PLoS ONE: Wnt /β-Catenin Signaling Regulerer Ekspression af Ammonium permeasen Gene RHBG i Human Cancer Cells

Abstrakt

Ammonium er en metabolisk affaldsprodukt hovedsageligt afgiftet af leveren. Hepatisk dysfunktion kan føre til cytotoksiske akkumulering af cirkulerende ammonium og til efterfølgende encephalopati. Transmembrane ammonium transport er en udbredt proces sikres af stærkt konserverede proteiner af Mep-Amt-Rh superfamilien, herunder pattedyr Rhesus (Rh) faktorer. De regulatoriske mekanismer involveret i kontrollen af ​​

RH

gener udtryk forbliver dårligt undersøgt. Her behandles vi udtrykket regulering af en af ​​disse faktorer,

RHBG

. Vi identificerer HepG2 hepatocellulært carcinom celler og SW480 colonadenocarcinom celler som udtrykker

RHBG

og vise, at dets udtryk er afhængig af β-catenin signalering. siRNA-medieret β-catenin knockdown resulterede i signifikant reduktion af

RHBG

mRNA i begge cellelinier. Farmaceutisk inhibering af TCF4 /β-catenin interaktion eller knockdown af transkriptionsfaktoren TCF4 nedreguleret også

RHBG

ekspression. Vi identificerer en minimal

RHBG

regulatorisk sekvens viser en promotor-aktivitet og viser, at β-catenin og TCF4 binder til dette fragment

in vivo

. Vi endelig karakterisere rolle potentiale TCF4 bindingssteder i

RHBG

regulering. Tilsammen vores resultater tyder

RHBG

udtryk som et direkte mål for β-catenin regulering, en sti hyppigt dereguleret i mange kræftformer og forbundet med tumorigenese

Henvisning:. Merhi A, De Mees C , Abdo R, Victoria Alberola J, Marini AM (2015) Wnt /β-Catenin Signaling Regulerer Ekspression af Ammonium permeasen Gene

RHBG

i humane cancerceller. PLoS ONE 10 (6): e0128683. doi: 10,1371 /journal.pone.0128683

Academic Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA

Modtaget: Januar 19, 2015; Accepteret: April 29, 2015; Udgivet: 1 juni 2015

Copyright: © 2015 Merhi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den belgiske Fonds de la Recherche Scientifique FRS-FNRS (FRSM 3.4633.09, MISF4.521.10.F), Fédération Wallonie-Bruxelles ( Action de Recherche Concertée), den Internationale Brachet Stiftung, Jean Brachet og Alice et David Van Buuren fundamenter. ER. er en videnskabelig forskning arbejdstager støttes af en Télévie tilskud, C.D. blev en videnskabelig forskning arbejdstager i Det F.R.S.-FNRS, JVA blev understøttet af en da Vinci-programmet, og A.M.M. er en seniorforsker i F.R.S.-FNRS. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ammonium, herefter med henvisning til summen af ​​NH

3 og NH

4

+ molekylære arter, tjener som principal kvælstof kilde til mikroorganismer og planter [1]. Det er dog for det meste beskrevet for de cytotoksiske virkninger af dens akkumulering i dyr [2]. Levermetabolisme af ammonium hen imod urinstof og glutamin syntese er afgørende for at opretholde et lavt plasma niveau af ammonium kommer ud fra katabolisme af proteiner og aktiviteten af ​​tarmfloraen. Den svækkelse af ammonium afgiftning forekommer i tilfælde af leverdysfunktion kan føre til udvikling af hepatisk encefalopati og i akutte tilfælde, til dødelig cerebral lammelse. Sideløbende med disse toksiske effekter, renal ammonium produktion fra glutaminolysis og den efterfølgende udskillelse i urinen er en afgørende proces for at sikre blod pH homeostase [3]. Den opfattelse, at de transmembrane fluxe af ammonium er den eneste konsekvens af NH

