PLoS ONE: kræftrelaterede NEET Proteiner Transfer 2Fe-2S Klynger til Anamorsin, et protein Kræves til Cytosoliske Jern-Svovl Cluster Biogenesis

Abstrakt

Jern-svovl klynge biogenese er udført af forskellige protein montagesystemer. Pattedyr har to systemer, mitokondrie Fe-S klynge samlesystem (ISC) og det cytosoliske samlesystem (CIA), som er forbundet af en ukendt mekanisme. De humane medlemmer af NEET familien af ​​2Fe-2S-proteiner, næringsstof-deprivation autofagi faktor-1 (NAF-1) og mitoNEET (MNT), er placeret ved grænsefladen mellem mitokondrier og cytosolen. Disse proteiner er blevet impliceret i cancer celleproliferation, og de kan overføre deres 2Fe-2S klynger til en standard apo-acceptor-proteinet. Her rapporterer vi den første fysiologiske 2Fe-2S klynge acceptor for både NEET proteiner såsom humant Anamorsin (også kendt som cytokin-induceret apoptose-inhibitor-1; CIAPIN-1). Anamorsin er et elektronoverføringsmiddel protein indeholdende to jern-svovl-cluster-bindende sites, der er påkrævet for cytosolisk Fe-S klynge forsamling. Vi viser, ved anvendelse af UV-Vis-spektroskopi, at begge NAF-1 og MNT kan overføre deres 2Fe-2S klynger til apo-Anamorsin med anden ordens hastighedskonstanter svarende til andre kendte humane 2Fe-2S transfer proteiner. En direkte protein-protein-interaktion af NEET proteiner med apo-Anamorsin blev påvist under anvendelse biolayer interferometri. Endvidere elektrospray massespektrometri af holo-Anamorsin fremstillet ved klynge overførsel viser, at den modtager begge sine 2Fe-2S klynger fra NEET. Vi foreslår, at MNT og NAF-1 kan give parallelle ruter, der forbinder mitokondrie ISC-systemet og CIA. 2Fe-2S klynger samlet i mitokondrierne modtages af NEET proteiner og når det er nødvendigt overført til Anamorsin, aktivering CIA

Henvisning:. Lipper CH, Paddock ML, Onuchic JN, Mittler R, Nechushtai R, Jennings PA ( 2015) kræftrelaterede NEET Proteiner Transfer 2Fe-2S Klynger til Anamorsin, et protein Kræves til Cytosoliske Jern-Svovl Cluster Biogenese. PLoS ONE 10 (10): e0139699. doi: 10,1371 /journal.pone.0139699

Redaktør: Yaakov Koby Levy, Weizmann Institute of Science, ISRAEL

Modtaget: Maj 14, 2015; Accepteret: September 15, 2015; Udgivet: 8 oktober 2015

Copyright: © 2015 Lipper et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af NIH GM101467 tildelt PAJ, Israel Science Foundation – ISF 865/13 tildelt RN, og midler fra University of North Texas. College of Arts and Sciences tildelt RM. Arbejde ved Center for Teoretisk Biologisk fysik var sponsoreret af National Science Foundation (Tilskud PHY-1.427.654 og MCB-1.214.457) og ved forebyggelse Cancer og Research Institute of Texas. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Jern-svovl (Fe-S) klynger er gamle cofaktorer findes i proteiner fra alle riger af livet. Proteiner, der indeholder jern svovl klynger udføre en lang række kritiske funktioner, herunder overførsel af elektroner i oxidativ metabolisme, fotosyntese, nukleotid metabolisme, syntese af protein cofaktorer, og er afgørende for DNA-replikation og DNA-reparation [1, 2]. Biosyntese af Fe-S klynger sker ved komplekse proteinblandinger montagesystemer som omfatter stillads proteiner, chaperoner, elektronoverførselsreaktioner proteiner og cystein desulfurases [3]. I pattedyr er der to forskellige sæt Fe-S klynge samling maskiner: mitokondrie jern svovl klynge samling (ISC) system og den cytosoliske jern svovl klynge samling (CIA) systemet. CIA leverer Fe-S klynger for cytosol og nukleare proteiner, herunder dem, der er involveret i DNA-replikation og reparation [4]. Den mitokondriske ISC systemet er blevet rapporteret at være nødvendige for aktiveringen af ​​den cytosoliske systemet [5, 6]. Men den nøjagtige karakter af forbindelsen mellem de to systemer er fortsat ukendt. Der er flere humane sygdomme, der er forbundet med defekter i Fe-S biogenese, herunder Friedreichs ataksi, sideroblastisk anæmi, multipel mitokondrie dysfunktioner syndrom, og kræft [3, 7].

