PLoS ONE: Den EphB4 receptortyrosinkinase Fremmer Lung Cancer Vækst: En Potentielle nye terapeutiske Target

Abstrakt

Trods fremskridt i locoregional og systemiske behandlinger, patient overlevelse af lungekræft er fortsat en udfordring. Receptortyrosinkinaser ofte impliceret i lungekræft patogenese, og nogle tyrosinkinaseinhibering strategier har været effektive klinisk. EphB4 receptortyrosinkinase har for nylig vist sig som et potentielt mål i flere andre kræftformer. Vi søgte systematisk studere rolle EphB4 i lungekræft. Her viser vi, at EphB4 overudtrykkes 3-fold i lungetumorer i forhold til parrede normale væv og ofte udviser genkopital stigninger i lungekræft. Vi viser også, at overekspression af EphB4 fremmer cellulær proliferation, kolonidannelse, og motilitet, mens EphB4 inhibering reducerer cellulær levedygtighed

in vitro

, standser væksten af ​​etablerede tumorer i mus xenograftmodeller når det bruges som en enkeltstrenget target-strategi , og forårsager næsten fuldstændig regression af etablerede tumorer, når de anvendes i kombination med paclitaxel. Taget sammen antyder disse data en vigtig rolle for EphB4 som en potentiel hidtil ukendt terapeutisk mål i lungekræft. Kliniske forsøg undersøger effekten af ​​anti-EphB4 behandlingsformer samt kombinationsbehandling involverer EphB4 hæmning kan være berettiget

Henvisning:. Ferguson BD, Liu R, Rolle CE, Tan Y-HC, Krasnoperov V, Kanteti R, et al. (2013) Den EphB4 receptortyrosinkinase Fremmer Lung Cancer Vækst: En Potentielle nye terapeutiske Target. PLoS ONE 8 (7): e67668. doi: 10,1371 /journal.pone.0067668

Redaktør: Todd W. Miller, Dartmouth, USA

Modtaget: Februar 19, 2013; Accepteret: 21. maj 2013; Udgivet: 2 juli 2013

Copyright: © 2013 Ferguson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning er blevet støttet delvist af NIH /NICHD T32HD009007, “Graduate Training i vækst og udvikling” (BDF), ASCO Translational Award (EEV), NIH /NCI R01 CA 129501 05 (RS), og Janice Lamb McArdle Cancer Research Foundation (RS ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. PSG er medstifter og direktør for Vasgene Therapeutics, Inc. VK er en medarbejder i Vasgene Therapeutics, Inc. Der er patenter og produkter i udvikling, men ingen markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere. De øvrige forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Selvom mange lægemiddelkandidater er blevet omfattende undersøgt, har den samlede overlevelse for lungekræft forbedret kun minimalt i de sidste fire årtier [1 ]. En hyppig karakteristisk for lungekræft er en afvigelse, hvor en eller flere receptor (RTK’er), såsom MET, EGFR, og ALK er almindeligt overudtrykkes, amplificeret, eller muteret [2] – [4]. Eph familie er den største familie af RTK’er, der omfatter fjorten mammale receptorer, der interagerer med otte mammale ligander eller ephriner. Eph-receptorer og Ephrin ligander er organiseret funktionelt og strukturelt ind A- og B-klasser [5]. Eph-receptorer er relativt ens på tværs klasser; imidlertid membranbundne ephrin-B-ligander er unikke ved, at de besidder ekstracellulære domæner, der aktiverer receptorer samt intracellulære domæner, der menes at signalere nedstrøms i en tilstødende celle [6]. Der er en vis promiskuitet blandt receptor og ligand-interaktioner; en af ​​de mest specifikke receptor-ligand interaktioner, dog er mellem EphB4 og ephrin-B2 [7].