3 gratis diffusion blev holdt i årtier, indtil de første gener, der koder specifikke ammonium permeaser blev identificeret [4-6]. Sekvensanalyse aktiveret for at definere en ny og bredt konserveret familie af proteiner betegnet Mep-Amt-Rh, repræsenteret i hvirveldyr ved den velkendte humane Rhesus blodtype faktorer [7]. Ikke-erythroide Rh faktorer, RhBG og rhCG, blev efterfølgende opdaget og især fundet at blive udtrykt i bestemte epitelceller i flere organer, herunder mus og human lever og nyre [8-14]. Mus knockout undersøgelser viste rolle Rhbg og rhCG i renal urin ammonium udskillelse, mens deres potentielle engagement i leveren fysiologi forbliver uløst [15-17]. Notatet

RHBG

vises overudtrykt i menneskelig hepatocellulært carcinom bærer aktiverende mutationer i β-catenin [18], hvilket tyder på en sammenhæng mellem Wnt /β-catenin signalering og menneskelig

RHBG

regulering. Denne sammenhæng synes at være tilfældet i en normal mus lever sammenhæng som transgene modeller gør det muligt målrettet inaktivering eller aktivering af β-catenin signalering show nedregulering eller opregulering af

RHbg

udtryk henholdsvis [19,20]. Wnt /β-catenin pathway er særdeles konserveret på tværs metazoans og regulerer celleproliferation, differentiering og overlevelse [21-23]. De secernerede proteiner af WNT familien er i stand til at binde specifikke Frizzeld /LRP-receptorer og aktivere signaltransduktion via forskellige mekanismer. I den kanoniske Wnt /β-catenin mekanisme, er fravær af Wnt signalering ledsaget af en lav cytosolisk β-catenin niveau. Den β-catenin stabilitet reguleres af en ødelæggelse kompleks, dannet ved axin, adenomatøs polypose kompleks (APC), caseinkinase 1 og glycogensynthasekinase-3β (GSK-3 β), der phosphorylerer β-catenin på N-terminus og leads til sin ubiquitylering og efterfølgende proteasomalaktivitet nedbrydning [21,22]. Wnt signalering udløser dissociation af β-catenin /destruktion kompleks [23-25]. Den resulterende inhibering af phosphorylering fører til cytosolisk β-catenin ophobning og translokation ind i kernen. Beta-catenin kan derefter aktivere transskription af forskellige målgener som en cofaktor bundet til medlemmer af T-celle faktor (TCF) /lymfoide forstærker faktor (LEF) transskription faktor familie og drive Wnt-specifikke transkriptionelle programmer [23]. Unormal aktivering af Wnt /β-catenin signalering, på grund af tab-af-funktion-mutationer i APC eller aktiverende mutationer i β-catenin er blevet forbundet med tumorigenese i mange indstillinger, herunder melanom, bryst-, tyktarms- og hepatocellulære carcinomer [21,23].

de regulatoriske mekanismer involveret i kontrollen af ​​menneskelig

RH

gener udtryk og de signalveje kan være involveret, er hidtil dårligt dokumenteret. Her har vi forsøgt at identificere menneskelige kræftceller, der udtrykker

RHBG

gen at studere dens udtryk regulering og tage fat på potentielle direkte indflydelse Wnt /β-catenin signalering. Vi viser, at

RHBG

er stærkt udtrykt i HepG2 hepatomaceller og er afhængig af β-catenin signalering. Tilsvarende

RHBG

udtryk afsløret i SW480 kolon kræftceller er afhængig af β-catenin, yderligere støtte rolle β-catenin signalering i

RHBG

regulering. Promotor analyse og kromatin immunopræcipitationsanalyser er i overensstemmelse med en direkte involvering af TCF4 /β-catenin i

RHBG

opregulering i HepG2-celler.

Materialer og metoder

Cell kultur og reagenser

Den menneskelige hepatocellulært carcinom (HepG2 og Hep3B) og humane embryonale nyre (HEK293T) cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af professor Claude Szpirer, Université Libre de Bruxelles, Belgien. Den humane colon adenocarcinom (SW480) cellelinje blev erhvervet fra CLS (Tyskland). HepG2, Hep3B, SW480 og HEK293T celler blev dyrket i avanceret DMEM-medium (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Biowest), 2 mM L-glutamin, 50 enheder /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. Celler blev holdt i en inkubator med befugtet luft (5% CO2) ved 37 ° C. PFK118-310 (# K4394) blev indkøbt fra Sigma og anvendt i en 0,2 eller 0,4μM koncentration fra en DMSO-opløsning.

