PLoS ONE: FOXA1 Fremmer Tumor Progression i prostatakræft via Insulin-lignende vækstfaktor Binding Protein 3 Pathway

Abstrakt

Fork-head box protein A1 (FOXA1) er en “pioner faktor”, der er kendt for at binder til androgen receptor (AR) og regulere transkriptionen af ​​AR-specifikke gener. Men den præcise rolle FOXA1 i prostatacancer (PC) forbliver ukendt. I denne undersøgelse rapporterer vi at FOXA1 spiller en kritisk rolle i PC-celleproliferation. Ekspressionen af ​​FOXA1 var højere i PC end i normale prostatavæv (P = 0,0002), og ved hjælp af immunhistokemisk analyse, fandt vi, at FOXA1 blev lokaliseret i kernen. FOXA1 ekspressionsniveauerne var signifikant korreleret med både PSA og Gleason score (P = 0,016 og P = 0,031, henholdsvis). Desuden FOXA1 opregulering var en væsentlig faktor i PSA svigt (P = 0,011). Udtømning af FOXA1 i en prostatacancer-cellelinie (LNCaP) under anvendelse lille interfererende RNA (siRNA) signifikant inhiberede AR aktivitet, førte til celle-væksthæmning, og induceret G0 /G1 arrest. Den anti-proliferative effekt af FOXA1 siRNA blev medieret gennem insulin-lignende vækstfaktor-bindende protein 3 (IGFBP-3). En stigning i IGFBP-3, medieret af udtømning af FOXA1, inhiberede phosphorylering af MAPK og Akt, og forøget ekspression af cellecyklus regulatorer p21 og p27. Vi fandt også, at den anti-proliferative effekt af FOXA1 depletering blev signifikant vendes ved samtidig siRNA udtømning af IGFBP-3. Disse resultater giver direkte fysiologiske og molekylære beviser for en rolle FOXA1 i at kontrollere celledeling gennem regulering af IGFBP-3 ekspression i PC

Henvisning:. Imamura Y, Sakamoto S, Endo T, Utsumi T, Fuse M , Suyama T, et al. (2012) FOXA1 Fremmer tumorprogression i prostatakræft via insulinlignende vækstfaktor-bindende protein 3 Pathway. PLoS ONE 7 (8): e42456. doi: 10,1371 /journal.pone.0042456

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: 27 Marts 2012; Accepteret: 9 juli 2012; Udgivet: 3. august, 2012 |

Copyright: © Imamura et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling-i-støtte fra Ministeriet for Undervisning, Videnskab, sport og kultur i Japan (nr. 20.390.420, nr. 22.791.469). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PC), den mest almindelige kræftform hos mænd, er en anden førende årsag til kræft dødsfald i de fleste vestlige lande, og er blevet mere almindelig i de asiatiske lande samt [1]. Hormonet androgen og androgen receptor (AR) er essentielle for normal vækst, differentiering og opretholdelse af prostata, og de spiller også en kritisk rolle i udviklingen af ​​PC [2]. Således behandling af avanceret PC indebærer at blokere produktionen af ​​androgener eller antagonisering AR og dets målgener [1]. Men PC tilbagefald efter erhvervelsen af ​​kastration modstand. En nylig undersøgelse viste, at et lavt niveau af intratumoral androgen under androgen ablation terapi fortsætter med at aktivere AR, hvilket fører til yderligere progression af PC i metastase [3]. Selv på et fremskredent stadium af pc, reguleringen af ​​AR aktivitet er vigtig for behandling af pc’en.

Baseret på en tidligere microarray analyse, hvor vi sammenlignede genekspression af benign prostatahyperplasi (BPH) og PC, identificerede vi Fork-head box protein A1 (FOXA1) som en gen, hvis udtryk er markant opreguleret i PC [4]. FOXA1 er en transkriptionsfaktor, der hører til det humane forkhead boksen genfamilien, og FOXA1 er involveret i endodermal organogenese, metabolisme og homeostase [5]. FOXA1 binder direkte til AR og regulerer transskriptionen af ​​prostata-specifikke gener [6]. FOXA1 fungerer også som en “pioner faktor” for AR på steder af transkriptionel regulering [7], [8]. Således binding af FOXA1 til modificeret histon forbundet med aktiv kromatin letter efterfølgende rekruttering af nukleare receptorer og transkriptionel aktivering [7], [8]. Flere linjer af beviser har knyttet FOXA1 med prostata udvikling. Epiteliale FOXA1 udtryk er blevet observeret i alle faser af udvikling og differentiering af musen prostata [6], [9]. Den FOXA1-defecient mus demonstrerede tab af prostata morfogenese og differentiering [9], [10]. FOXA1 bidrager også til østrogen signalering i brystkræft og er blevet forbundet med luminal undertype og god prognose [11], [12]. Øget FOXA1 udtryk er også blevet observeret i tyktarmen, lunge, skjoldbruskkirtel, kræft i spiserøret og prostatakræft [13] – [15].