De menneskelige NEET proteiner er en nyligt opdaget ny klasse af 2Fe-2S-proteiner. De er de eneste kendte jern-svovl-proteiner lokaliseret ved eller nær den ydre mitokondriske membran, der er ved grænsefladen mellem mitokondrierne og cytosolen. Den bedste karakteriseret af disse er mitoNEET (MNT, CISD1) og næringsstoffer-afsavn autophagy faktor-1 (NAF-1, Miner1, ERIS, CISD2) (revideret i [8]). MNT er placeret på den ydre mitokondriske membran (OMM) og NAF-1 på det endoplasmatiske reticulum (ER) og det mitokondriske-associerede membran (MAM) af ER [9-11]. NAF-1 i MAM er tæt forbundet med OMM via dens kompleks med IP

3R, som er direkte bundet til OMM pore protein VDAC ved Grp75 [9, 12]. Disse NEET proteiner er involveret i flere humane sygdomme, herunder cancer, diabetes, cystisk fibrose, Wolfram syndrom 2, neurodegeneration og muskelatrofi [8, 13-18]. Krystalstrukturer viser, at både MNT og NAF-1 er homodimerer med hver protomer koordinere et 2Fe-2S klynge med en usædvanlig 3Cys: 1His koordinering [19, 20]. Den usædvanlige Fe-S klynge koordinering af tre Cys-ligander og én ikke-Cys-ligand er fundet i Fe-S klynge transfer proteiner [21]. Vi demonstrerede evne NEET proteiner til at overføre deres 2Fe-2S klynger til apo-ferredoxin, guld-standard protein anvendt til Fe-S klynge transfer eksperimenter [22, 23].

subcellulære lokalisering af NEET proteiner ved grænsefladen af ​​cytosolen og mitokondrier samt deres klynge overføringsfunktion, førte os til at undersøge, om de forbinder den mitokondriske ISC systemet til CIA-systemet. Den cytosoliske 2Fe-2S protein Anamorsin (også kendt som cytokin-induceret apoptose-inhibitor-1; CIAPIN-1) er et elektronoverføringsmiddel protein, der kræves for en tidlig trin af Fe-S klynge samling af CIA-systemet [24-26]. I denne undersøgelse identificerer vi Anamorsin som den første kendte direkte fysiologisk 2Fe-2S klynge acceptor for både MNT og NAF-1. Svarende til vores tidligere fund med ferredoxin, overførsel forekommer kun, når klyngen er i den oxiderede [2Fe-2S]

2+ tilstand og inhiberes ved mutation af Hans ligand til Cys. Hastigheden for klynge overførsel til Anamorsin fra MNT eller NAF-1 kan sammenlignes med dem, som andre kendte humane 2Fe-2S klynge transfer proteiner. Vi viser, ved hjælp biolayer interferometri, at begge NEETs danner en direkte protein-protein-interaktion med Anamorsin. Desuden rapporterer vi, at NEET proteiner direkte overføre 2Fe-2S klynger til både Anamorsin klynge-bindingssteder giver mulighed for fuldstændig rekonstituering af holo-Anamorsin. Fordi holo-Anamorsin kræves for biosyntesen af ​​Fe-S klynger af CIA-systemet, til 2Fe-2S klynge overførsel apo-Anamorsin tyder på, at NEET proteiner har en væsentlig rolle i regulering /aktivering af klynge samling af CIA-systemet.

Eksperimentelle Procedurer

Ekspression og oprensning af proteiner

De opløselige domæner af NAF-1 (rester 57-135) og mNT (resterne 33-108) blev udtrykt og oprenset som beskrevet tidligere [19, 23]. De oprensede NEET proteiner indeholder ≥ 98% klynge belægning. Det humane Anamorsin cDNA kodende plasmid (Abgent) blev amplificeret ved PCR og subklonet ind i en pET28-a (+) vektoren (Novagen) mellem Ndel- og Xhol-restriktionssteder. Vektoren tilføjer en 6x His-mærke og et thrombinspaltningssted til N-terminus af genet. BL-21 codon plus (DE3) RIL celler (Stratagene) blev transformeret med pET28-a (+) – Anamorsin-konstruktionen. Kulturer blev dyrket i LB-medier indeholdende som tidligere [27] beskrevne. 750 uM FeCl