plasmider konstruktion

DNA-fragment (2492 bp) svarende til potentialet

RHBG

promotoren blev amplificeret under anvendelse af polymerasekædereaktion med F-PR- BG- og R-Pr-BG (tabel 1) primere og det humane genomiske DNA i HEK293T celler som skabelon. PCR-produktet blev spaltet med Sad og BglII-restriktionsenzymer og klonet ind pGL3-Basic (Promega), der er blevet lineariseret med de samme restriktionsenzymer. Deletionsmutanter blev derefter konstrueret under anvendelse af pGL3-RHBG plasmid som en skabelon og de angivne primere (tabel 1). PCR-produkterne blev spaltet med Sad og BglII-restriktionsenzymer og klonet ind pGL3-Basic. Alle konstruktioner blev verificeret ved sekventering.

RNA ekstraktion og QRT-PCR

Totalt cellulært RNA blev ekstraheret ved hjælp TRIzol reagens (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger. DNase-behandling blev udført ved anvendelse af et DNA Removal Kit (Invitrogen, # AM1906). Et ug totalt RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af SuperScriptIII First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Realtime RT-PCR blev udført på et StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) under anvendelse GoTaq qPCR Master Mix (Promega) under anvendelse af de angivne primere (tabel 2) og normaliseret til p-actin mRNA-niveau målt parallelt.

Immunfluorescensfarvning

Celler blev dyrket i Millicell EZ 8 kammer slide (Millipore). Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter og derefter permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i 3 minutter og blev dernæst blokeret med gedeserum (5%) i 30 minutter. Celler blev inkuberet med β-catenin antistof (cellesignalering # 8480, 1: 100 i 5% gedeserum) natten over ved 4 ° C. Objektglas blev vasket og inkuberet med anti-kanin IgG (H + L), F (ab ‘) 2-fragment (Alexa Fluor 594 konjugat, cellesignalering, 1: 250 i 5% gedeserum) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med PBS blev objektglassene monteret med forlænge Guld antifade reagens med DAPI (Invitrogen).

Western Blot-analyse

Total proteiner blev ekstraheret under anvendelse af RIPA (25 mM Tris-HCI pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS) lyseringsbuffer suppleret med cocktail af phosphatase og proteasehæmmere (Roche). Efter centrifugering blev proteiner kvantificeret under anvendelse af Pierce BCA Microplate Protein Assay Kit-reduktionsmiddel Compatible assay (Thermo Scientific). Lige store mængder (~ 20 ug) af proteiner blev derefter adskilt ved Mini-PROTEAN TGX geler (Bio-Rad). Proteiner blev overført til nitrocellulosemembran (Protran, VWR). Membraner blev blokeret med 5% mælk og inkuberet med anti-β-catenin (cellesignalering, # 8480, 1: 1000), anti-TCF4 (# 2569, 1: 1000), anti-Glutaminsynthetase (Abcam, # ab73593, 1 : 1000) eller anti-β-Actin (Sigma, # A2228, 1: 2000). Primære antistoffer blev påvist med peberrod-peroxidase-konjugeret anti-kanin eller anti-mus-IgG sekundære antistoffer (GE Healthcare) efterfulgt af måling af chemoluminescens (Lumi-LightPLUS, Roche).

RNA-interferens

Celler blev revers transficeret med præ-designet lyddæmper vælge ikke-targeting kontrol (Invitrogen, # 4.390.843) eller siRNA’er målretning β-catenin (Invitrogen, # s438) eller TCF4 (Invitrogen, # s13880) med lipofectamin siRNAMAX (Invitrogen). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 72 eller 96 timer og angiven mRNA og proteiner plan blev undersøgt ved QRT-PCR og western blotting, henholdsvis.

Transfektion og luciferase assay

Celler blev transient cotransficeret med PTK-Renilla luciferase reporter vektor (Promega) og tomme plasmid (pGL3-Basic, Promega) eller plasmidet indeholdende den indikerede

RHBG

promotorkonstruktioner i 48 timer under anvendelse af Viafect transfektionsreagens (Promega). Luciferaseaktivitet i totale cellelysater blev målt ved anvendelse af Dual-Glo luciferase reporter assay (Promega) ifølge producentens instruktioner. Luminescens blev målt ved hjælp GloMax-96 Microplate Luminometer (Promega).