Klassisk, har Eph-receptorer været store aktører i udviklingsmæssige biologi givet deres roller i Axon vejledning, vaskulogenese, og neural udvikling [8]. Men flere Eph-receptor familiemedlemmer har også vist, at spille en rolle i cancer. Vi har for nylig vist, at EphA2 overeksprimeres i lungekræft og huser et gain-of-funktion punkt mutation i nogle pladecellecarcinomer, og EphA2 inhibering foruden rapamycin eksponering i lungecancerceller reduceret deres proliferation

in vitro

[9]. EphB4 er også blevet rapporteret at spille en onkogen rolle i cancer i hoved og hals [10], [11], prostata [12], [13], andre urogenitale organer [14] – [19], bryst [20], mesothelium [21], spiserør [22], hud [23], og tyktarmen [24], [25]. EphB4 mutationer er også for nylig blevet rapporteret i lungekræft [26], [27], selv om deres betydning er i øjeblikket ukendt. Men det er ikke blevet systematisk undersøgt i lungekræft og dens potentielle rolle i denne sygdom er derfor fortsat et vigtigt spørgsmål.

Her viser vi, at EphB4 er et vigtigt terapeutisk mål i lungekræft, da det er overudtrykt og ofte demonstrerer øget gen kopiantal. Desuden knockdown eller hæmning af EphB4 dæmper væksten af ​​kræft celler

in vitro

in vivo

, mens indførelsen af ​​vildtype EphB4 giver en gevinst på funktion i tumorceller. Tilsammen disse data identificerer EphB4 som en potentielt vigtig drivkraft i patogenesen for lungekræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

tumorvæv blev dokumenteret sammen med patientkarakteristika når de er tilgængelige med skriftligt informeret samtykke og i overensstemmelse med University of Chicago Institutional Review Board-godkendt protokol. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Southern California og udført i overensstemmelse med dyreværnsloven regler.

Reagenser og antistoffer

Alle primere blev designet ved hjælp Primer3Plus [28] og købt fra Integrated DNA Technologies (Coralville IA). Anti-EphB4 antistoffer (# 265 for IB og # 131 for IHC), anti-ephrin-B2-antistof (# 2B5) og humant serumalbumin-konjugeret opløselige EphB4 (sEphB4-HSA), blev generøst leveres af Gill Laboratory, University i det sydlige Californien. Ephrin-B2 /Fc kimære protein blev indkøbt fra R # 131) ved en koncentration på 40 ug /ml, derefter inkuberet i 30 minutter med gede-anti-muse-IgG konjugeret til et HRP-mærket polymer (Bio SB, Santa Barbara CA). Objektglas blev derefter fremkaldt i 5 minutter med 3-3′-diaminobenzidin kromogen, modfarvet med hematoxylin, og dækglas. Negative kontroller blev udført ved at substituere primære antistof med ikke-immune mus immunoglobuliner. Colon cancer og hjerne vævssnit tjente som positive kontroller for EphB4 farvning [25], [29].

Tissue udtryk for hver prøve blev kvantificeret ved manuel scoring på en 0/1 + /2 + /3 + skala samt ved en automatiseret Cellular Imaging System (ACIS; Clarient, Aliso Viejo CA), der kvantificerer farvningsintensitet baseret på forholdet af brun til blå pixels per arealenhed. ACIS Softwaren beregner den gennemsnitlige intensitet for hver region analyseret og beregner integreret optisk densitet (IOD), som er direkte proportional med koncentrationen af ​​antistof-bundet EphB4 molekyler ifølge Beer-Lambert-loven [30]. Derfor IOD er ​​en proxy for antigenindhold, og det var normaliseret til hele målte område ved at beregne IOD /10 um

2. Samlet set blev der manuel scoring og ACIS analysemetode som parallelle udtryk kvantificeringsmetoder og viste sig at have en sammenhæng med r

2 = 0,75 (Spearman korrelation, s 0,0001, Figur S1). Som udtryk tendenser var ens med begge metoder, er primært ACIS data rapporteret her. Ekspressionsmønstre anvender samme anti-EphB4 antistof var ens i friske frosne vævsprøver (figur S2).