3 blev tilsat til kulturen 30 minutter før induktion med IPTG. Cellerne blev pelleteret ved centrifugering og resuspenderet i 20 mM Tris-HCI pH 8,0, 250 mM NaCl, 5 mM imidazol. Resuspenderede celler blev lyseret ved anvendelse af et EmulsiFlex-C5 (Avestin) og centrifugeret. Supernatant indeholdende his-mærket Anamorsin var bundet til Ni-NTA agarose (Qiagen) harpiks, vasket med resuspenderingsbufferen og elueret med den samme puffer med 300 mM imidazol. Elueret Anamorsin blev fortyndet i 25 mM Tris-HCI pH 7,1 indeholdende 5 mM DTT og yderligere oprenset ved anvendelse af en HiTrap Q HP 5 ml anionbyttersøjle (GE Healthcare). Proteinet blev elueret ved en 150-500 mM NaCl-gradient i 25 mM Tris-HCl pH 7,1 og 5 mM DTT. Apo-Anamorsin blev 2Fe-2S klynge fjernet ved fremgangsmåden beskrevet af Kennedy og Beinert [28] metode. De enkelte klynge stedet mutanter af Anamorsin (C1 og C2) blev designet ved at erstatte hver af de 4Cys cluster ligander med Ser ved site-directed mutagenese.

UV-Vis absorption spektroskopi overførsel kinetik

Absorption spektre blev registreret fra 300-800 nm på en Cary 50 spektrofotometer (Varian) med en temperatur styreenhed indstillet til 37 ° C under anvendelse af en 1 cm vejlængde kuvette. Spektre blev opnået under aerobe betingelser, medmindre andet er angivet. Forholdet mellem absorbans ved 423 nm (karakteristisk for 2Fe-2S klynge (er) Anamorsin) til 458 nm (NEET 2Fe-2S klynge signatur peak) blev overvåget som klynge overførsel progression. Omfanget af klyngen overførselsreaktionen bestemmes, og tidligere har plottet beskrevet [23] ved hjælp af ligningen: Overførsel Progress (%) = (R

obs-R

indledende) /(R

endelig-R

indledende) x100%, hvor R

initial er 423/458 nm absorbans forhold til tid 0, R

obs er 423/458 nm-forholdet på et givet tidspunkt, og R

endelig er IS den 423/458 nm ratio for fuldstændig overførsel. R

initial for overførsel fra NAF-1 og MNT er 0,78. R

startværdier for overførsel fra NAF-1 H114C mutant og MNT H87C mutant er 0,93 og 0,90 hhv. Den 423/458 nm absorbans forhold mellem oprenset holo-Anamorsin, C1-mutant og C2 mutant (1,04, 1,03, 0,99 henholdsvis) blev anvendt som værdierne for fuldstændig overførsel (R

endelig). Til overførsel reaktioner, apo-Anamorsin blev præ-inkuberet med 2,5 mM DTT i 60 minutter for at sikre reduktion af dens cystein thiolgrupper. Kinetiske målinger blev udført under anvendelse af ækvimolære koncentrationer af NAF-1 eller MNT til apo-Anamorsin (én NEET med to 2Fe-2S klynge pr Anamorsin) i 50 mM Bis-Tris pH 7,0, 100 mM NaCl, 2,5 mM DTT, medmindre andet er angivet angivet. Apo-Anamorsin og DTT blev præinkuberet i 60 minutter før tilsætning af NEET protein.

Biolayer interferometri

Kinetik af apo-Anamorsin interaktion med NAF-1 eller MNT blev målt på en oktet Red96 instrument (ForteBio). Apo-Anamorsin blev biotinyleret ved inkubering i 30 minutter med EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin (Thermo Scientific) ved en 2: 1 molforhold mellem biotinyleringsreagens til protein derefter bufferudskiftet ved anvendelse af en PD10 afsaltningskolonne (GE Healthcare) i 50 mM bis-tris, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20, 0,5 mg /ml BSA, 5 mM DTT, pH 7,0. 3,5 uM biotinyleret Anamorsin blev immobiliseret til streptavidin biosensorer (ForteBio). De fyldte biosensorer blev ækvilibreret i den samme buffer uden DTT. Foreningen blev målt over 900 sekunder. Foreningen er bestemt af bølgelængden shift (nm). Efter forening, blev dissociation bestemt ved at overføre biosensor tip til buffer uden NEET protein i en periode på 1800 sekunder. Kontroller for ikke-specifik binding for hver NEET koncentration blev kørt uden belastning til biosensor og trækkes fra de tilsvarende bindende data. Dataene blev tilpasset til en 1: 1 model for binding til apo-Anamorsin og en 2: 1 heterogen ligand model for binding til holo-Anamorsin hjælp af Oktet software. Dataene blev plottet hjælp Kaleidagraph (Synergy Software).

