB kinaser. Disse er inhibitoren af ​​kappaB kinase alpha (IKKα), IKKβ, og NF-KB inducerende kinase (NIK). Rolle kBa blev testet ved overekspression af en trans-dominant super repressor form af kBa (IκBαSR). Hvorvidt NF-KB transkriptionsfaktorer Rel A (p65) eller c-Rel er nødvendige for muskelsvind blev testet ved overekspression af D.N. p65 eller D.N. c-Rel, hhv. NF-KB transkriptionsfaktor binding til en NF-KB oligonukleotid og NF-KB transkriptionel aktivitet af en reporter blev målt i kakektiske muskler. For at bestemme om de kanoniske NF-KB transkriptionsfaktor, p65, bundne målgener som kunne være knyttet til atrofi regulering, udførte vi chip-sekventering i muskler fra kontrol- og tumor- bærende mus i forbindelse med måling af global genekspression som en funktionel mål for kakeksi-medieret genekspression.

Dette er den første dybtgående undersøgelse af den rolle af NF-KB-signalering og NF-KB transkriptionsfaktorer i reguleringen af ​​muskelsvind på grund af kræft. Selvom hæmning af kBa, og især IKKβ aktivitet, vendte markant muskelsvind, var der ingen effekt på fiber spilde på grund af hæmning af IKKα eller NIK. Overraskende overekspression af dominant negativ p65 eller c-Rel udviste ringe eller ingen virkning på muskelfibrene wasting. Endvidere var der ingen ændring i NF-KB transkriptionsfaktorbindende i en gelforskydningsassay eller i NF-KB reporter-aktivitet. Vigtigt er det, så er der opregulering af atrofi eller cytokingener fundet af genekspression microarrays ikke medieret af p65-indeholdende transkriptionsfaktorer som vurderet af Chip-seq. Vores resultater er i overensstemmelse med de af Cai et al. [5] viser en rolle for kBa i kræft spilde, og for første gang viser vi, at IKKβ er nødvendig for udvikling af kræft kakeksi, men IKKα og NIK er ikke. Vores dybdegående analyse af NF-KB-signalering og transskription under kræft kakeksi viser, at IKKβ regulerer genekspression ved andre end NF-KB, i det mindste i skeletmuskulatur transkriptionsfaktorer løbet C26 kræft kakeksi. Disse resultater viser en uventet, men vigtig facet af reguleringen af ​​kræft-induceret muskelsvind.

Metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i guide for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Charles River Campus Boston University Institutional Animal Care og brug Udvalg (protokol nummer: 12-016). Alle operation blev udført under ketamin /xylazin anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Alle personer, der arbejder med dyr har gennemgået obligatoriske IACUC uddannelse og årlig gennemgang: https://www.bu.edu/orctraining/animal/lacf/

Cells

C26 adenocarcinomaceller (National Cancer. Institute, Frederick, MD) blev udpladet og opretholdt ved 37 ° C, 5% CO

2 i Dulbeccos modificerede Eagle-medium, høj glucose (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen), 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen), og 1% L-glutamin (Invitrogen). Forud for inokulering i mus blev C26-celler trypsiniseret og vasket to gange med phosphatbufret saltvand og derefter resuspenderet i en 1:01 opløsning af 1X PBS og matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Dyr

Otte uger gamle, mandlige CDF1 mus indkøbt fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) blev anvendt til alle forsøg. Musene blev behandlet i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Dyr blev opretholdt på en 12:12 L /D cyklus, blev huset individuelt, og fik adgang til mad og vand

ad libitum

. Efter tre dages akklimatisering blev dyrene randomiseret til en ikke-tumor kontrolgruppe eller en C26 tumorbærende gruppe. Kontroldyr modtog et inokulum på 150 pi 1 × PBS /matrigel (01:01) subkutant i den højre og venstre flanker. Tumor-bærende dyr fik et inokulum på 5,0 × 10

5 C26 celler suspenderet i 150 uL PBS /matrigel (01:01) injiceret subkutant i højre og venstre flanker; dette blev udført på let bedøvede mus (40 mg /kg ketamin +5 mg /kg xylazin).