immunblotting

helcellelysater blev opsamlet ved hjælp af M-PER pattedyrprotein ekstraktion reagens (Pierce , Rockford IL) suppleret med 1,8 x proteasehæmmer (Pierce) og 1,8 × Halt phosphatase inhibitor (Pierce). Proteinkoncentration blev estimeret ved anvendelse af en NanoDrop spektrofotometer (Thermo, Wilmington DE), og 100 ug protein blev fyldt i en 7,5% gel og underkastet SDS-PAGE ved 80-120V i 1-2 timer. Proteiner blev overført til polyvinyliden fluorid membraner i en overførsel apparat halvtør ved 25V i 1 time, vasket kortvarigt, og membraner blev blokeret med 5% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time ved stuetemperatur. Efter en 5 minutters vask blev membraner eksponeret i 1 time ved stuetemperatur til anti-EphB4 primære antistof (anti-muse; # 265) eller anti-ephrin-B2 primære antistof (anti-muse; # 2B5) ved en koncentration på 0,5 ug /ml i 2,5% BSA /0,05% Tween-20. Membraner blev derefter vasket tre gange i 10 minutter og inkuberet som ovenfor i anti-muse-sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP) ved en 1:5000 fortynding i 1 time. Efter endnu en vask blev membraner inkuberet i forøget kemiluminescens-opløsning (Bio-Rad, Hercules CA) og fotograferet under anvendelse af et Bio-Rad QuantityOne imaging system. β-actin blev probet på samme måde som en loading kontrol. Den prostatacancer-cellelinie PC3 blev anvendt som en positiv kontrol for EphB4 ekspression [19].

Flowcytometri Salg

Celler blev vasket en gang med phosphatbufret saltvand (PBS) og dissocieres derefter med PBS /0,2% EDTA ved 37 ° C i ca. 5 minutter. Efter neutralisation af EDTA med dyrkningsmedier blev celler centrifugeret ved 1000 rpm i 5 minutter. Celler blev derefter vasket med kold PBS /0,5% BSA, efterfulgt af inkubation med 10% normalt gedeserum på is i 30 m, og derefter med primære antistoffer fortyndet i normalt gedeserum på is i 1 time. Celler blev efterfølgende vasket med kold PBS og inkuberet med fluorochrom-konjugerede sekundære antistoffer på is i 30 minutter. Efter en sidste vask med kold PBS, blev cellekerner farvet med DAPI og analyseret med et flowcytometer (LSR II, BD Biosciences, Franklin Lakes NJ).

Kvantitativ PCR

For at bestemme EphB4 genkopiantallet i væv DNA, blev real-time kvantitativ PCR udført under anvendelse af en Applied Biosystems StepOne Plus instrument (Foster City CA). Reaktionsblandinger indeholdt Fast SYBR Green Master Mix (2X; Applied Biosystems), genomisk DNA, forward og reverse qPCR primere (vist i tabel S1), og molekylærbiologi-grade vand til total 25 pi per reaktion. qPCR hjælp LINE-1-primere blev udført parallelt for at tjene som en genkopitallet reference, som til at normalisere rå fluorescensværdier, og reaktioner indeholdende forskellige fortyndinger af kontrol genomisk DNA (Promega, Madison WI) blev anvendt til at konstruere en standardkurve at ekstrapolere væv DNA-koncentrationer, og kontrollere, at disse koncentrationer faldt inden for det lineære afsløring vifte af instrumentet.

siRNA Knockdown

for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinjer, celler blev belagt hjælp antibiotika -fri medium i plader med 96 brønde med en tæthed på 2,0 x 10

4 celler per brønd (for cellelevedygtighedsassays, otte eller flere replikater pr eksperiment) eller 6-brønds plader ved en densitet på 5,0 x 10

5-celler per brønd (for hel-cellelysat samling) og fik lov til at vokse til 30-50% konfluens. Celler blev transficeret under anvendelse Oligofectamine transfektionsreagens (Life Technologies, Carlsbad CA) i overensstemmelse med normal protokol. FBS blev tilsat til 10% slutkoncentration efter 4 timer. Utransficerede og mock-transficerede celler fungerede som kontrol. Protein knockdown blev bekræftet ved immunoblotting (figur S3).