Udarbejdelse af post-cluster transfer Anamorsin for massespektrometri og biolayer interferometri

25 um apo-Anamorsin i 50 mM Bis-Tris pH 7,0 og 100 mM NaCI blev præ-inkuberet med 2,5 mM DTT i 60 minutter. 27,5 uM NAF-1 blev derefter tilsat, og reaktionsblandingen blev inkuberet i en orbital ryster ved 37 ° C i 3,5 timer. Efter reaktionen holo-Anamorsin blev oprenset fra NAF-1 under anvendelse af en HiTrap Q HP 1 ml anionbyttersøjle. Proteinet blev elueret ved en 150-500 mM NaCl-gradient i 25 mM Tris-HCl pH 7,5. Prøver til massespektrometri stemte pufferudvekslet i 10 mM ammoniumacetat pH 7,5 puffer under anvendelse af Quick Spin Protein kolonner (Roche).

Elektrospray ionisationsmassespektrometri

Anamorsin prøver i 10 mM ammoniumacetat pH 7,5 med en koncentration på ~ 1 mg /ml blev fortyndet 100 gange i 50% methanol med 0,5% eddikesyre og injiceret i en Quattro Ultima tripel kvadrupol-system (Waters). Spektre blev erhvervet i positiv ion-mode med en m /z vifte af 500-2000. Masse udfoldning blev udført ved hjælp af MassEnt1 værktøj i MassLynx softwarepakken.

Resultater

NAF-1 eller MNT kan overføre deres oxiderede 2Fe-2S klynger til apo-Anamorsin

Anamorsin har to 2Fe-2S bindingssteder, hver med en ferredoxin-like 4-Cys klynge ligering, der adskiller sig fra de NEETs (3Cys: 1His). Denne forskel i ligation giver det en UV-Vis absorbans spektrum, som er forskellig fra NEET proteiner, overvejende 400-500 nm. I denne region Anamorsin har absorptionstoppe ved 423 og 458 nm, hvorimod både NAF-1 og MNT har kun en top ved 458 nm (figur 1). Vi bestemt den molære ekstinktionskoefficient klynge peak Anamorsin 2Fe-2S ved 458 nm til at være 5800 M

-1cm

-1 per klynge, mens den for de NEETs er 5000 M

-1cm

-1 per klynge [29]. Vi bruger forholdet 423 nm til 458 nm til at overvåge overførslen af ​​2Fe-2S klynger fra MNT eller NAF-1 til apo-Anamorsin. Som overdragelsen finder sted vi forventer 423 nm peak at stige, og dermed en stigning i forhold den 423/458. I modsætning tab af klyngen til løsning ville resultere i fuldstændig tab af synlig absorbans i 400-800 nm-regionen [19]. For at forberede protein for 2Fe-2S klynge transfer studier er de frie cysteiner af apo-Anamorsin reduceret med præ-inkubering med DTT i 60 minutter for at sikre, at de er klar til klynge ligation. Den første scanning ved indledningen af ​​overførsel viser et oxideret NEET spektrum, hvilket indikerer, at det meste af DTT oxideres. Reduceret DTT vil reducere NEET klynger [30], som hæmmer overførsel [23]. Efterfølgende NAF-1 eller MNT blev tilsat til for-reducerede apo-Anamorsin og klynge overførselsreaktion den blev overvåget ved UV-Vis spektrofotometri. Støkiometri NAF-1 eller MNT til apo-Anamorsin blev valgt til at levere en 2Fe-2S klynge pr Anamorsin som det tidligere blev rapporteret, at både klynge bindingssteder kunne ikke samtidigt rekonstitueres [24, 27]. Under oxiderende betingelser overføre provenuet fra både NAF-1 og MNT uden tab af klynger til løsning og data er godt egnet til en enkelt eksponentiel fase (figur 2). NAF-1 transfer blevet fuldendt mens MNT overført ~ 80% af sine klynger viser effektiv overførsel fra enten NEET protein til Anamorsin. Scanninger på udvalgte tidspunkter kan ses i S1 Fig. Reduceret DTT er blevet vist i nogle tilfælde at mægle klynge transfer [31]. For at teste, om dette var tilfældet for NEET-Anamorsin blev DTT fjernet fra apo-Anamorsin efter 60 min inkubation med denne agent. Den DTT gratis apo-Anamorsin er let i stand til at modtage NEET klynger (S2 Fig). Dette indikerer, at NEET-Anamorsin klynge overførsel er en udelukkende protein-medieret begivenhed.