Selvom FOXA1 forbundet med prostata udvikling og androgen regulering, den præcise mekanisme, hvordan FOXA1 bidrage til PC progression, især regulering af FOXA1-afhængige målgener i PC forblive relativt uidentificeret.

den foreliggende undersøgelse undersøgte rolle FOXA1 i PC progression. Vi identificerede insulin-lignende vækstfaktor bindende protein 3 (IGFBP-3) som en ny målsætning for FOXA1 for reguleringen af ​​celledeling i PC celler.

Resultater

Det Angivelse af FOXA1 i prostata Kræft væv og dets overensstemmelse med kliniske faktorer

Vi undersøgte protein udtryk for FOXA1 i pc ved immunhistokemisk analyse (IHC) af pc prøver. Repræsentative IHC resultater af FOXA1 proteinekspression i normal tilstødende til tumor (NAT) og i PC væv er vist i figur 1A og B. Positiv FOXA1 immunreaktivitet blev påvist i kernen og i en del af cytoplasmaet. En stærk FOXA1 immunreaktion blev påvist i kernerne i celler i kræft læsion, hvorimod celler i NAT viste svag immunfarvning hovedsagelig på cytoplasmaet. IHC snesevis af FOXA1 farvning af NAT og pc-læsioner varierede fra 30,2 til 123,0 (median, 73.3), og fra 20,4 til 260,1 (median, 125,1), hhv. IHC snesevis af FOXA1 farvning af pc-læsioner var signifikant højere end NAT (figur 1C, P = 0,0002). Af IHC score, 62% af pc-prøverne var positive for FOXA1, mens de resterende 38% af prøverne var negative. Korrelationerne mellem de klinisk-patologiske karakteristika patienter med PC og status for FOXA1 proteinekspression under anvendelse af IHC scoringssystem er vist i tabel 1. Disse data viste, at FOXA1-positive pc’er blev korreleret med PSA-værdi (P = 0,016), Gleason score på pc’er (P = 0,031) og ekspressionen af ​​AR (P = 0,002) (tabel 1). Pc’er, der var positive for både FOXA1 og AR havde signifikant højere Gleason score end pc’er, der var både FOXA1- og AR-negative (P = 0,027) (Tabel 2).

Protein udtryk for FOXA1 i repræsentative normal tilstødende til tumor (NAT) væv (A) og PC væv (B), som analyseret ved anvendelse IHC, er vist. NAT viste lav FOXA1 proteinekspression. FOXA1-positive farvning blev observeret i tilfælde af PC. Positive FOXA1 immunfarvning blev påvist i kernen. Original forstørrelse, × 400. (C) Kvantificering af FOXA1 farvning af NAT og PC væv. De FOXA1 IHC score blev beregnet som følger: IHC score = 1 × (antal svagt farvede celler på området) + 2 x (antal moderat farvede celler i marken) + 3 × (antal intenst farvede celler i felten) . De FOXA1 IHC score for normale prostata væv og til pc’er varierede fra 30,2 til 123,0 (median, 73.3) og fra 20,4 til 260,1 (median, 125,1), hhv. Opreguleret FOXA1 udtryk (D) var signifikant associeret med PSA svigt (P = 0,011), men opreguleret AR udtryk (E) var ikke (P = 0,4457). Log-rank statistik blev anvendt til at teste forskellen i overlevelsestider mellem grupperne. FOXA1 (+), opreguleret FOXA1; FOXA1 (-), nedreguleret FOXA1. AR (+), opreguleret AR; AR (-), nedreguleret AR. ** Angiver en statistisk forskel på P. 0,01 Vejviser

Survival analyse ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden viste, at FOXA1 opregulering var en væsentlig faktor i PSA fiasko (Figur 1D ; log-rank test, P = 0,011) sammenlignet med AR opregulering (figur 1E, log-rank test, P = 0,4457). De PSA fiasko overlevelsesrater af sager med opreguleret og nedreguleret FOXA1 var 50,7 og 87,7%, hhv. De PSA fiasko overlevelsesrater i sager med opreguleret og nedreguleret AR var 58,5 og 73,8%, hhv.