I småcellet lungecancer (SCLC) cellelinier, celler blev udpladet under anvendelse af Opti-MEM medier i 6-brønds plader ved en densitet på 5 x 10

5 celler per brønd (tre gentagelser pr betingelse). Celler blev transficeret med 100 nM ikke-targeting kontrol siRNA eller EphB4-targeting siRNA (Santa Cruz) ved anvendelse Oligofectamine transfektionsreagens i henhold til dens standardprotokol. Efter inkubation natten over blev celler opsamlet ved centrifugering og resuspenderet i komplette medier. Mock-transficerede og kontrol siRNA-transficerede celler fungerede som kontrol. Protein knockdown blev bekræftet ved immunoblotting.

Ekspression af EphB4 Konstruktioner i cellelinier

En vildtype EphB4 cDNA-klon i pCMV6-XL6 vektor (Origene, Rockville MD) blev anvendt som en mammal ekspressionsvektor. For transient transfektion blev celler udpladet i antibiotikum-frit medium i enten 96-brønds plader ved en densitet på 2,0 x 10

4 celler per brønd (for cellelevedygtighedsassays, otte replikater pr eksperiment) eller 10 cm skåle ved en densitet på 3,0 × 10

6 celler pr plade (for hel-cellelysat samling) og fik lov til at vokse til ca. 50-75% konfluens (for at muliggøre eksponentiel vækst over de følgende 72 timer). Celler blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Life Technologies) i overensstemmelse med normal protokol. Komplekser blev fjernet efter 4-6 timer og erstattet med frisk antibiotikum-frit medium efter vask med PBS. Utransficerede og mocktransfekterede (transfektion reagens kun) celler fungerede som kontrol. Proteinekspression blev bekræftet ved immunoblotting (figur S4)

Etablering af stabile EphB4-udtrykkende cellelinier

Vildtype fuldlængde EphB4 cDNA (GenBank accession number NM_004444, OriGene, Rockville MD). blev klonet ind pcDNA3.1 med en C-terminal Myc-mærke i ramme. Denne vektor og kontrol pcDNA3.1 tom vektor blev individuelt transficeret i H661 celler under anvendelse BIOT (Bioland, Paramount CA) ifølge producentens protokol. Efter transfektion blev dyrkningsmediet skiftet til den endelige vækstmedium (RPMI1640 tilsat 10% FBS) indeholdende 300 ug /ml G418. En uge senere blev overlevende celler trypsineret og udpladet på plader med 96 brønde med graduerede fortyndinger. Koncentrationen af ​​G418 i dyrkningsmediet blev reduceret til 200 ug /ml fra dette punkt. Enkelte kolonier opstod to uger senere og blev screenet ved immunoblotting under anvendelse af et anti-Myc-antistof (klon 9E10, ATCC). Kolonier med exogent EphB4-Myc-ekspression blev derefter ekspanderet.

cellelevedygtighed Assays Salg

I NSCLC cellelinier, efter transfektion af siRNA eller plasmider i celler eller behandling af celler med sEphB4-HSA i 96- brønds plader som beskrevet ovenfor, blev cellerne lov til at vokse, indtil den ønskede tidspunkt, på hvilket tidspunkt blev mediet fjernet, cellerne blev vasket en gang med PBS, og 100 pi frisk vækstmedium blev tilsat til hver brønd. Efter tilsætning af 5 pi af en 0,028% resazurin natriumsalt-opløsning (vægt /volumen; Sigma) blev pladerne inkuberet ved 37 ° C beskyttet mod lys i 2-5 timer, og fluorescens blev målt under anvendelse af en fluorescenspladelæser (530 /590nm excitation /emission). For ephrin-B2 /Fc stimulation assays, 5 × 10

4 celler /brønd blev podet i 24-brønds plader, sultet natten over, og stimuleret med 1 ug /ml ephrin-B2 /Fc i 0, 24, 48 eller 72 timer. Celler blev vasket to gange med 1 × PBS, farvet med trypanblåt-opløsning (0,4%; Sigma)., Og manuelt talt ved lysmikroskopi

I SCLC-cellelinier, blev celler udpladet i tre eksemplarer med en tæthed på 1 × 10