Plasmid-DNA injektion i muskel

Plasmid-DNA blev isoleret ved anvendelse af QIAGEN endotoxinfrit Mega Kit i henhold til producentens anvisninger. Plasmid-DNA blev injiceret i musklen 10 dage efter tumor podninger, som tidligere [11] beskrevne. Kort beskrevet plasmid DNA’et var ethanol-præcipiteret og resuspenderet i 0,45% sterilt saltvand /ddH

2O. Alle mus, der modtog kirurgi fik profylaktiske behandlinger med 0,1 mg /kg Buprenorphin injektion før operation. Mus blev bedøvet med ketamin (80 mg /kg) og xylazin (10 mg /kg). Tibialis anterior (TA) muskler fra hvert dyr blev injiceret med 35 ug af ekspressionsplasmid i 25 pi 0,45% sterilt saltvand under anvendelse af en 29-gauge insulinsprøjte. Efter plasmidet injektion blev muskler stimuleret med en lav spænding elektrisk strøm ved hjælp af to-paddle elektroder [12], der leverede 6 pulser på 86 V /cm i 20 ms med en interpulse interval på 200 ms (Electro Square Porator ECM 830, BTX) . Dette er en lav-dosis elektroporation protokol, der ikke inducerer skader [13], [14], [15]. På dag 25 efter inokulering blev TA muskler fjernet fra både kontrol- og C26 tumorbærende mus, vejet og enten lynfrosset i flydende nitrogen til biokemisk analyse eller monteret på tungespatler, indlejret i væv-frysemedium, og frosset i flydende nitrogen-afkølet isopentan til histokemisk analyse. Injektion af NF-KB reporterplasmidet blev udført på samme dag som tumorcelleinokulering. Injektion af d.n.p65-EGFP blev udført på dag 6 efter tumor podning

plasmider

De ekspressionsplasmider anvendte følgende:. D.N. IKKα-EGFP, D.N. IKKβ-EGFP, IκBαSR-EGFP, D.N. NIK-GFP, D.N. p65-EGFP, og D.N. c-Rel-EGFP. Den D.N. IKKα-EGFP (K44M) og D.N. IKKβ-EGFP (K44M) ekspressionsplasmider koder EGFP fusionsproteiner af kinase-døde former for IKKα og IKKβ, som vi har beskrevet i detaljer [11]. Konstruerede vi også IκBαSR-EGFP-fusionen plasmid, som vi har beskrevet i detaljer [16]. Den D.N. p65 (313) er en trunkeret form af p65 mangler de C-terminale transaktiveringsassays domæner og var en gave fra D. Guttridge [17]. Vi har oprettet en D.N. p65-EGFP-fusion plasmid ved kloning af N-terminale 313 aminosyrer-kodende DNA-sekvensen af ​​p65 i HindIII-Sall-stederne af pEGFP-N1 (313 + 238 = 551 a.a.). Vi verificerede kloning ved sekventering af plasmidet og testet den dominante negative funktion i C2C12 myorør, hvor D.N. p65-EGFP var i stand til at blokere TNFa aktiveringen af ​​en NF-KB reporter af 90% (figur S1A). For at skabe et D.N. c-Rel-EGFP plasmid, anvendte vi et muse c-Rel skabelon, en gave fra T. Gilmore, kopiering nukleinsyresekvensen for Rel homologi domæne af genet indeholdende a.a. 1-288 (mangler de to N-terminale transaktiveringsassays domæner) og tilsætning restriktionssteder til kloning af fragmentet i ramme i EcoRI-Kpnl-stederne i pEGFP-N1. Den resulterende D.N. c-Rel-EGFP insert blev kontrolleret ved sekventering og fungerede som en dominerende negativ Rel fordi dens udtryk reducerede NF-KB reporter niveauer i C2C12 myorør (Figur S1B). Den D.N. NIK-GFP-ekspressionsplasmid, en gave fra A. Kumar, koder for en kinase dødt form for NIK og EGFP fra en separat cistron [18]. Salg