Evaluering af FOXA1 Protein Expression i PC-afledte cellelinier

Vi næste undersøgt FOXA1 mRNA og proteinekspression i PC ved kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (QRT-PCR) analyse og Western blotting henholdsvis fire PC-afledte cellelinjer, herunder androgen uafhængig cellelinie (PC-3 og DU 145), androgen følsomme celle line (LNCaP), androgen-ufølsom cellelinie (c4-2) etableret fra kastrerede masse LNCaP og ikke-tumorigene prostata-cellelinien (RWPE-1) [16] – [19] (figur 2A). Molekylvægten af ​​FOXA1 ved Western blotting var 49 kDa. Både FOXA1 mRNA og proteinekspression var signifikant højere i androgen-sensitive LNCaP-celler og c4-2 celler end i de andre cellelinjer.

(A) mRNA-ekspression og proteinekspression af FOXA1 i fire PC afledte cellelinier (PC-3, DU-145, LNCaP, c4-2) og i ikke-tumorigen prostata-cellelinien (RWPE-1) blev analyseret under anvendelse QRT-PCR og Western blotting hhv. (B) LNCaP-celler blev transficeret med en negativ kontrol siRNA (Nega) eller med en af ​​tre forskellige FOXA1 siRNA’er (siFOXA1 # 1-3). Efter 48 timer transfektion blev RNA ekstraheret og FOXA1 mRNA blev analyseret ved anvendelse QRT-PCR-analyse. FOXA1 mRNA-ekspression udtrykkes i forhold til GAPDH mRNA-ekspression i den samme celle. De viste resultater er gennemsnit ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg. Proteiner blev ekstraheret 72 timer efter transfektion og FOXA1 og GAPDH-proteinekspression blev undersøgt ved Western blot-analyser. (C, D) LNCaP-celler blev transficeret med pGL3-alarmcentral 5.8 luciferasereporterplasmid og med en af ​​tre forskellige FOXA1 siRNAs. (# 1-3) og blev derefter dyrket i Phenolrødt-frit RPMI-1640 medium indeholdende 5% CS-FBS. (C) Efter 72 timer transfektion blev luciferaseaktiviteter målt ved anvendelse af Dual-luciferase reporter analysesystem. Luciferaseaktiviteter udtrykkes i forhold til kontrollen, som blev tildelt en værdi på 1. Proteiner blev ekstraheret 72 timer efter transfektion og ekspression af AR og GAPDH blev undersøgt ved Western blot-analyse. (D) De transficerede celler blev inkuberet med de angivne koncentrationer af dihydrotestosteron i 72 timer, og luciferaseaktiviteter blev målt som i (C). (E, F) ikke-transficerede LNCaP-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af dihydrotestosteron (E) eller bicalutamid (F) i 48 timer og FOXA1 mRNA-ekspression blev derefter analyseret ved anvendelse QRT-PCR. FOXA1 mRNA-ekspression udtrykkes i forhold til GAPDH mRNA-ekspression i den samme celle. De viste værdier er gennemsnit ± SD fra mindst 3 uafhængige forsøg, hver udført in triplo. * Og ** angiver statistisk forskel på P 0,05 og P. 0,01, henholdsvis

For at opnå celler, hvor FOXA1 udtryk blev forbigående slået ned, vi transficeret LNCaP celler med en af ​​tre forskellige FOXA1 siRNAs (siFOXA1 # 1-3) plasmider eller med en negativ kontrol siRNA (Nega) plasmid. Vi analyserede derefter FOXA1 mRNA og proteinekspression i disse siFOXA1-transficerede celler ved anvendelse QRT-PCR og Western blot-analyser, hhv. SiFOXA1-transficerede celler viser reduktion af FOXA1 mRNA-niveau med næsten 90% sammenlignet med den i nega-transficerede celler (Nega). FOXA1 protein niveauer i siFOXA1-transficerede celler var også stærkt faldt sammenlignet med nega-transficerede celler (Figur 2B).

