PLoS ONE: Differential Angivelse af MikroRNA’er i tumorer fra kronisk betændt eller genetiske (APCMin /+) modeller af Colon Cancer

Abstrakt

Baggrund

Kronisk betændelse forbundet med colitis ulcerosa disponerer individer til øget tyktarmskræft risiko. Formålet med disse undersøgelser var at identificere microRNA, der er afvigende reguleret under inflammation og kan deltage i transformation af colon epitelceller i den inflammatoriske indstilling.

Metode /vigtigste resultater

Vi har brug kvantitativ PCR arrays til at sammenligne microRNA (miRNA) udtryk i tumorer og kontrollere colon epitelceller isoleret fra distale koloner af kronisk betændte mus og APC

Min /+ mus. Rangorden statistik blev anvendt til at identificere differentielt regulerede miRNA i tumorer, der opstod som følge af kronisk inflammation og /eller at kimcellelinje-APC mutationen. Otte højt prioriterede miRNA blev identificeret: miR-215, miR-137, miR-708, miR-31, og miR-135b blev udtrykkes forskelligt i APC tumorer og miR-215, miR-133a, miR-467d, miR-218, mIR-708, mIR-31, og mIR-135b i colitis-associerede tumorer. Fire af disse (miR-215, miR-708, miR-31, og miR-135b) var fælles for begge tumorer typer, og dysregulering af disse miRNA blev bekræftet i en uafhængig prøve sæt. Target forudsigelse og sti analyse tyder på, at disse microRNA’er, i den samlede, regulere signalveje relateret til MAPK, PI3K, WNT, og TGF-β, som alle er kendt for at være involveret i transformation.

Konklusioner /Betydning

Vi konkluderer, at disse fire miRNA er dysreguleret på nogle meget tidligt tidspunkt i transformation af colon epitelceller. Dette svar er ikke afhængig af den mekanisme om indledning af transformation (betændelse versus germlinie mutation), hvilket tyder på, at de miRNA, som vi har identificeret, er tilbøjelige til at regulere kritiske signalveje der er centrale for tidlige begivenheder i transformation af colon epitelceller.

Henvisning: Necela BM, Carr JM, Asmann YW, Thompson EA (2011) Differentiel ekspression af MikroRNA’er i tumorer fra kronisk betændt eller Genetic (APC

Min /+) modeller af tyktarmskræft. PLoS ONE 6 (4): e18501. doi: 10,1371 /journal.pone.0018501

Redaktør: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de kræft, Brasilien

Modtaget: 31 januar 2011; Accepteret: 1 mar 2011; Udgivet: 12 April, 2011

Copyright: © 2011 Necela et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret delvist af en CCFA Career Development Award til BMN. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion Salg

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små ikke-kodende RNA’er af 19 til 22 nukleotider er impliceret i en række vigtige cellulære processer, såsom udvikling, differentiering, proliferation, cellecyklusprogression, apoptose, inflammation og stress reaktioner [ ,,,0],1] – [8]. MikroRNA’er menes generelt at fungere ved at binde 3’UTR af target mRNA og enten inhibere translation eller i nogle tilfælde inducerer mRNA-nedbrydning [3], [9]. Bioinformatiske undersøgelser antyder, at miRNA kan regulere en tredjedel af transkriptomet [10], [11]. I betragtning af deres tilbøjelighed til at regulere en lang række processer og målgener, er det ingen overraskelse, at afvigende ekspression af miRNA er blevet forbundet med adskillige patologiske tilstande, såsom astma, diabetes, nyre, neurodegenerative, og kardiovaskulær sygdom. Især har differentieret miRNA udtryk været impliceret i mange kræftformer, herunder bryst-, skjoldbruskkirtel, lunge, bugspytkirtel, og tyktarmskræft.

Til dato, over et dusin undersøgelser har rapporteret en sammenslutning af afvigende miRNA-ekspression i tyktarmskræft [ ,,,0],12] – [31]. Angivelse af miRNA i kolon tumorer kan påvirkes af mange clinicopathologic variabler såsom tumor kvalitet og beliggenhed, mutation status (p53, APC, MSI) [32] – [36], og cellulære indhold (

dvs.

inflammatoriske celler ) såvel som præ-analytiske og analytiske variabler såsom udvinding metode, fiksering, og valg af analytisk platform (sekvens, qPCR, eller microarray). Som et resultat af disse variabler, der ikke er enighed med hensyn til hvilke miRNA udtrykkes forskelligt i colontumorer. Ikke desto mindre har et par microRNA’er konsekvent opstået som værende dysreguleret i tyktarmskræft. Blandt disse er miR-31 konsekvent opreguleret [12] – [17], [20], [22], [23], [25] og microRNA klynger miR-143 /-145 [18], [21] – [ ,,,0],23], [37] – [40] og miR-194 /-215 [18], [21] – [23], [37], [38], [41] nedreguleret i tyktarmskræft. MicroRNA -31 er blevet forbundet med cellemigrering og invasion i colon cancerceller [42], [43]. MikroRNA’er -192 og -215 inhibere celleproliferation og inducere standsning af cellecyklus i en p53-afhængig måde [37], [44], [45]. Ligeledes miR-143 og miR-145 hæmme cellevækst, med denne handling, delvist tilskrives gennem hæmning af målgener såsom DNMT3A, IRS-1, Ja1, STAT1, og FLI1 [21], [46] – [ ,,,0],50].