5 celler /brønd og behandlet med 0,5 ug /ml ephrin-B2 /Fc eller de angivne koncentrationer af AZ12489875-002. For siRNA-transficerede celler blev celler høstet 24 timer efter transfektion, resuspenderet i komplette medier, udpladet i tre eksemplarer med en tæthed på 1 x 10

5 celler /brønd, og efterladt ubehandlet eller behandlet med 200 nM af SN-38 i 72 timer ved 37 ° C. For ephrin-B2 /Fc stimulation assays, 5 × 10

4 celler /brønd blev podet i 24-brønds plader, sultet natten over, og stimuleret med 0,5 ug /ml ephrin-B2 /Fc i 48 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt ved tilsætning af 10 pi 5 ng /ml MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Sigma) i de sidste 2-4 timers dyrkning. Uopløselige formazan salte blev opløst ved tilsætning af 50 pi af et syrnet isopropanol opløsning. Absorbansen blev aflæst ved 570 nm inden for 15 minutter at stoppe reaktionen ved hjælp af en absorbans pladelæser.

topoisomerase I Activity Assay

H446 og H526 celler blev efterladt ikke-stimuleret eller stimuleret i 15 minutter med 50 ng /ml HGF eller ephrin-B2 /Fc, derefter vasket to gange med iskold PBS. Nukleare ekstrakter blev fremstillet som tidligere beskrevet [31]. Kort beskrevet blev celler opsamlet ved centrifugering og vasket en gang med iskold TEMP (10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 4 mM MgCl

2, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)). Celler blev efterfølgende suspenderet i 1 ml kold TEMP i 10 minutter og derefter centrifugeret ved 1500 x

g

i 10 minutter. Nukleare pellets blev resuspenderet i 20 pi TEP (10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,5 mM PMSF) plus 20 pi 1 M NaCl, anbragt på is i mindst 30 m, og derefter centrifugeret ved 15.000 ×

g

i 15 minutter.

Top1

enzymatisk aktivitet i kerneekstrakter blev målt under anvendelse af et DNA afslapning assay (TopoGen, Port Orange FL) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev 100 ng af supersnoet plasmid-DNA i en 20-pi reaktionsblanding (med 10 mM Tris-HCI (pH 7,9), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,1 mM spermidin, 5% glycerol) inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter med pæne og serielt fortyndet (1:4) nukleare ekstrakter, renset rekombinant human

Top1

(positiv kontrol), eller analyse fortyndingsmiddel (negativ kontrol). Reaktioner blev afsluttet ved tilsætning af 5 pi 5 x påsætningsbuffer (5% SDS, 0,3% bromphenolblåt). Prøver blev løst på en 1% agarose gel og afbildet som ovenfor.

Soft Agar Colony Formation Assay

For at vurdere tumorigent potentiale af de vildtype EphB4 celler, 1 × 10

4 levedygtige celler per brønd blev udpladet i blød agar på plader med 6 brønde. Kort fortalt blev basen lag fremstillet ved at blande lige volumener af steril 1,2% agar (afkølet til 40 ° C) og 2 × RPMI1640 medium til opnåelse af en endelig opløsning på 0,6% agar i 1 × RPMI1640 medium. For det øverste lag, blev agaren fortyndet til 0,8% i destilleret vand, afkølet til 40 ° C, og blandes derefter ligeligt med 2 x RPMI1640 medium. Cellerne blev straks tilsat til blandingen for at give en endelig opløsning på 0,4% agar i 1 × RPMI1640 medium. Cellerne voksede i 4 uger ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2, på hvilket tidspunkt levedygtige kolonier blev fotograferet og talt under anvendelse ImageJ software.

sårheling Assays Salg

H661 tom-vektor og vildtype EphB4 stabile klon celler blev podet i 6-brønds plader og dyrket indtil 100% konfluente, derefter behandlet med 1 ug /ml ephrin-B2 /Fc. En lige ridse skete over cellelaget anvendelse af en 1-ml pipettespids. Cellerne blev derefter forsigtigt vasket med 1 × PBS for at fjerne cellulært debris, og medierne blev udskiftet. Fotografier blev taget af såret region ved 0, 4, 7, 23 og 28 timer og analyseret af TScratch software (CSELab, ETH Zürich, Schweiz).