Effekten af ​​FOXA1 på Androgen receptor aktivitet og Effekt af AR Aktivering på FOXA1 Expression

for at bestemme virkningen af ​​FOXA1 knockdown på AR-aktivitet, transficerede vi de siFOXA1-transficerede LNCaP-celler med en luciferase ekspressionsplasmid drevet af prostata-specifikt antigen (PSA) promoter, pGL3PSAp-5.8. Selv om der var nogen forskel i proteinet ekspression af AR i siFOXA1-transficerede celler eller i nega-transficerede celler, viste siFOXA1-transficerede celler næsten 80% reduktion af PSA-promotoraktivitet sammenligne med den for nega-transficerede celler (figur 2C). Når kontrol LNCaP-celler, der kun var transficeret med pGL3PSAp-5.8 blev behandlet med AR ligand dihydrotestosteron (DHT), blev PSA promotoraktivitet øges på en dosis-afhængig måde. Imidlertid co-transfektion af disse celler med siFOXA1 signifikant reduceret PSA promotoraktivitet efter behandling med forskellige koncentrationer af DHT (figur 2D). At se på indflydelsen af ​​FOXA1depletion om endogen PSA udtryk, som FOXA1 handlinger at omforme kromatin, vi analyserede PSA mRNA-ekspression i siFOXA1-transficerede celler ved hjælp af QRT-PCR. Figur S1A viser, at FOXA1 udtømning medieret signifikant reduktion af PSA mRNA-niveau sammenlignet med den i nega-transficerede celler.

For at bestemme om FOXA1 mRNA-ekspression medieres af AR-aktivitet, testede vi virkningen af ​​behandling af LNCaP-celler med DHT og eller med AR antagonist bicalutamid på FOXA1 mRNA-ekspression. QRT-PCR-analyse viste, at der ikke var nogen forskel i mRNA-ekspression af FOXA1 i androgen-sensitive LNCaP-celler efter vækst i medium indeholdende DHT eller i medium indeholdende bicalutamid (figur 2E og F). Disse resultater viste, at FOXA1 medierer aktivering af AR dog udtryk for sig selv FOXA1 er ikke reguleret af androgen.

FOXA1 Regulerer Cell Proliferation i PC Celler

For at undersøge effekten af ​​FOXA1 knockdown på celle proliferation, blev cellevæksten af ​​siFOXA1-transficerede LNCaP-celler monitoreret over 4 dage. De siFOXA1-transficerede celler viste et signifikant fald i cellulær vækst i forhold til nega-transficerede celler (figur 3A). På den anden side, FOXA1 overudtrykker celler forøget cellevækst signifikant sammenlignet med nega-transficerede celler (figur S1c). For at undersøge effekten af ​​FOXA1 i cellecyklusprogression, analyserede vi cellecyklussen stadier af siFOXA1-transficerede celler under anvendelse af flowcytometrisk analyse. Procentdelen af ​​siFOXA1-transficerede celler i G0 /G1-fasen var højere end for nega-transficerede celler (figur 3B), hvilket antyder, at nedregulering af FOXA1 inhiberede cellulær proliferation ved induktion af G0 /G1 arrest.

(a) LNCaP-celler blev transficeret med en negativ kontrol siRNA (Nega) eller med en af ​​tre forskellige FOXA1 siRNA’er (# 1- # 3), og blev derefter podet i en 24-brønds kulturplade. Celleproliferation blev derefter analyseret over 4 dage ved at tælle antallet af celler for hver transfektion tilstand, som angivet. (B) Den celle-cyklus fase af cellerne blev analyseret ved anvendelse af propidiumiodid-farvning og FACS-analyse 24 timer efter siRNA transfektion og procentdelen af ​​celler i hver transficerede population, der var i hver cyklus fase blev beregnet. (C) LNCaP-celler blev transficeret med en negativ kontrol siRNA (Nega) eller med en af ​​tre forskellige FOXA1 siRNA’er (siFOXA1 # 1-3). Efter 48 timers transfektion IGFBP-3-mRNA-ekspression blev analyseret ved QRT-PCR. IGFBP-3-mRNA-ekspression udtrykkes i forhold til GAPDH mRNA-ekspression i den samme celle. (D) LNCaP-celler blev transficeret med en negativ kontrol siRNA (Nega) eller med en af ​​tre forskellige FOXA1 siRNA’er (siFOXA1 # 1-3). Efter 72 timers transfektion blev IGFBP-3 mediekoncentration analyseret ved ELISA’er. (E) Proteiner blev ekstraheret 72 timer efter transfektion og ekspression af IGFBP3, den insulin-receptoren signalering beslægtede proteiner (totale mængde af MAPK, phospho-MAPK, totale mængde af Akt og phospho-Akt), af G0 /G1 arrest- relaterede cellecyklusregulerende proteiner (p21cip1, p27KIP1) og af GAPDH blev undersøgt ved Western blot-analyse. molekylvægte protein angivet ved højre side af panelet. Disse resultater er middelværdierne ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg. ** Angiver en statistisk forskel på P. 0,01