A. (Top) Crystal strukturer af MNT (PDB-kode: 2QH7,), NAF-1 (PDB-kode: 3FNV); (Mellemøsten) NEET 2Fe-2S klynge med 3-Cys: 1His koordinering; (Bottom) Absorptionsspektra på 25 uM MNT og NAF-1. B. (Top) krystalstrukturen af ​​det N-terminale domæne af Anamorsin (PDB-kode: 2YUI) med et tilsat skematisk af den ustrukturerede 2Fe-2S klynge bindende domæne; (Mellemøsten) Repræsentant Anamorsin 2Fe-2S klynge med 4-Cys koordinering (fra ferredoxin, PDB-kode: 1RFK); (Nederst) Absorption spektrum af 43 uM Anamorsin isoleret fra

E

.

coli

.

2F-2S klynge transfer reaktion blev overvåget af UV-Vis absorption spektroskopi. Forløbet af overførslen blev plottet mod tid. Cluster overførsel fra NAF-1 (A) og MNT (B) til apo-Anamorsin forekommer kun, når 2Fe-2S klynge oxideres og ikke når de reduceres med 10 mM natriumdithionit. Udskiftning af den koordinerende Hans resten med Cys (H114C for NAF-1 og H87C for MNT) hæmmer, men ikke afskaffe overførsel. Alle viste blev opnået med 25 um NAF-1 eller MNT (50 uM 2Fe-2S klynger) spor og 50 uM apo-Anamorsin i 50 mM bis tris, 100 mM NaCl, 2,5 mM DTT, pH 7,0 ved 37 ° C.

vi yderligere testet, om 2Fe-2S klynge overførsel fra NEET proteiner til apo-Anamorsin var afhængig af oxidationstilstanden af ​​klyngen, som vi fandt i tidligere undersøgelser med klynge overførsel til apo-ferredoxin [22, 23]. Den reducerede NEET spektrum har to forskellige toppe (S3 Fig), i modsætning til konturløse spektrum af reduceret Anamorsin [27]. Når NEET 2Fe-2S klynge er for-reducerede med natriumdithionit ingen overførsel til apo-Anamorsin blev observeret (figur 2). Dette fund viser, at NEET klynge overførsel til Anamorsin kræver oxideret 2Fe-2S klynger som vi tidligere fundet for overførsel fra NEET proteiner til apo-ferredoxin, samt observeret for overførsel fra jern-svovl samling protein ISCU at apo-Fd [32] .

Vi har desuden testet betydningen af ​​det indre Hans ligand af mNT og NAF-1 til effektiv klynge overførsel. Udskiftning af de koordinerende Hans rester med Cys i NAF-1 (H114C) og i MNT (H87C) hæmmede overførsel til apo-ferredoxin [22, 23, 33, 34]. Spektre NAF-1 H114C mutant og MNT H87C mutant kan ses i S4 Fig. Ligeledes finder vi, at klynge overførsel til apo-Anamorsin også hæmmet af mere end 10 gange i disse mutanter (fig 2).

Overføringshastigheder af NEET proteiner ligner dem af kendte humane klynge-transfer proteiner

Overførsel af 2Fe-2S klynger til apo-acceptor-proteiner er blevet beskrevet som værende andenordens [32, 35]. Vi har derfor testet klynge overførsel fra MNT eller NAF-1 til apo-Anamorsin ved forskellige koncentrationer af NEET dimer donorer (3,13 pM, 6,25 pM, 12,5 um og 25 uM). Den observerede hastighed for hver koncentration (k

obs) var lineært afhængig af NEET proteinkoncentration (figur 3). Den tilsyneladende anden ordens hastighedskonstant (

k

2) for hver blev bestemt ud fra den lineære passer til k

OBS værdier.

k

2 værdier beregnet for NAF-1 og MNT er 600 ± 90 M

-1 min

-1 og 460 ± 60 M

-1 min

-1 henholdsvis som ligner hastighedskonstanter målt for den humane 2Fe-2S klynge transfer proteiner ISCA og ISCU [32, 35] (tabel 1). Overførselshastigheder på nogle 2Fe-2S transfer proteiner forstærkes af ATP-afhængige chaperoner. IscU fra

Azotobacter vinelandii

i overværelse af HscA /HscB cochaperone systemet og nødvendige cofaktorer overførsler med en rapporteret hastighedskonstant, der kun er lidt større end de NEET proteiner [36] (Tabel 1). En yderligere lighed mellem NEETs og ISCU er kravet om oxidation af 2Fe-2S klynge til overførsel [32]. Tilsammen den NEETs overførsel så effektivt som ISCU og vil sandsynligvis fungere på en tilsvarende måde.