Immunhistokemi Salg

TA muscle fiber tværsnitsarealer plasmid-transficerede fibre (udtrykker grøn fluorescens fusionsproteiner) blev sammenlignet med fiber områder på de samme områder, som ikke tog op plasmidet i begge tumorbærende mus og kontrolmus. Som tidligere beskrevet [11], frosne snit blev taget fra midten af ​​bugen af ​​TA (7,5 um tykt), monteret på Tissue Tack objektglas (Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA) og fikseret i 4% paraformaldehyd. Tværsnit blev vasket, blokeret i 10% BSA og inkuberet med kanin-anti-laminin 1:200 (L9393; Sigma-Aldrich) i 1% BSA efterfulgt af en Texas Red-X gede anti-kanin IgG fluorescerende farvestof-konjugeret sekundært antistof 1 :200 (T-6391, Invitrogen). Sektioner blev monteret på et dækglas med Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Billeder blev visualiseret ved 20X forstørrelse under anvendelse af et inverteret lysmikroskop (Nikon Eclipse TS 100). Alle billeder blev taget med et SPOT RT kamera (Diagnostiske Instrumenter, Sterling Heights, MI, USA). Fiber tværsnitsareal blev beregnet under anvendelse af Meta-Morph Imaging System (Universal Imaging, Glendale, WI, USA). Det gennemsnitlige antal fibre målt pr muskel var 200. kontroller

Isolering af rå kerneekstrakter

Rå nukleare ekstrakter fra hind lemmer muskler fra den 13. til 23 dage C26-podede CD2F1 hanmus og alder matchede blev isoleret i henhold til Kumar og Boriek [19] med visse modifikationer. Alle isoleringstrin og spins blev udført ved 4 ° C under anvendelse af kølede buffere. Flash frosne muskler blev suspenderet ved 1 mg muskel vægt pr 18 pi puffer (10 mM HEPES [pH 7,9], 10 mM KCI, 3 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA [pH 8], 0,1 mM EGTA, 0,1% Triton X-100 , 1 mM dithiothreitol, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid, og protease inhibitor cocktail) og straks homogeniseret på is. Homogeniserede muskler blev inkuberet på is i 5 minutter efterfulgt af 20 sekunders kraftig vortex. Kerner blev spundet ved 3000 ×

g

i 10 min. Supernatanten blev fjernet og opbevaret ved -80 ° C. Nukleare pellets blev vasket med 1 ml modificeret cytoplasmatisk ekstrakt puffer uden Triton X-100 og centrifugeret ved 3000 x

g

i 3 min. Pellets blev resuspenderet i 4 pi kerneekstrakt buffer (20 mM HEPES [pH 7,9], 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 25% glycerol, 1 mM dithiothreitol, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid, og protease inhibitor cocktail) pr mg oprindelige muskel vægt. Resuspenderede nukleare pellets blev inkuberet på is i 30 minutter med 15 sekunders kraftig vortexbehandling hver 10 min. Prøver blev centrifugeret ved 16.000 x

g

i 20 minutter og kerneekstrakt (supernatant) blev fjernet og opbevaret ved -80 ° C.