Udtømning af FOXA1 Regulerer IGFBP-3 og IGF Signaling

For at få et indblik i gener, der opreguleret ved FOXA1 udtømning af PC celler, udførte vi genekspression microarray analyse af celler udtømt for FOXA1 (tabel 3 og 4). Vi identificerede 421 gener, der blev stærkere udtrykt i FOXA1-udtømte celler end i de negative kontroltransfektanter. Gruppering af de up-regulerede gener i funktionelle kategorier viste, at den højeste andel af up-regulerede gener var relateret til celleproliferation, efterfulgt af reaktion på såret, muskel system processer, forsvar reaktioner, inflammatoriske reaktioner, negative regulering af celledeling, respons på hypoxi og cellemodning (tabel 3). UP-regulerede gener der er relateret til negativ regulering af celleproliferation, er anført i tabel 4. Af disse op-regulerede gener, vi yderligere undersøgt insulin-lignende vækstfaktor-bindende protein 3 (IGFBP-3), idet dette gen er et godt -Etableret tumor-undertrykkende gen i PC [20] – [23]

for at bekræfte opregulering af IGFBP-3 i LNCaP celler ved FOXA1 udtynding, der blev angivet af microarray. data, analyserede vi IGFBP-3-mRNA og proteinekspression i LNCaP-celler transficeret med siFOXA1 plasmider eller med den negative kontrol siRNA plasmid, under anvendelse QRT-PCR og Western blot-analyser, hhv. Figur 3C viser, at IGFBP-3 mRNA-ekspression i siFOXA1-transficerede celler var signifikant højere end den nega-transficerede celler. IGFBP-3 protein niveauer i siFOXA1-transfekterede celler blev også kraftigt forøget i forhold til niveauet i nega-transficerede celler (figur 3E). Desuden at vurdere ændringer i niveauerne af sekreteret IGFBP-3, udførte vi ELISA’er. Figur 3D viser, at IGFBP-3 koncentration i medierne af siFOXA1-transficerede celler også var stærkt forøget (mere end 30 gange) sammenlignet med den for nega-transficerede celler. Eftersom IGFBP-3 modulerer IGF-1-signalering, Derefter undersøgte vi, hvis FOXA1 regulering af IGFBP-3-ekspression blev associeret med modulering af ekspressionsniveauet eller aktiveringsstatus af IGF-1 downstream signaler i disse celler (Figur 3E). Western blot-analyse indikerede markeret opregulering af IGFBP-3, nedregulering af phosphoryleringen af ​​MAPK og Akt, og opregulering af proteinet ekspression af cyclinafhængige kinaseinhibitorer (p21cip1, p27KIP1) i siFOXA1-transficerede celler sammenlignet med nega-transficerede celler (figur 3e). Endvidere FOXA1 udtømning signifikant blokeret aktiveringen af ​​AKT som reaktion på IGF-1 behandling i LNCaP (fig S1E). Disse resultater viste, at FOXA1 regulering af IGFBP-3 ledsages af regulering af IGF-1 downstream signaler.

For at bestemme betydningen af ​​IGFBP-3 for FOXA1 regulering af PC proliferation, sammenlignede vi væksten af ​​siFOXA1 transficerede LNCaP-celler, og at af siIGFBP-3-transficerede celler. IGFBP-3 blev transient slået ned ved transfektion af LNCaP-celler med IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3) plasmid og IGFBP-3 mRNA og proteinekspression i de siIGFBP-3-transficerede celler blev vurderet ved anvendelse QRT-PCR og Western blot-analyse , henholdsvis. Figur 4A viser, at IGFBP-3 mRNA og proteinekspression i de siIGFBP-3-transficerede celler var signifikant lavere end i de nega-transficerede celler. Selvom siFOXA1-transficerede celler viste et signifikant fald i cellulær vækst i forhold til nega-transficerede celler (figur 3A og 4B), blev anti-proliferative effekt af siFOXA1 vendes ved dobbelt transfektion af siFOXA1 og siIGFBP-3 (figur 4B). Dette resultat indikerede, at FOXA1 regulerer celleproliferation i et IGFBP-3-afhængig måde.