NAF-1 (A) og MNT (B) overførsel til apo-Anamorsin blev overvåget ved UV-Vis absorption spektroskopi for en række NEET koncentrationer. For hver NEET koncentration forholdet 1 NEET dimer pr 2 apo-anamorisn blev opretholdt. Satsen konstant, k

obs, bestemmes ud fra fit af data til en eksponentiel stigning og afsættes mod koncentrationen for NAF-1 (C) eller MNT (D). Hældningen af ​​den bedste linje fit blev anvendt til bestemmelse tilsyneladende anden ordens hastighedskonstanter (

k

2) for NAF-1 og MNT, som er 600 ± 90 M

-1 min

-1 og 460 ± 60 M

-1 min

-1 hhv.

Her demonstrerer vi, at 2Fe-2S klynger overføres til Anamorsin fra NEET proteiner. For at løse den mulighed, at NEET er simpelthen leverandører af jern og sulfid via en frigivelse og fange mekanisme, vi udførte overførsel i tilstedeværelsen af ​​EDTA (en jernkelator som isolerer frit jern og hæmmer dermed klynge samling). Mens frit jern og sulfid spontant kan danne klynger på Anamorsin [24, 27], EDTA afskaffer forsamlingen. Men overføre fra hver af NEETs at Apo-Anamorsin forløber effektivt i nærvær af EDTA (S5 Fig). Derfor NEETs rolle i denne proces er ud over blot at levere jern og sulfid og direkte interaktion er nødvendig for effektiv overførsel.

NAF-1 eller MNT binder direkte til apo-Anamorsin

For at undersøge potentialet for protein-protein interaktion mellem NEET proteiner og Anamorsin vi ansat biolayer interferometri (BLI). Både NAF-1 og MNT bundet direkte til immobiliseret apo-Anamorsin. Foreningen og dissociation kurver er vist i figur 4. On- (

k

på) og off-satser (

k

off) målt for hver interaktion er vist i tabel 2. de på-priser til NAF-1 og mNT forskel på en faktor på to, mens off-satsen for NAF-1 er ~ 18 gange hurtigere end mnt. Vi analyserede også bindingen af ​​holo-NEETs til holo-Anamorsin (S6 Fig).

Sensorgrams for bindingen af ​​holo-NAF-1 (A) og holo-MNT (B) til biotinyleret apo-Anamorsin immobiliseret til streptavidin-overtrukne biosensorer er vist. Foreningen blev fulgt i 900 sekunder (stigende signal) efterfulgt af 1800 sekunders dissociation (rådnende signal). Dataene blev tilpasset til en en-til-én model (sorte kurver). On- og off-satser blev bestemt ud fra de passer til hver NEET-Anamorsin koncentration (vist i tabel 2).

NEET proteiner kan overføre til hver af de Anamorsin cluster-bindingssteder

Anamorsin har to 2Fe-2S klynge bindingssteder og

in vitro

kemisk rekonstituering viste, at hver klynge websted kunne rekonstitueres men klynge binding var gensidigt udelukkende [27]. Vi henviser til det første sted som C1 og den anden som C2 (fig 5A). Anamorsin mutanter, der kun indeholder en enkelt klynge-bindingssted blev produceret, hvor alle fire cysteinrester fra den anden side blev erstattet med seriner at teste for eventuelle fortrinsret overførsel fra MNT eller NAF-1 til apo-Anamorsin. Absorbansspektret for hver mutant kan ses i S7 Fig. Som vist i figur 5, hver Anamorsin mutant modtaget klynger fra hver NEET donor protein viser lille præference for overførsel til enten C1 eller C2 acceptorsites

Anamorsin mutanter indeholdende en enkelt klynge-bindingssted er vist.; den anden klynge site blev afbrudt ved at erstatte alle Cys-resterne med Ser. (A) Skema af Anamorsin-C1 (grøn) og Anamorsin-C2 (magenta) er vist. 2Fe-2S klynge overførsel fra NAF-1 (B) eller MNT (C) til hvert enkelt klynge bindende apo-Anamorsin mutanten blev overvåget ved UV-Vis absorption spektroskopi. Spor blev opnået med 25 pM NAF-1 eller MNT (50 pm 2Fe-2S klynger) og 50 uM apo-Anamorsin.