Elektroforetisk mobilitet (EMSA)

Protein koncentrationen af ​​rå muskel kerneekstrakter blev bestemt under anvendelse af Bradford-assayet (Bio-Rad Protein assay Dye Reagent, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Dobbeltstrenget NF-KB IRDye 700 infrarødt farvestof endemærket oligonucleotid, 5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 ‘(understregning indikerer NF-KB-bindingssted), blev indkøbt fra LI-COR Biosciences (Lincoln, NE, USA). Konsensus umærket konkurrent NF-KB oligonukleotid blev købt hos Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA, USA). EMSA bindende reaktion blev udført ved hjælp af Odyssey EMSA Buffer Kit (LI-COR Biosciences) med visse modifikationer. Totalt reaktionsvolumen blev fremstillet i 20 pi. Bindingsreaktion reagenser blev tilsat til renset vand i følgende rækkefølge: 2 pi bindingspuffer (100 mM Tris, 500 mM KCI, 10 mM DTT; pH 7,5), 2 pi 25 mM DTT /2,5% Tween-20, 1 ug /ul poly dI • dC i 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5, 50 fmol NF-KB IRDye 700 infrarødt farvestof endemærket oligonukleotid, og 15-20 ug kerneekstrakt. I reaktioner med umærket NF-KB konkurrent, umærket og mærkede oligonukleotider blev blandet før tilsætning til bindingsreaktionen. Bindingsreaktioner blev forsigtigt blandet og inkuberet i 25 min, ved stuetemperatur i mørke. Før isætning af prøver, 2 pi Orange Loading Dye (65% vægt /volumen sucrose, 10 mM Tris-HCI pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,3% vægt /volumen Orange G) blev tilsat til 20 pi reaktion og blandet forsigtigt.

DNA-proteinkomplekser blev separeret fra frit oligonucleotid på ikke-denaturerende 5% Tris-borat-EDTA, PAGE Ready geler (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Prøver blev elektroforeret ved 76 V i 2 timer ved stuetemperatur i mørke. Protein bundet til mærket oligonukleotid-komplekser blev visualiseret ved anvendelse af en Odyssey infrarød billedprocessor (LI-COR Biosciences).

NF-KB-afhængige reporteraktivitet

Ved de angivne tidspunkter, TA muskler transficeret med en NF-KB-afhængigt luciferase reporter blev høstet og derefter homogeniseret i 1 ml Passive Lysis Buffer (Promega, Madison, WI) med protease og phosphataseinhibitorer (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Homogenater blev centrifugeret ved 5.000 x

g

ved 4 ° C i 20 minutter. Supernatanten blev opsamlet og blandet med luciferaseassayreagens (Promega) ifølge producentens instruktioner. Luciferaseaktivitet blev målt ved en TD-20/20 luminometer (Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA).

Western blot-analyse

Proteinkoncentration af muskel lysater i passiv lysepuffer blev bestemt under anvendelse Bradford assay (Bio-Rad Protein assay Dye Reagent, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Halvtreds til 75 mikrogram protein blev denatureret og størrelsesfraktioneret på 4-15% SDS-polyacrylamidgeler. Proteiner blev overført til en Immobilon-FL polyvinylidenfluoridmembran (Millipore, Bedford, PA, USA), blokeret i Odyssey blokerende buffer (LiCor Biotechnology, Lincoln, NE, USA) og inkuberet med det passende primære antistof ifølge producentens instruktioner. Antistoffer inkluderet: anti-IKKα /IKK1 (IMG-5477, IMGENEX, San Diego, CA, USA), IKKβ /IKK2 (# 2684), NF-κB2 (p100 /p52; # 4882), og p-kBa (# 9246 ) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), kBa (sc-371), NF-KB p65 (sc-7151), c-Rel (sc-6363), og NIK (sc-7211) (Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA, USA). Anti-GAPDH (G-9545) blev anvendt som en loading kontrol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Alexa Fluor 680 fluorescerende farvestof-konjugeret sekundært antistof (Invitrogen) blev anvendt til visualisering med Li-Cor Odyssey infrarød billeddannelse systemet beskrevet tidligere [20].