(A) LNCaP-celler blev transficeret med en negativ kontrol siRNA (Nega) eller med et IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3) og, 48 timer senere, IGFBP-3 mRNA og protein niveauer blev analyseret ved anvendelse QRT-PCR og Western blot-analyse. IGFBP-3-mRNA-ekspression udtrykkes i forhold til GAPDH mRNA-ekspression i den samme celle. (B) LNCaP-celler blev transficeret med en negativ kontrol siRNA (Nega) eller med en af ​​tre FOXA1 siRNA’er (siFOXA1 # 1- # 3) og /eller et IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3), og blev podet i en 24 brønds dyrkningsplade. Celleproliferation blev målt over 4 dage, og antallet af celler for hver transficeret population er indiceret. (C, D) LNCaP-celler blev transficeret med en negativ kontrol siRNA (Nega) eller med en AR siRNA (si AR) og /eller en FOXA1 siRNA (si FOXA1 # 1) og, 48 timer efter transfektion, AR mRNA og protein ( C) eller IGFBP-3 mRNA-niveauer (D) blev analyseret ved anvendelse QRT-PCR og /eller Western blot-analyse. MRNA-niveauerne er udtrykt i forhold til GAPDH mRNA-ekspression i den samme celle. De viste resultater er gennemsnit ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg. ** Angiver statistisk forskel på P. 0,01

Da aktivering af AR er blevet rapporteret at nedregulere IGFBP-3 udtryk [24], vi yderligere undersøgte effekten af ​​AR på FOXA1 medieret regulering af IGFBP-3 under anvendelse Siar-transficerede celler (figur 4C og 4D). Udtømning af AR gjorde øge IGFBP-3 mRNA-ekspression (2,8 gange). Stigningen i IGFBP-3-ekspression observeret i siFOXA1-transficerede celler var meget højere (16,4 gange) end den, Siar-transficerede celler. Desuden samtidig udtømning af AR og FOXA1 resulterede i en yderligere stigning i IGFBP-3-ekspression (24,0 gange) sammenlignet med udtømning af FOXA1 alene, hvilket antyder, at FOXA1 og AR samvirkende regulere IGFBP-3-ekspression (figur 4D).

rolle FOXA1 på kastrationsresistent prostatakræft (CRPC) modeller

Vi vurderede rolle FOXA1 på androgen-uafhængig prostatacancer hjælp c4-2 celler, der er etableret fra kastrerede væld af LNCaP celler. Udtømning af FOXA1 signifikant inhiberede cellevækst af c4-2 celler selv ved den lave androgen miljø (5% trækul filtreret FCS) sammenligne med nega-transficerede celler (figur 5A). Overexpresssion af FOXA1 i c4-2 celler fremmes signifikant cellevækst (figur S1D). Når kontrol c4-2 celler blev behandlet med lave doser af DHT (1-100 pM), PSA promotor-aktivitet var opreguleret i en DHT koncentration på 100 pM. Imidlertid transfektion af FOXA1 siRNA blokeret opregulering af PSA promotoraktivitet, der opstod som reaktion på DHT behandling ved 100 pM i c4-2 celler (figur 5B). Tilsvarende udtømning af FOXA1 inhiberede signifikant PSA mRNA-ekspression i QRT-PCR (figur S1B). Vi analyserede også IGFBP-3-mRNA-ekspression i c4-2 celler transficeret med siFOXA1 plasmider eller med den negative kontrol, ved anvendelse QRT-PCR. Figur 5C viser, at IGFBP-3 mRNA-ekspression i siFOXA1-transficerede celler var signifikant højere end den nega-transficerede celler. Figur 5D viser, at IGFBP-3-koncentration i medierne af siFOXA1-transfekterede celler også var stærkt forhøjet (over 40 gange) i forhold til niveauet i nega-transficerede celler. siFOXA1 signifikant inhiberede phosphorylering af Akt efter stimulering med IGF-1 i c4-2 svarende til den i LNCaP-celler celler, hvilket indikerer negativ regulering af IGF-1-signalering ved FOXA1 depletion (Fig S1F).