chromatin immunoprecipitation (CHIP) assay

CHIP assay blev udført ved hjælp SimpleChIP Enzymatisk chromatin IP Kit (magnetiske perler, cellesignalering) i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt blev cellerne fikseret med 1% formaldehyd-opløsning til at tværbinde histon og ikke-histon-proteiner til DNA. Nuklear kromatin blev fordøjet med Micrococcal nuklease i 20 minutter ved 37 ° C og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med enten anti-β-catenin (cellesignalering, # 8480, 1:50), anti-TCF4 (# 2569, 1: 50) normalt kanin IgG (cellesignalering, # 2729). Efter vask med lav og høj salt chip buffere, blev protein-DNA-komplekser elueres og tværbindinger blev derefter vendt om. Efter proteinase K-fordøjelse, DNA oprenses og kvantificeret ved Real time-PCR som beskrevet tidligere under anvendelse af primere der er anført i tabel 2 og designet til at amplificere de angivne promotorområder af målgener.

Statistisk analyse

data er udtrykt som middelværdi ± SEM Statistiske sammenligninger blev vurderet ved Students

t

-tests hjælp Graph Pad Prism-version 5.00 software (Graph Pad Software). Forskelle blev betragtet som signifikante, når p-værdien er under 0,05 (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001), n ​​= 3, bortset Chip eksperimenter, hvor n = 2. Salg

Resultater

RHBG

er stærkt udtrykt i HepG2 hepatomaceller

Den menneskelige

RHBG

genet blev fundet at være overudtrykt i en delmængde af hepatocellulært karcinom [18], men de regulatoriske mekanismer fortsat ukendt. For at identificere en kræftcelle linje, der kunne bruges til at løse reguleringen af ​​

RHBG

, vi evalueret sine udtryk niveauer i HepG2 og Hep3B hepatomaceller. HepG2-celler bærer en heterozygot deletion i exon3 af β-catenin

CTNNB-1

gen, der producerer et afkortet β-catenin-protein som mangler vigtige rester for dens phosphorylering af ødelæggelsen komplekse og således resulterer i dets cellulære akkumulation [ ,,,0],26-28]. Hep3B celler stammer fra en hepatitis B- inficeret levertumor, og ikke indeholder mutationer i β-catenin gen [29,30].

RHBG

gen dukkede stærkt udtrykt i HepG2 sammenlignet med Hep3B celler, idet sidstnævnte viser lidt højere ekspressionsniveau sammenlignet med den for HEK293T celler taget som en normal celle model (fig 1A). Ekspressionsniveauet af

GLUL

, genet af glutaminsyntetase (GS) blev også opreguleret i HepG2-celler sammenlignet med Hep3B (Fig 1B). Som GS-genet er et maal var β-catenin [31,32], kan dette være i overensstemmelse med en mere effektiv β-catenin signalering i HepG2-celler i forhold til Hep3B.

GLUL

ekspressionsniveauerne blev bekræftet af de resulterende GS protein niveauer der udkom højere i HepG2 forhold til Hep3B celler (Fig 1C). Efter kontrol af ekspressionen af ​​det andet ikke-erythroid

RH

gen,

rhCG

, meget lave niveauer blev fundet i HepG2, Hep3B og HEK293T celler (Fig 1D). Disse data således pege på HepG2 celler som er egnede til studiet af

RHBG

udtryk.

A) Niveauet af mRNA-ekspression af

RHBG

i HEK293T, HepG2 og Hep3B celler blev bestemt ved QRT-PCR og normaliseret for p-actin. B) Det mRNA ekspressionen af ​​

GLUL

i HepG2 og Hep3B blev bestemt ved QRT-PCR. C) Western blot-analyse af GS-protein fra totale cellelysater af HepG2 og Hep3B celler. D) Niveauet af mRNA-ekspression af

rhCG

i HEK293T blev HepG2 og Hep3B celler bestemt af QRT-PCR og normaliseret til p-actin. E) Western blot-analyse af β-catenin-protein fra totale cellelysater af HEK293T, HepG2 og Hep3B celler.