RNA-isolering

Gastrocnemius og plantaris muskler var høstet fra bedøvede kontrol og tumorbærende mus (25 dage efter inokulering), snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere forarbejdning. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Den ekstraherede totale RNA blev yderligere oprenset ved anvendelse af en RNase-fri DNase I (Qiagen, Valencia, CA, USA) og en RNeasy Mini kit (Qiagen) som beskrevet tidligere [21]. Ekstraherede RNA blev kvantificeret ved UV-spektrofotometri og kvalitet kontrolleres af en 1% denaturerende agarosegel. Prøver blev også bekræftet af Bioanalyzer 2100 analyse og havde en minimal RIN antal 8,0 (Agilent, Palo Alto, CA, USA).

microarray analyse

For microarray analyse, de RNA-prøver er beskrevet ovenfor blev sendt til Boston University Medical center Microarray Core Facility for forstærkning, mærkning, og hybridisering på en mus Affymetrix Gene 1.0 ST array (Santa Clara, CA, USA) ifølge producentens anvisninger for at måle ekspressionen af ​​28,132 godt kommenterede gener. I alt 6 array-billeder (3 kontrol muskel prøver og 3 C26 muskel prøver) blev erhvervet af GeneChip Scanner 3000 TG og kvalitet vurderet af Affymetrix Expression Console (Santa Clara, CA, USA). Genekspression signalværdier blev dannet ved Expression Fil Creator modul af GenePattern platform (Broad Institute, Cambridge, MA) og robust multi-array analyse algoritme (RMA) blev anvendt for data forbehandling [22]. Brainarray MoGene 1.0 ST custom CDF fil V.13 blev brugt til sonde annotation [23]. . Både

cel

filer og udtryk værdier blev deponeret i MIAME kompatibel NCBI Gene Expression Omnibus med tiltrædelsen nummer: GSE48363 (link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc. cgi token = rnupvmqqyocggpk ? acc = GSE48363). Differential genekspression blev beregnet ved hjælp af sammenlignende Marker Selection modul i GenePattern der sammenligner gennemsnitlige forskelle mellem kontrol og C26 grupper ved to-vejs parametriske t-test. Parametre, der anvendes til at identificere gener, der blev differentielt udtrykt i muskel fra tumorbærende mus var:

P

-value≤0.05,

q

-value≤0.05, og fold ændre større end 1,5 gange . De op- eller ned-regulerede gen lister blev uploadet til DAVID Bioinformatik database for funktionel annotation og gen-ontologi opgave baseret på den biologiske proces af de gener sammenlignet med

Mus musculus

genom hvor tærsklen af ​​EASE score (en modificeret Fisher Exact P-værdi) blev fastsat til 0,01 og et gen optælling af 2.