NAF-1-homodimerer kan levere både 2Fe-2S klynger til Anamorsin

i betragtning af de ovenstående resultater, besluttede vi at teste, om enten en enkelt NEET homodimer kunne levere 2Fe-2S klynger til både C1 og C2 acceptorsites af en enkelt apo-Anamorsin. Cluster overførsel blev målt for NAF-1 med støkiometrisk donor klyngen acceptorsites (50 uM NAF-1 dimer og 50 pM apo-Anamorsin) (Fig 6A). Vi fokuserede på NAF-1, fordi kun NAF-1 viste fuldstændig overførsel med overskydende apo-Anamorsin (figur 2). Overførsel af ~ 1,5 2Fe-2S klynger pr Anamorsin blev overraskende fundet, at mindst halvdelen af ​​de Anamorsin proteiner accepterede to klynger efter inkubation med NAF-1. Vi observerede ingen tab af cluster at løsningen (spektral amplitude). Da dataene er godt egnet til en enkelt eksponentiel fase, er begge klynger overføres i kinetisk skelnes trin. Den enkleste forklaring er, at begge klynger overføres i en enkelt bindingshændelse, skønt de kan være ved lidt forskellige hastigheder på grund af den anden aminosyre sammensætning omkring de to Anamorsin cluster-bindingssteder. Den ufuldstændige overførsel kan skyldes dannelsen af ​​intramolekylære disulfid obligationer apo-Anamorsin eller muligvis på grund af ændrede cystein sidekæder i apo-Anamorsin. Førstnævnte blev foreslået tidligere for ufuldstændig overførsel fra ISCU til apo-ferredoxin [32]. For at bekræfte dannelsen af ​​fuldt besat holo-Anamorsin efter overførsel fra NAF-1 brugte vi elektrospray massespektrometri (ESI-MS). Holo-Anamorsin dannet af en overførsel reaktion med NAF-1 blev oprenset fra NAF-1 under anvendelse af anionbytningskromatografi. Den resulterende holo-Anamorsin blev analyseret ved ESI-MS. Derudover købte vi ESI-MS spektre for apo-Anamorsin og Anamorsin som det blev oprenset fra

E

.

coli

. De resulterende spektre er vist i fig 6B. Den forventede masse for apo-Anamorsin konstruere er 35614 Da og forventede masse af en 2Fe-2S klynge er 176 Da. Vi finder, at Anamorsin oprenset fra

E

.

coli

overvejende indeholder en enkelt klynge, mens den største del af post-transfer Anamorsin indeholder to 2Fe-2S klynger; tidligere kemisk rekonstituering rapporteret klynge belægning til at være gensidigt udelukkende [27]. Dette resultat viser nødvendigheden af ​​direkte overførsel til at aktivere Anamorsin.

(A) 2Fe-2S overførsel fra 50 pM dimere NAF-1 til 50 um apo-Anamorsin (to 2Fe-2S klynger pr Anamorsin) (vist i rød) sammenholdes med 25 pM NAF-1 til 50 um apo-Anamorsin (én 2Fe-2S klynge pr Anamorsin) (vist med blåt). Transfer er nær komplet til den ene 2Fe-2S klynge pr Anamorsin prøve og er ca. 75% færdig for to 2Fe-2S klynge pr Anamorsin prøve. Sidstnævnte resultat viser, at mindst halvdelen af ​​Anamorsin kan modtage to 2Fe-2S klynger fra en enkelt NAF-1 homodimer. (B) Anamorsin efter en overførsel reaktion med NAF-1 blev oprenset og analyseret ved ESI-MS (vist med rødt). Masse spektre af apo-Anamorsin (fast sort linje) sammenholdes med den største højdepunkt for post-overførsel Anamorsin (solid rød linje), som viser en stigning i masse, der svarer til indarbejdelsen af ​​to 2Fe-2S klynger. Der er også en mindre top ved 35.856 Da der sandsynligvis svarer til Anamorsin med en enkelt 2Fe-2S klynge og en jern-ion bundet, som kan være en rest af en klynge, der nedbrydes under prøven forberedelsesprocessen.

E

.

coli

-purified Anamorsin er vist for sammenligning (stiplet linje), som viser Anamorsin indeholder en enkelt 2Fe-2S klynge.