Vi næste kontrolleret β-catenin-proteinniveauer i HepG2, Hep3B og HEK293T celler. I overensstemmelse med tidligere rapporter [33,34], HepG2-celler nærede to β-catenin arter sandsynligvis svarer til vildtypen og de trunkerede former (fig 1E). En β-catenin-protein med størrelsen af ​​vildtype-formen blev påvist i både HEK293T og Hep3B, med ingen tydelig akkumulering i sidstnævnte cellelinie. Det blev tidligere vist, at β-catenin er til stede i kernen af ​​HepG2-celler i modsætning til Hep3B celler [34]. Disse data tyder på en sammenhæng mellem

RHBG

udtryk i HepG2 celler og nuklear lokalisering af β-catenin.

Silencing af β-catenin korrelerer med

RHBG

nedregulering i HepG2 celler

Vi næste anvendte β-catenin siRNA at teste, om

RHBG

genekspression observeret i HepG2-celler er relateret til p-catenin funktion. Transfektion af HepG2-celler med β-catenin siRNA i 72 timer førte til et fald i β-catenin mRNA-niveau sammenlignet med celler transficeret med ikke-targeting siRNA (Fig 2A). Reduktionen af ​​β-catenin-mRNA resulterede i en reduktion af β-catenin-proteinniveauer (Fig 2B). Notatet

RHBG

genekspression blev stort set reduceret ved β-catenin lyddæmpning (fig 2C). Ligeledes ekspressionsniveauerne af

Axin2

cyclin D1

, to mål for β-catenin regulering [35-38], blev også reduceret med β-catenin dæmpning (Fig 2D og 2E). I modsætning hertil blev det lave ekspressionsniveau af

rhCG

observeret i HepG2-celler ikke påvirkes af β-catenin silencing (fig 2F). Derfor er hæmning af β-catenin ledsaget af nedregulering af

RHBG

genekspression i HepG2-celler.

AF) HepG2-celler blev revers transficeret med β-catenin eller kontrol (scramble) siRNA’er. 72 timer efter transfektion ekspressionsniveauer af

β-catenin

mRNA (A), β-catenin-protein (B),

RHBG

mRNA (C),

Axin2

mRNA (D),

cyclin D1

mRNA (E) og

rhCG

mRNA (F) blev bestemt.

Beta-catenin drev

RHBG

udtryk i SW480 tyktarmscancerceller

Mutationer inducerer β-catenin aktivering er blevet identificeret i forskellige typer af tumorer, herunder melanom, prostata, bryst, og tyktarmskræft [21,33,39,40]. Vi næste testet, om β-catenin signalering kunne korreleres med

RHBG

ekspression i en anden cancer cellelinie, der huser β-catenin signalering aktiverende mutationer. De SW480 tyktarmskræft celler forsynet med en beskærer mutation i

APC

gen, hvilket resulterer i stabilisering og nuklear ophobning af β-catenin og fører til konstitutiv aktivering af β-catenin signalering [41-44]. Konsekvent, immunofluorescens eksperimenter afslørede en stærk nuklear lokalisering af β-catenin i disse celler (Fig 3A). Transfektion af SW480-celler med β-catenin siRNA i 72 timer førte til en nedgang i både mRNA og protein niveauer af β-catenin (fig 3B og 3C). I lighed med HepG2-celler, blev β-catenin dæmpning ledsaget af et stort fald i

RHBG

ekspression i SW480-celler (Fig 3D). Ekspressionsniveauerne af

Axin2

, og

CylcinD1

(fig 3E og 3F), var også nedsatte efter β-catenin dæmpning, i overensstemmelse med β-catenin signalhæmning.

rhCG

udtryk blev ikke signifikant påvirket ved β-catenin dæmpning (Fig 3G).

A) Repræsentative resultater af immunfluorescens af β-catenin lokalisering i SW480 celler ved hjælp af β-cateninantistof. Kerner blev farvet med DAPI. B-G) SW480 celler blev revers transficeret med β-catenin eller kontrol (scramble) siRNA’er. 72 timer efter transfektion ekspressionsniveauer af

β-catenin

mRNA (B), β-catenin-protein (C),

RHBG

mRNA (D),

Axin2

mRNA (E),

cyclin D1

mRNA (F) og

rhCG

mRNA (G) blev bestemt.

Disse resultater indikerer, at sammenhængen mellem β-catenin signalering og

RHBG

udtryk kan udvides til SW480 kolon kræftceller.