chip-sekventering

Gastrocnemius minimum og plantaris muskler blev isoleret fra kontrol (dvs. ikke-tumor -fyldt) og C26 tumorbærende mus på dag 25 efter podning med tumoren. Frisk dissekeret muskel blev hakket og tværbundet i 1% formaldehyd i 15 minutter, standset med glycin og derefter nedfrosset i flydende nitrogen. For hver betingelse (dvs. kontrol eller C26) plantarflexor muskel fra fire ben blev samlet, homogeniseret, og chromatin isoleret som vi beskrevet tidligere [21]. Dette materiale blev sonikeret for at give kromatin-fragmenter, der gennemsnitligt 250 bp. En alikvot af sonikeret kromatin blev sat til side til anvendelse som input fraktion til chip-PCR. Resten af ​​kromatin blev fortyndet i IP buffer og opdeles i en gruppe for inkubering med p65 antistof (Santa Cruz SC-372X) og en gruppe uden primært antistof; dette blev gjort for kromatin fra både kontrol og C26-grupper. Prøver med og uden primært antistof blev inkuberet i 16 timer ved 4 ° C under konstant lav hastighed blanding og derefter de antistof-chromatin komplekser blev indfanget med protein G magnetiske perler. Kromatin blev elueret fra perlerne og tværbindinger reverserede, efterfulgt af pronase /RNase behandling og udfældning af DNA. En tiendedel af materialet blev anvendt til PCR for et gen allerede vist sig at have robust p65 bindende for at teste p65 chip. Tre forskellige DNA-biblioteker blev foretaget: kontrol p65 chip, C26 p65 chip, og chip uden primære antistof. Bibliotekerne blev fremstillet til high throughput sekventering under anvendelse af Illumina chip-seq Library kit. En portion af hvert bibliotek blev undersøgt ved acrylamid elektroforese og Sybr-guld-farvning til at estimere kvaliteten efter størrelse og intensitet af produktet, som vises som et smear med en gennemsnitlig størrelse på 350 bp. Hele proceduren til fremstilling af tre biblioteker blev gentaget en anden gang med nye muskler prøver for at have to chip-seq biblioteker for hver af de tre grupper. Bibliotekerne blev sendt til The Whitehead Institute (Cambridge, MA), hvor de blev renset for adapter dimerer hjælp Ampure XL perler. De rensede biblioteker blev testet ved Bioanalyzer og qPCR kvalitetskontrol blev udført for at bestemme, hvor meget af hvert bibliotek at bruge. Bibliotekerne blev sekventeret under anvendelse Illumina Solexa sekventering på en GA II sequencer. De resulterende sekvenser fra kontrol og C26 prøver blev justeret til musegenomet (MM9 udgave) under anvendelse eland. Sekvenserne blev sendt til vores laboratorium i eland-format.

De linjeføringer for de to uafhængige kontrolprøver blev samlet, og det samme skete for de to C26 prøver. I hvert tilfælde blev dette gjort ved at kombinere .bam former for tilpasninger på Galaxy hjemmeside. Sekvenserne blev derefter evalueret med FastQC pakke af kvalitetskontrol test, der blev opnået som et enkeltstående program fra Brabaham Institute (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Efter den indledende FastQ analyse to operationer blev udført på chippen-seq data: 1. vi fjernet PCR dubletter ved hjælp samtools rmdup via Galaxy, og 2. igen ved hjælp samtools, tog vi fordel af kortlægning etiketter i Eland data til at isolere kun læser kortlagt på unikke steder i muse-genomet. Sekvens læser var 35 eller 36 basepar. De tre filer af chip-seq data var: kontrol p65 chip (10,7 mio læser), C26 p65 chip (11,1 mio læser), og en fil, der repræsenterer sekvens baggrund læser (8,5 millioner) opnået ved at kombinere kontrol og C26 sonikeret chromatin der blev kørt gennem chippen uden et primært antistof (intet antistof gruppe). Disse tre post-QC sekvens .bam filer er tilgængelige online på: (https://drive.google.com/folderview?id=0B0Ph0YwXvamQektEaTFkcElSLTQ usp=sharing) De opstillede sekvenser blev konverteret til .sam format og derefter uploadet til toppen finder program i ChIPseeqer [24] med følgende parametre: 1. tærskel = 5, 2. fold ændring = 2 eller højere (i forhold til baggrunden), 3. fragment længde = 250 bp, 4. peak længde på mindst 100 bp og 5 . peak separation mindst 100 basepar. Foruden identifikation af kontrol- og C26 p65 toppe i forhold til baggrunden (intet antistof), ChIPseeqer identificeret det gen region af p65 bindende toppe (dvs. genomisk placering af toppene).

De sæt af kontrol- og C26 p65 toppe blev kørt på PeakAnalyzer [25] (https://www.ebi.ac.uk/research/bertone/software#peakanalyzer) for at finde genet med den nærmeste TSS for hver top. Dette genererer en liste af gener med toppe mindre end 100 kb fra TSS. Listerne blev derefter sammenlignet med listerne over øget og nedsat mRNA-ekspression fra kontrollen vs C26 microarray data ved hjælp af en perl algoritme placeret på en webside udviklet af Jim Lund ved University of Kentucky (https://nemates.org/MA /progs /Compare.html).