(A) C4 -2 celler blev transficeret med en negativ kontrol siRNA (Nega) eller med en af ​​tre FOXA1 siRNA’er (# 1- # 3) og blev derefter podet i en 24-brønds kulturplade med Phenolrødt-frit RPMI-1640 medium indeholdende 5% CS-FBS. Celleproliferation blev derefter målt i løbet af 4 dage og er vist som antallet af celler for hver transficeret population. (B) c4-2-celler blev transficeret med pGL3-alarmcentral 5.8 luciferase reporter og med en FOXA1 siRNA (# 1) og blev dyrket i Phenolrødt-frit RPMI-1640 medium indeholdende 5% CS-FBS med de angivne koncentrationer af dihydrotestosteron (1-100 pM). Efter 72 timer transfektion blev luciferaseaktivitet målt ved hjælp af den dobbelt-luciferase reporter analysesystem. (C) c4-2 celler blev transficeret med en negativ kontrol siRNA (Nega) eller med en af ​​tre forskellige FOXA1 siRNA’er (siFOXA1 # 1-3). Efter 48 timers transfektion IGFBP-3-mRNA-ekspression blev analyseret ved QRT-PCR. IGFBP-3-mRNA-ekspression udtrykkes i forhold til GAPDH mRNA-ekspression i den samme celle. (D) c4-2 celler blev transficeret med en negativ kontrol siRNA (Nega) eller med en af ​​tre forskellige FOXA1 siRNA’er (siFOXA1 # 1-3). Efter 72 timers transfektion blev IGFBP-3 mediekoncentration analyseret ved ELISA’er. De viste resultater er gennemsnit ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg. * Og ** angiver statistisk forskel på P 0,05 og P. 0,01, henholdsvis

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse undersøgte rolle FOXA1 i PC progression. Vi identificerede tumor suppressor IGFBP-3 som en ny mål for FOXA1, og viste, at FOXA1 målretning af IGFBP-3 spiller en vigtig rolle ved regulering af PC-celleproliferation.

IGFBP-3 er blevet kendt for at fungere som en tumorsuppressor eller et cellecyklus inhibitor i PC celler [21], [24]. Øget IGFBP-3-ekspression på FOXA1 udtømning inhiberede phosphoryleringen af ​​MAPK og Akt og medieret cellecyklusstop gennem øget ekspression af cellecyklus regulatorer p21 og p27 i PC celler. FOXA1 er for nylig blevet rapporteret at regulere cellecyklus og celleproliferation i LNCaP-celler [15]. Vore data viser, at IGFBP-3 kan være en primær regulator af FOXA1-afhængig celleproliferation i LNCaP-celler. Baseret på vores resultater, ikke kun AR men også IGFBP-3 kan være en nøglefaktor i FOXA1 medieret signalering i PC.

FOXA1 er en transskription faktor, der modulerer funktionen af ​​steroidhormonreceptorer. I prostata, FOXA1 interagerer med AR og styrer androgen induceret aktivering af prostata-specifikke gener [6]. For nylig, AR og tilstødende FOXA1 bindingssteder er findes på flere promotorer i prostataceller [7], [25]. Svarende til funktionen af ​​AR, FOXA1 ekspression er nødvendig for normal udvikling og for androgen regulering af PC [26]. Øget udtryk for FOXA1 er blevet observeret i alle faser af prostata udvikling i en musemodel [27]. Vi fandt, at FOXA1 blev overudtrykt i kerner af PC celler, og at denne overekspression var forbundet med øget PSA, Gleason Scores og AR-ekspression. Endvidere overekspressionen af ​​FOXA1 var en væsentlig faktor i PSA fiasko. De resultat er i overensstemmelse med foregående rapport indikerer, at FOXA1 farvningsintensitet var betydeligt svagere i den tilstødende ikke-kræft end kræft væv [28], og at stærke FOXA1 farvning forbundet med dårlig prognose, højere pT stadier og øget Gleason Grade [15], [28 ]. Et højt FOXA1 er tidligere fundet i 89% af metastatisk PC og ekspressionen af ​​FOXA1 var positivt korreleret med tumorstørrelse, extraprostatic invasion, AR og lymfeknude invasion [29]. FOXA1 bidrager til androgen-afhængige vækst af PC [30]. FOXA1 spiller også en væsentlig rolle i ekspressionen af ​​ubiquitin-konjugerende enzym E2C (UBE2C), et gen, der inaktiverer M-fase-checkpoint, og UBE2C er overudtrykt i androgen-uafhængige PC cellelinier og kliniske tilfælde [31]. Genome-wide forbindelsesundersøgelser indikerede tilstedeværelsen af ​​en enkelt-nukleotid polymorfisme (rs119986220) i FOXA1 bindingssted inden 8q24 alleler, der er forbundet med PC risiko [25]. Den kombinerede beviser understøtter sammenhængen mellem FOXA1 og tumor progression i PC.