Aktivering af β-catenin korrelerer med

RHBG

gen induktion i HEK293T celler

vi næste rettet om aktivering af β-catenin i en cellelinie uden større nuklear aktivitet af β-catenin kunne være tilstrækkelig til at inducere

RHBG

ekspression. LiCI er rapporteret at inhibere GSK3-kinase [45,46], hvilket fører til p-catenin stabilisering og kerneakkumulation [47,48]. Vi behandlede derfor HEK293T celler med LiCI (10 og 20 mM) for at aktivere Wnt /β-catenin pathway. I overensstemmelse med tidligere observationer, immunofluorescens og Western blot eksperimenter viste, at behandling af HEK293T celler med LiCI i 24 timer inducerede et nukleart ophobning og stabilisering af β-catenin (fig 4A og 4B). Af note, LiCI behandling samtidig inducerede en stigning i mRNA-niveauet af

RHBG

på en dosis-afhængig måde (figur 4C). Dette resultat viser, at

RHBG

ekspression kan opreguleres ved kunstig aktivering af β-catenin signalering og foreslår, at aktivering af denne pathway kan være tilstrækkelig til at inducere

RHBG

ekspression i HEK293T celler.

A) HEK293T celler blev behandlet med LiCI (20 mM) i 24 timer. β-catenin lokalisering blev bestemt ved immunofluorescens ved anvendelse af β-catenin antistof. Kerner blev farvet med DAPI. B) HEK293T celler blev behandlet med LiCI (10 eller 20 mM) i 24 timer. β-catenin proteinniveau blev bestemt i totale cellelysater ved immunoblotting under anvendelse af β-catenin antistof. C) Samme dyrkningsbetingelser som i B.

RHBG

mRNA-niveau blev bestemt ved QRT-PCR.

RHBG

udtryk i HepG2-celler er afhængig af TCF4

Wnt /β-catenin pathway driver Wnt-specifikke transkriptionelle programmer via interaktion med DNA-bindende faktorer af TCF /LEF familie [21,22]. Imidlertid rapporteres det, at β-catenin også kan aktivere genekspression i en TCF4-uafhængig måde [49-51]. For at løse en rolle TCF4 /β-catenin-komplekset i

RHBG

udtryk, vi evaluerede effekten af ​​hæmning af β-catenin-aktivitet i HepG2-celler ved anvendelse af en antagonist af TCF4 /β-catenin-komplekset, PKF118 -310. Denne forbindelse afbryder TCF4 /β-catenin-komplekset og inhiberer ekspression af TCF4-afhængige gener [52]. Behandling af HepG2 celler med PKF118-310 var ledsaget af et fald i

RHBG

ekspression (Fig 5A).

GLUL

udtryk niveau blev også reduceret med behandlingen i overensstemmelse med en sandsynlig reduktion af TCF4 /β-catenin medieret transskription i disse betingelser (figur 5B).

AB) HepG2 celler blev behandlet med PKF118-310 (0,2 eller 0,4 uM) i 24 timer.

RHBG Hotel (A) og

GLUL

(B) mRNA-niveauer blev bestemt ved QRT-PCR. C-G) HepG2 celler blev omvendt transficeret med TCF4 eller kontrol (kapløbet) siRNAs. 72 timer efter transfektion, niveauer af

TCF4

mRNA (C), TCF4 protein (D),

RHBG

mRNA (E),

Axin2

mRNA (F), og

Cylcin D1

mRNA (G), blev bestemt.

for yderligere at hævde en rolle TCF4 i

RHBG

udtryk, vi testede effekten af ​​TCF4 knockdown i HepG2-celler. Transfektion af de sidstnævnte celler med TCF4 siRNA i 72 timer faldt både mRNA og protein niveauer af TCF4 sammenlignet med celler transficeret med ikke-targeting siRNA (Fig 5C og 5D). Vigtigere er det,

RHBG

mRNA-niveau blev reduceret på TCF4 silencing (Fig 5E) Tilsvarende

Axin2

cyclin D1

mRNA niveauer blev også faldet (Fig 5F og 5G ) i overensstemmelse med tidligere observationer beskriver de tilsvarende gener som mål for TCF4 [38,40]. Desuden lignende TCF4 silencing eksperimenter udført i SW480 kolon adenokarcinomceller faldt også

RHBG

,

Axin2

cyclin D1

mRNA-niveauer (Fig 6A-6E).