In vivo

tumorvækst

2 × 10

6 A549 eller H1993 eller 4 × 10

6 H446 celler blev injiceret i flankerne af 10-12 uger gamle Balb /C athymiske mus (Harlan Laboratories, Placentia CA ) og fik lov til at etablere primære tumorer ca. 75 mm

3 i volumen. Flanke injektioner blev valgt over en ortotopisk model på grund af deres veletablerede brug i lungekræft undersøgelser samt deres lette non-invasive tumor målinger [32]. Tumorvækst blev målt tre gange ugentligt, og volumenet blev beregnet ved anvendelse 0,52 × a × b

2 (afledt af beregning rumfanget af en sfæroide, V = 4/3 · π · a

2 · b, hvor a er radius af lilleaksen og b er radius af hovedaksen; Ref. 33), hvor a er den længste dimension, og b er den korteste dimension af håndgribelig masse. Seks dage efter implantation blev mus med A549 xenotransplantater opdelt tilfældigt i fire grupper (seks mus pr gruppe), og behandling blev påbegyndt: PBS (kontrol), paclitaxel (20 mg /kg ugentligt), sEphB4-HSA (20 mg /kg tre gange per uge), eller paclitaxel plus sEphB4-HSA. Mus med H1993 eller H446 xenotransplantater blev inddelt i to grupper (seks mus pr gruppe), og behandling blev påbegyndt: PBS (kontrol) eller sEphB4-HSA (50 mg /kg tre gange om ugen). Alle behandlinger blev indgivet intraperitonealt. Dyr blev til sidst aflivet, og tumorerne blev høstet ved eksperimentets afslutning.

Immunofluorescens

Væv høstet fra mus A549 xenotransplantater blev hurtigt nedfrosset og indlejret i OCT-forbindelse. 5-10 um snit blev fikseret i 4% paraformaldehyd, vasket i PBS og inkuberet i primære anti-Ki-67 (BD Biosciences), anti-CD31 (BD Biosciences), anti-phosphoryleret S6 (S235 /S236, Cell Signaling, Danvers MA), anti-phosphoryleret Akt [S473 (Ref 34).; Cellesignalering], eller anti-phosphoryleret Src (Y416; cellesignalering) antistof natten over ved 4 ° C. For immunfluorescens blev snit vasket i PBS og inkuberet med Alexa Fluor-konjugeret sekundært antistof (Life Technologies). En TdT-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) assay (Promega, Madison WI) blev også udført for at vurdere apoptose. DAPI blev anvendt som et nukleart kontrastfarve og tjente som kontrol, mod hvilken cellulære markør intensiteter blev normaliseret. Billeder blev taget med et Nikon Eclipse 80i fluorescens mikroskop og Meta Morph imaging-serie system. For immunohistokemi blev snit først inkuberet i biotin-konjugeret sekundært antistof, efterfulgt af HRP-konjugeret avidin, derefter 3,3′-diaminobenzidin-reagens (Vector Labs, Burlingame CA). Hematoxylin blev anvendt som et nukleart kontrastfarve. Billeder blev taget med et Olympus BX51 mikroskop og Image-Pro Plus 6.0-system.

Statistik

For immunhistokemisk farvning analyser, log

10 ACIS værdier for tumor versus matchede normale lungevæv var sammenlignet under anvendelse af en to-halet parret t-test for den samlede patientpopulation kohorte samt inden individuelle subtyper. Hver ACIS intensitet score repræsenterer middelværdien af ​​op til tre gentagelser for en given patient bestemmes ved anvendelse separate vævskerner inden for samme tumor microarray. Graden af ​​lighed mellem ACIS og manuel patologisk scoring blev bestemt ved hjælp af en to-halet Spearman korrelation. Overlevelsesdata er repræsenteret ved hjælp af Kaplan-Meier kurver baseret på immunhistokemisk intensitet scoring (høj versus lav ved hjælp af en cutoff score på 500 på ACIS, som repræsenterer den mediane samlede intensitet) og på race betegnelse.