Gennem genekspression analyse, identificerede vi IGFBP-3 som et nedstrøms mål for FOXA1. IGFBP-3 er et insulin-lignende vækstfaktor bindende protein, hvis primære funktion er associeret med IGF levering og tilgængelighed [32]. IGFBP-3 har en større affinitet for IGF-1 end IGF-1-receptoren og blokerer IGF-1 medieret vej. IGFBP-3 kan derfor reducere IGF-1 biotilgængelighed og inhiberer IGF-1 interaktion med IGF-1-receptoren, og fungerer derved som en tumorsuppressor [21], [24]. En IGF-uafhængig rolle af IGFBP-3 har også for nylig blevet identificeret. IGFBP-3 binder til den transformerende vækstfaktor-β type V receptoren og derved inhiberer cellevækst uafhængigt af dens virkninger på IGF [20], [33]. Induktion af apoptose gennem synergistisk vekselvirkning af IGFBP-3 med en nuklear receptor, såsom retinoid X receptor (RXR) -alfa er også blevet observeret i PC celler [24], [34]. Vores resultat også angivet, at øget ekspression af IGFBP-3 ved udtømning af FOXA1 signifikant inhiberede PC proliferation i androgen-sensitive LNCaP-celler, mest sandsynligt gennem IGF-1-signalering pathway. Øget IGFBP-3 ved FOXA1 udtømning inhiberede phosphorylering af signalering mediatorer i IGF-1-signalering pathway herunder MAPK og Akt, og medieret cellecyklusstop gennem p21 og p27 i PC celler. Sidstnævnte resultater er i overensstemmelse med en tidligere rapport, at FOXA1 var opreguleret i en kræft i skjoldbruskkirtlen læsion og at udtømning af FOXA1 induceret cellecyklusstop og en reduktion i celledeling via en p27-afhængig mekanisme [14].

Erhvervelse af androgen modstand i PC, som betegnes kastration modstand, er et stort problem, der begrænser patientens livskvalitet såvel som den forventede levetid. Selv om der er foreslået en række mekanismer til at forklare udviklingen af ​​kastrationsresistent PC (CRPC), synes stadig den vigtigste pathway af denne resistens at inddrage AR, selv under antiandrogen terapi. Amplifikation af AR, mutation af AR, overekspression af AR coaktivatorer eller deregulering af vækstfaktorer /cytokiner kan alle forekomme i CRPC og fremkalde en ændring i respons på AR-antagonister. En anden mekanisme CRPC er gennem flugt fra apoptose på grund af tabet af det tumor-undertrykkende gen PTEN og suppression af anti-apoptotiske gen bcl-2 [35]. En anden kendt årsag til CRPC er, at AR kan aktiveres i humane PC celler i fravær af androgener med IL-6 [36], [37]. Eksistensen af ​​så mange komplekse veje er forbundet med reguleringen af ​​AR aktivering gør det svært at styre væksten af ​​CRPC. Baseret på vores data, kan målretning af FOXA1 give en praktisk tilgang til nedregulering af AR aktivitet i CRPC. Udtømning af FOXA1 betydeligt nedreguleret ligand-afhængig AR aktivering (op til 80%) i LNCaP-celler og c4-2 celler. Desuden, udtømning af FOXA1 opreguleret IGFBP-3-ekspression og inhiberede IGF-1-signalering, hvilket er en stor vej for ligand-uafhængig aktivering af AR [38]. Men en anden linje af beviser angivne dobbelte rolle FOXA1. Selvom FOXA1 fungerer som en pioner faktor fremme AR og kromatin interaktion, det skaber også co-repressorkomplekset komplekser hæmmer AR og kromatin binding. Således FOXA1 udtynding resulterer i fremkomsten af ​​et stort antal nye ARB’er, som er forbundet med androgen regulering af nærliggende gener [28], [39]. Da FOXA1 medieret regulering af AR ikke er fuldt karakteriseret, vil yderligere analyse afslører den terapeutiske betydning af FOXA1 i CRPC.

Som det næste skridt i fastlæggelsen af ​​FOXA1 funktion, vi i øjeblikket studerer de præcise mekanismer, som FOXA1 regulerer IGFBP-3-ekspression. 2+, moderat; af tre uafhængige forsøg.