AE) SW480 celler blev omvendt transficeret med TCF4 eller kontrol (kapløbet) siRNAs. 72 timer efter transfektion niveauer af

TCF4

mRNA (A), TCF4 protein (B)

RHBG

mRNA (C),

Axin2

mRNA (D), og

cyklin D1

mRNA (E), blev bestemt.

Disse resultater viser sammen, at β-catenin-medieret ekspression af

RHBG

er i det mindste delvist TCF4-afhængig i både HepG2 og SW480 celler.

RHBG

promotor aktiveres ved β-catenin /TCF4

For yderligere undersøgelse

RHBG

udtryk og identificere potentielle regulatorer, et genomisk fragment (figur 7) indeholdende 2349 bp opstrøms og 142 bp nedstrøms for

RHBG

forudsagte transkriptionelle startsted (TSS) blev retningsbestemt subklonet ind i pGL3-basisk ildflueluciferase reporter vektor. For at teste om dette fragment besidder en promotoraktivitet,

RHBG

promotorkonstruktionen (pGL3-RHBG) og det native pGL3-basisk vektor blev anvendt til transient co-transfektion af HepG2-celler sammen med PTK-Renilla luciferase reporter vektor som transfektion kontrol. 48 timer efter transfektion luciferaseaktiviteten i pGL3-RHBG transficerede celler var omkring 30 gange højere end med pGL3-basisk plasmid indikerer at de klonede

RHBG

sekvens indeholder en aktiv promotor (Fig 8A).

Den potentielle menneske

RHBG

promoter sekvens blev opnået fra eukaryot promotor database (https://epd.vital-it.ch/). Sort pil (↓) indikerer den forudsagte transkriptionsstartstedet (TSS), som er udpeget nukleotid 0. GC kasser er skygget. Et udvalg af potentielle bindingssteder (med 0 eller mindre end 5% forskellighed) af transkriptionsfaktorer identificeret ved hjælp PROMO [54,55] er understreget. Potentielle TCF4 bindingssteder er angivet med tomme kasser. Vandrette pile (→) angiver start rest position for hver promotor konstruktion analyseret i figur 8.

HepG2 celler blev transficeret med den tomme plasmid (pGL3) eller

RHBG

promotor (pGL3 -RHBG) sammen med Renilla plasmid. 48 timer efter transfektion

RHBG

promotoraktivitet i totale cellelysater blev bestemt ved luciferase assay. B) HepG2-celler blev transficeret med

RHBG

promotoren (pGL3-RHBG) eller det angivne konstrukt sammen med Renilla plasmid. 48 timer efter transfektion

RHBG

promotoraktivitet blev bestemt ved måling luciferaseaktivitet i totale cellelysater. Data er udtrykt som gennemsnit af tredobbelte bestemmelser ± S.E.M af pGL3-RHBG konstruere forhold til pGL3-Basic. C) HepG2-celler blev transficeret med den angivne konstruktion sammen med Renilla plasmid. 48 timer efter transfektion,

RHBG

promoter aktivitet blev bestemt ved at måle luciferaseaktivitet i de samlede cellelysater.

Sekvensanalyse af

RHBG

regulerende sekvens afslørede ikke en potentiel TATA-boks, mens regionen proksimalt for den forudsagte TSS blev beriget i G /C-indhold, hvilket viser, at

RHBG

promotor sandsynligvis svarer til en TATA-mindre GC-rige promotor. To potentielle GC kasser blev afbildet, indlejret i potentielle Sp-1 bindingssteder (figur 7). For yderligere at dissekere de regioner, der er vigtige for aktiviteten af ​​det klonede

RHBG

promotor, blev en række konstruktioner genereret bærende progressive deletioner i dette DNA-fragment (fig 7 og 8).