positiv kontrol for chip

for at bekræfte den korrekte binding af p65 antistof vi studerede chip med PCR for to på hinanden følgende stærkt undersøgt og verificeret NF-KB-promotor bindingssteder i muse IP-10 (CXCL10) genet [26]. Denne chip eksperiment brugte også et antistof for P50 (Santa Cruz SC-1190X). En positiv kontrol for Chippen blev foretaget med kromatin fra C2C12 myorør der var blevet behandlet i 4 timer med 10 ng /ml af muse TNFa. Vi har tidligere vist, at denne behandling stærkt inducerede en NF-KB luciferase reporter og øget IP-10 mRNA-niveauer, som begge er afhængige af p65 [27]. Til testen eksperimentet anvendte vi metoder beskrevet i vores tidligere arbejde [21]. Kort fortalt, formaldehyd fast kromatin fra ubehandlede og TNFa-behandlede C2C12 myorør blev immunpræcipiteret med p65 antistof, p50 antistof eller intet antistof og protein G-indfangede bundfald blev behandlet til frembringelse af DNA, som blev testet med PCR under anvendelse af primere, som flankerer to på hinanden følgende NF -κB steder i IP-10-genet. Derudover har vi også vurderet p65 og p50 binding til IP-10-promotor ved hjælp af kromatin fra kontrol- og C26 muskler.

chip-PCR for Fbxo6

chip-PCR blev udført fra muskelvæv fast, homogeniseret og sonikeret som for chip-seq, med den undtagelse, at p65 antistof blev bundet til protein G magnetiske perler ved præ-inkubering (natten over ved 4 ° C) før inkubering med kromatin, og DNA produkterne blev anvendt som template for PCR med primere flankerende målbindingsstedet af Fbxo6 genet, som bestemt ud fra chip-seq. Målstedet fra chippen-seq var i den første intron af Fbxo6 genet, 2 kb nedstrøms for transkriptionsstartstedet. Sekvenserne for de anvendte primere til PCR var agctcgttgatgtggaccat (venstre primer) og cctcctgctttaggctcctt (højre primer) og produceret et PCR produkt på 302 bp.

Statistik Salg

En ANOVA eller en

t

-test blev anvendt til analyse, afhængigt af antallet af grupper, der sammenlignes. Data er udtrykt som middelværdi ± SE, og signifikans blev etableret ved

P

0,05. Statistik for microarray data er beskrevet i microarray sektion.

Resultater Salg

Karakterisering af C26 tumorbærende mus Salg

Karakterisering af denne tumormodel i vores laboratorium involveret podning af CDF1 mus med C26 tumorceller i PBS /matrigel (n = 164) eller med kun PBS /matrigel (n = 142). Mus blev aflivet efter 12, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, og 26 dage efter inokulation af tumorceller. Ved svær kakeksi (dage 23-26 efter indpodning) tumorbærende mus tabt 22,1% ± 0,8% af initial body mass mens de ikke-tumor kontroller vundet 12,3% ± 0,7% af initial kropsmasse (fig S2A). Som tumor masse øget tibialis anterior (TA) muskelmasse faldt (tal S2B). TA muskelmasse af alvorligt kakektiske mus var 40,4 ± 0,3 mg sammenlignet med 51,1 ± 0,3 mg for alders-matchede kontrol mus. Tumorbærende mus i alvorlig kakeksi havde 214 ± 8,7 mg epididymal fedtpude masse mens kontrolmus havde 465 ± 10 mg (figur S2C). Milten masse af tumorbærende mus var 205 ± 4,6 mg sammenlignet med 75,5 ± 0,7 mg i ikke-tumorbærende mus (figur S2D). Tumormasse steg som en funktion af tid efter indpodning (fig S2E).

Virkning af dominante negative NF-KB signalering proteiner på muskelfibrene atrofi i C26 tumorbærende mus Salg

Den gennemsnitlige fiber