Diskussion

I denne undersøgelse, vi identificeret Anamorsin som den første humane 2Fe-2S klynge acceptor protein for både OMM cancerrelateret mNT og NAF-1-proteiner. For nylig Ferecatu

et al

. [37] fastslået, at MNT erhverver sine 2Fe-2S klynger fra mitokondrie ISC-systemet. Vores resultater viser, at når den opnås, MNT (og NAF-1) kan overføre sine 2Fe-2S klynger til Anamorsin hvorved der tilvejebringes en veldefineret pathway fra ISC til CIA via den ydre membran tøjret MNT (figur 7).

mNT på OMM og NAF-1 på MAM modtager 2Fe-2S klynger produceret inde i mitokondrierne af ISC-systemet. Både MNT og NAF-1 transfer disse 2Fe-2S klynger til Anamorsin. Anamorsin modtager elektroner fra diflavin reduktase NDOR1 og leverer dem til CIA-systemet som et tidligt skridt er nødvendige for produktionen af ​​4Fe-4S klynger. Dette trin kræver holo form af Anamorsin. Både MNT og NAF-1 kan give parallelle ruter, der forbinder CIA til ISC. CIA produceret klynger er målrettet til proteiner i cytosolen og kernen og er vigtige for cellens stofskifte, vedligeholdelse og spredning.

Anamorsin, hvilket er en væsentlig del af CIA, rummer to Fe-S klynge -bindende sites og vi fandt, at mNT eller NAF-1 kan overføre 2Fe-2S klynger til både klynge-bindingssteder. NEET proteiner kan levere alle nødvendige klynger til aktivering Anamorsin for sin elektron overføringsfunktion. Dette forbinder nu nødvendigheden af ​​mitokondrie Fe-S klynge samling med funktionen af ​​den cytosoliske CIA [37, 38].

NEET placering på OMM /MAM og deres klynge Transfer Function ligheder med ISCU foreslå, at de kan være en del af en vej der forbinder mitokondrie 2Fe-2S samling til CIA-systemet. Mens Ferecatu

et al

. viste, at knockdown af MNT ikke havde en betydelig indvirkning på modningen af ​​CIA-afhængige Fe-S-proteiner [37], viser vi, at NAF-1 er mere effektive til at overføre til apo-Anamorsin og kan være en parallel vej til CIA .

egenskaberne af NEET proteiner tyder på, at der ud over mitokondrie 2Fe-2S transport, de fungerer som reservoirer tillader 2Fe-2S klynger skal samles under gunstige betingelser inden i mitokondrierne og lagres for hurtigere tilgængelighed når cytosolisk 2Fe der er behov for -2S klynger. Dette vil give mulighed for hurtigere reaktion på umiddelbare behov, end det ville være muligt, hvis mitokondrie samling og transport gennem to membraner til cytosoliske proteiner. Til støtte for denne funktion, blev MNT nylig fundet at samle /reparere 4Fe-4S klynge af cytosolisk jern regulatorisk protein 1 (IRP1; cytosol aconitase) efter oxidative skader [37]. de NEETs kan således fungere i transport af 2Fe-2S klynger ud af mitokondrierne samt et reservoir af let tilgængelige 2Fe-2S klynger.

NAF-1, MNT og Anamorsin hver især er blevet impliceret i cancer [15 , 39-41]. Begge NEET proteiner er overudtrykt i epitelceller brystcancerceller, og faldende deres ekspression via shRNA knockdowns resulterer i nedsat cancercelleproliferation og nedsat tumorvækst. Som Fe-S-proteiner er essentielle for DNA-replikation og cellevækst, behovet for hurtig levering af Fe-S klynger bekvemt forbinder NEET proteiner til cancercelleproliferation. Endvidere er gær homolog af Anamorsin (Dre2), der kræves til samling af diferric-tyrosyl radikal cofaktor af ribonukleotidreduktase [42], som er nødvendig for produktionen af ​​deoxynukleotider. En begrænset tilgængelighed af deoxynukleotider ville også hæmme DNA-replikation og således cancercelleproliferation. Målretning NEET proteiner kan være et bekvemt middel til at kontrollere mange processer, der kræves for fremskyndet proliferation af cancerceller med mulighed for at modulere hjælp lille molekyle målretning af NEET proteiner [43].

I denne undersøgelse vi giver en veldefineret sammenhæng mellem ISC og CIA-systemer via mNT og NAF-1, som er de eneste kendte 2Fe-2S proteiner forbundet med OMM. Vi viser, at NEET proteiner kan overføre begge deres 2Fe-2S klynger via en direkte protein-protein interaktion for at aktivere de væsentlige CIA protein, Anamorsin.

Støtte oplysninger

S1 Fig.