Selvom udsving var bemærkede under de betragtede fragment, alle konstruktioner indeholdende den -60 /+ 142 region produceret en luciferaseaktivitet meget tæt på eller højere end fuldlængde pGL3-RHBG konstruktion (fig 8B). Af notere -60 /+ 142 region fragment H, der kun omfatter en af ​​de to GC kasser, bibeholdt høj luciferaseaktivitet. Konstruktionerne bærer yderligere 5 ‘trunkering i denne region førte til en større fald i

RHBG

promotor funktion, -22 /+ 142 region viser en meget lav luciferaseaktivitet (Fig 8B). Dette understreger vigtigheden af ​​DNA-segmentet mellem fragment H og I, og indikerer, at udtrykket nyrefunktion er mest sandsynligt på grund af tabet af den anden GC boksen. Derudover analyse af -60 /+ 142 funktionelle segment afslørede tilstedeværelsen af ​​tre CTTTG /CAAAG motiver, som kunne tjene som TCF4 bindingssteder (figur 7). Disse motiver er enten anbragt ved siden af ​​eller nedstrøms for det formodede TSS. For at evaluere et potentielt bidrag af disse motiver til reguleringen af ​​

RHBG

genekspression, promotor konstruktioner bærer -60 /+ 142 region af fragment H med sletning af potentiel TCF4 bindende motiv 2 eller motiver 2 og 3, blev dannet. Begge konstruktioner viste en promotoraktivitet (Fig 8C). Men sletning af motiv to reducerede promotoraktiviteten til halvdelen af ​​fragment H, og samtidig sletning af motiver 2 og 3 yderligere reduceret promotoraktiviteten, hvilket tyder på et bidrag på disse motiver til funktionaliteten af ​​

RHBG

promotor .

Vi endelig udført chromatin immunoprecipitation (chip) assays til bestemmelse af, om TCF4 og β-catenin er i stand til at binde -60 /+ 142 segment af

RHBG

promotor

in vivo

. Kerneekstrakter opnået fra HepG2-celler blev underkastet protein /DNA-kompleks tværbinding og immunpræcipitation blev udført under anvendelse af antistoffer rettet mod enten β-catenin, TCF4 eller IgG som en kontrol. qPCR anvendelse af primere inden for H-regionen viser, at TCF4 og β-catenin binder til dette fragment af

RHBG

promotoren (figur 9). Konsekvent, TCF4 og β-catenin heller binde til

Axin2

promotor, taget som kontrol, som tidligere rapporteret [37,53].

HepG2 celler blev tværbundet med formaldehyd, efterfulgt af kromatin fordøjelse. Kromatin immunopræcipitationer blev udført under anvendelse af antistoffer rettet mod enten β-catenin, TCF4 eller IgG som en kontrol. Oprenset DNA blev analyseret ved qPCR anvendelse af de angivne primere. Mængden af ​​immunopræcipiteret DNA med hvert antistof er angivet som signal i forhold til IgG (svarende til 1) (n = 2).

Disse resultater indikerer, at TCF4 /β-catenin specifikt binder til -60 /+ 142 region af

RHBG

promotor, og sandsynlige forbedrer

RHBG

udtryk i HepG2-celler.

diskussion

Denne undersøgelse identificerer hepatoma HepG2-celler som udtryk for

RHBG

gen, der koder en ammonium transport protein. Vi viser, at i disse celler

RHBG

udtryk er i høj grad afhængig af β-catenin funktion. Vi udfører en funktionel analyse af

RHBG

opstrøms regulatorisk sekvens, afslører en minimal region bærer en promotor-aktivitet. Vores data indikerer, at

RHBG

regulatorisk sekvens er en TATA-mindre GC-rige promotor. Vi viser, at β-catenin og TCF4 er begge i stand til at binde den minimale promotorområde

in vivo

og karakterisere potentielle TCF4 bindende motiver vigtige for promotor-aktivitet. Vores data understøtter en direkte rolle for β-catenin /TCF4 i reguleringen af ​​

RHBG

udtryk i denne cellelinie, og yderligere viser, at

RHBG

kunne tjene som en direkte reporter af Wnt /β-catenin pathway i specifikke cancercellelinier sammenhænge.

Hepatocellulært carcinoma er den mest almindelige voksne liver malignitet og mange former for evidens associeret hyperaktivering af Wnt /β-catenin pathway til dens iværksættelse og udvikling [56]. Unormal aktivering af Wnt /β-catenin signalering, på grund af tab-af-funktion-mutationer i APC eller aktiverende mutationer i β-catenin er blevet forbundet med forskellige humane maligniteter herunder melanom, bryst- og coloncarcinomer [22]. For eksempel, mere end 80% af coloncancere bærer trunkeringer i APC, hvilket resulterer i aktiv β-catenin akkumulering i cellekernen, den indledende fase af transformation [56-58].