For cellelevedygtighedsassays, replikere datapunkter blev midlet og sammenlignes enten med tid-matchet mocktransfekterede celler (for siRNA-transficerede celler) eller tid-matchede kontrolceller (for sEphB4-HSA-behandlede celler). At sammenligne behandlinger parvis blev en student t-test anvendes. Andre sammenligninger af to grupper blev foretaget under anvendelse af en t-test, og de af tre eller flere grupper blev foretaget ved hjælp af en-vejs ANOVA. For at vurdere variabiliteten mellem et sæt behandlingsbetingelser med forskellige tidspunkter, blev to-vejs ANOVA anvendes. Medmindre andet er angivet, fejlsøjler anvendes i visning cellelevedygtighed data repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien normaliseret til procent forskel versus kontrolværdier. For

in vivo

vækst analyser, blev den statistiske signifikans af forskelle i tumorvækst på hvert tidspunkt for hver betingelse bestemmes ved hjælp af enten en elevs t-test for uparrede prøver eller envejs ANOVA for prøver blandt fire behandlingsgrupper. Til bestemmelse af den statistiske signifikans af en ændring i gennemsnitlig tumor volumen for en individuel behandling arm blev en student t-test anvendes. Alle statistiske beregninger blev udført ved hjælp af Prism-software (GraphPad, La Jolla CA) eller SAS statistisk pakke (Cary NC).

Resultater

EphB4 er overudtrykt og har øget Gene Kopier Numre i lungekræft

i parvise analyser af 89 matchede normale og tumor prøver fra patienter med lungecancer, fandt vi EphB4 at være væsentligt overudtrykt i forhold til parrede normale væv i adenocarcinom (n = 41; 4,3-fold betyde forskel), storcellet carcinom (n = 15; 2,9 gange gennemsnitlig forskel), småcellet carcinom (n = 13; 2,4 gange gennemsnitlig forskel), og pladecellecarcinom (n = 10; 2,7-fold gennemsnitlig forskel) undertyper. Samlet blev tumorer sig at udtrykke EphB4 3.2 gange kraftigere end parrede normale væv (figur 1). EphB4 i tilstødende normale lungevæv er vist i figur S5.

A

. Repræsentative immunhistokemi billeder af EphB4 udtryk på tværs af flere lungekræft undertyper. Patologisk scoring er angivet ovenfor kolonner; panel længst til højre er en understøtning af høje effekt afbildning af tilsvarende 3+ billeder udviser subcellulære farvningsmønstre. Bemærk udtalt membranøs farvning i storcellet carcinom.

B

. EphB4 udtryk mønstre i forskellige lungekræft undertyper med race og scene distribution. Enkelte punkter repræsenterer middelværdier ACIS scorer i en enkelt patient for tilsvarende normale væv og tumorvæv. Det samlede antal patienter i hver analyse vises under graferne. Kun patienter med parrede tumor og normalt væv blev inkluderet i analyserne. Vandrette bjælker repræsenterer middelværdier ACIS scorer på tværs af alle patienter i et givet sæt. Race og klinisk fase fordelinger for hver undertype og den samlede sæt vises under hver graf.

Vi bestemt også NSCLC cellelinje udtryk for EphB4 protein via immunoblotanalyse (figur 2A). Seks af otte NSCLC cellelinjer (A549, H358, H522, H1703, H1993, SW1573) udtrykte EphB4 i væsentlig grad, en (H661) viste lav EphB4 udtryk, og én (H2170) manglede EphB4 udtryk. Den EphB4 ligand ephrin-B2 blev udtrykt på et konsekvent lavt niveau i alle testede cellelinier. Ekspression af EphB4 i et panel af otte SCLC-cellelinier blev undersøgt ved immunoblotting (figur 2B) og flowcytometri (figur 2C). Fire SCLC cellelinjer (H82, H249, H446, H2171) udtrykte EphB4 ved immunoblotanalyse, mens H69 og H526 celler ikke udtrykte EphB4. Surface udtryk for EphB4 ved flowcytometrisk analyse stort set valideret resultaterne immunoblot.

A-B

. EphB4 proteinekspression i paneler af NSCLC og SCLC-cellelinier ved immunblotting. Ephrin-B2 ekspression blev også vurderet i NSCLC cellelinjer. BEAS-2B er en immortaliseret, ikke-kræft lungecellelinjen anvendes her som en kontrol; prostata cancer cellelinje PC3 blev inkluderet som en positiv kontrol. B-actin og GAPDH blev brugt som lastning kontrol.

C

. EphB4 ekspression i et panel af SCLC-cellelinier vurderes ved flowcytometri under anvendelse EphB4-specifikt antistof (rød). Normalt muse-IgG blev anvendt som negativ kontrol (blå). EphB4 positivitet udtrykt som procent af de samlede celler er vist til højre for hvert panel.

For at bestemme EphB4 genkopiantallet i vævsprøver, vi gennemførte qPCR-analyse og fandt, at flere væv påviste øget EphB4 gen kopi numre. Six, ni, og 23 procent af adenocarcinom, småcellet karcinom, og pladecellekræft væv henholdsvis viste sig at indeholde mere end tre EphB4 gen kopier, med 14% af pladecellekræft væv der har mere end 10 eksemplarer (figur S6) . Ingen testede cellelinjer blev fundet at påvise genkopiantallet gevinster.

EphB4 Ekspression og prognosticering i Lung Cancer

Et resumé af kliniske karakteristika af patientens væv anvendt i denne undersøgelse er vist i tabel S2. Patient overlevelse var stærkt positivt korreleret med tumor udtryk EphB4, som dem med høj EphB4 udtryk har en median overlevelse tredobbelt længere end dem med lav udtryk (51 måneder versus 17 måneder, p = 0,021; figur 3A). Kaukasiske patienter blev også fundet at udtrykke EphB4 betydeligt stærkere end afroamerikanske patienter (p = 0,019; data ikke vist); dog ikke dette udmønte sig i en forskel i overlevelse stratificeret ved løb (p = 0,92, figur 3B). Der var ingen signifikant sammenhæng mellem EphB4 udtryk og andre patientkarakteristika, såsom køn, rygning status, og alder ved diagnose, enten i den samlede patientpopulation kohorte eller når stratificeret efter lungekræft undertype.

ordinataksen i hver diagram repræsenterer den del af levende patienter.

A

. Overlevelse stratificeret efter EphB4 udtryk. ACIS scorer over og under 500 blev udvalgt til stratifikation baseret på medianen score på den samlede kohorte. Pile repræsenterer median overlevelse (50% levende patienter) i måneder.

B

. Overlevelse stratificeret efter løbet.

EphB4 Modulation Påvirker Cell Growth

in vitro

Lungekræft celler blev kortvarigt transficeret med EphB4-rettet siRNA eller behandlet med sEphB4-HSA i kultur at afgøre, om cellelevedygtighed ville blive påvirket. sEphB4-HSA er et monomert protein fragment omfattende det ekstracellulære domæne af EphB4 og konjugeret til humant serumalbumin, som kan binde ephrin-B2 ligand og derfor antagoniserer EphB4 receptoraktivering gennem afbrydelse af vekselvirkningen mellem EphB4 receptor og ephrin-B2 ligand [35], [36]. I A549-cellelinien, blev levedygtigheden efter udsættelse for sEphB4-HSA reduceres med ca. 17% med den laveste koncentration og med 40% med de højeste koncentrationer af sEphB4-HSA efter 96 timer (figur 4A). I H522 cellelinien blev en lignende virkning ses i den højeste dosis efter 96 timer (~58% reduktion), mens de nedre to koncentrationer oprindeligt nedsat levedygtighed sammenlignet med kontrolceller, men havde en mindre effekt på senere tidspunkter (figur 4A) .

A

.

B

.

C

.

B

.

C

.

B

.

C

.

B

.