Et klinisk variabel, der ikke er blevet behandlet tilstrækkeligt, er den inflammatoriske tilstand i tyktarmen tumor. En direkte sammenhæng mellem betændelse og kræft er blevet fast etableret, med NFKB fremstår som en central aktør [51], [52]. Inflammation menes ikke blot at ændre og fremme tumormikromiljøet, men selv, kan føre direkte til tumorigenese. Patienter med colitis ulcerosa, en kronisk, recidiverende inflammation i tyktarmen, har øget risiko for at udvikle coloncancer. En nylig meta-analyse afslørede sandsynligheder for tyktarmskræft i ulcerativ colitis på 2% efter 10 år, 8% efter 20 år, og 18% efter 30 års sygdom [53]. En mulig mekanisme, hvormed inflammatoriske veje kan påvirke transformation er gennem deregulering af miRNA. Stigende tegn tyder på, at miRNA kan regulere inflammatoriske processer og dysreguleret i forskellige inflammatoriske sygdomme [54]. For nylig, dysregulering af microRNA er blevet observeret hos patienter med colitis ulcerosa [55], [56]. Men lidt om den funktionelle konsekvens af dysregulering af miRNA ved kronisk colitis i epitelceller, og endnu mindre på tumorigenese. Selvom begrænset, har disse undersøgelser giver den precident at deregulering af en delmængde af microRNA under kronisk colitis kan være forbundet med neoplastisk og metaplastisk metaplastisk transformation. Til dette formål kan microRNA være nyttige biomarkører til at forudsige risiko for malignitet hos patienter med langvarig aktiv sygdom.

De nedenfor beskrevne blev foretaget undersøgelser for at begynde at teste den hypotese, at en delmængde af microRNA er dysreguleret i tarmepitelet under colitis og bidrager til carcinogenese. Vi målte miRNA ved kvantitativ PCR med lav massefylde TaqMan arrays anvendelse af RNA ekstraheret fra colon epitelceller fra mus induceret med akut dextransulfat colitis (AC), kronisk colitis (CC), colitis-associerede colontumorer (CAC), og colontumorer i APC

Min /+ mus. Vi identificerede differentieret udtryk for miRNA fælles og unikke på hver sygdomstilstand. Især vi vise, at en delmængde af miRNA er dysreguleret i begge tumorer i både inflammatoriske og genetiske oprindelse. Disse miRNA har potentiale til at styre både anti-onkogene og pro-onkogene transkriptionelle netværk, og derved påvirke tumorigen resultat.

Resultater

Sammenligning af analytiske modeller ved hjælp akut colitis (AC) prøver

Kvantificering af miRNA udtryk i vævsprøver kompliceres af det faktum, at man ikke har nogen indlysende direkte middel til at identificere relevante endogene kontrol, der kan anvendes til at normalisere udtryk data og korrigere for forskelle i mængden af ​​RNA analyseres eller effektiviteten af ​​miRNA ekstraktion eller cDNA konvertering i prøver fra forskellige væv. Dette potentielle problem er særlig akut i undersøgelserne som dem, der vil blive beskrevet nedenfor, hvor vi forpligter sig til at sammenligne miRNA overflod i væv, der stammer fra mus i forskellige aldre, diæter, inflammatorisk status og tumor byrde. Vi gennemførte derfor ud et pilotforsøg for at sammenligne forskellige analytiske værktøjer og statistiske modeller til at identificere forskelligt regulerede miRNA i colon epitelceller. Til dette formål ekstraheret vi miRNA fra epiteliale cellepræparater fra distale koloner af kontrol C57BL /6J-mus og mus, der var blevet eksponeret for 3,5% DSS i drikkevand i fire dage. Histologisk kolon fra kontrol- og DSS-behandlede mus ikke skelnes, uden tegn på barriere opdeling, krypt tab, eller invasion af immunceller. Selv om disse væv formelt repræsenterer en pre-betændt tilstand, vil prøverne blive betegnet AC (akut colitis) i at følge diskussionen, mens kontrollerne vil blive identificeret som Con.

Vi brugte AB TaqMan arrays til at måle overflod af 384 miRNA i AC og Con prøver, udtrykt som kritiske tærskler (Ct) for hver miRNA detektor. Tre analytiske tilgange blev sammenlignet. Den enkleste af disse var rangorden statistikker. Hver miRNA inden for en given prøve kraft rangeret på analog udlæsning af miRNA overflod (Ct-værdi). Detektorer, der blev scoret som “målbart” blev tildelt Ct-værdier på 40, og alle miRNA med Ct = 40 blev tildelt samme rang i en prøve. En t-test (forudsat ulige varians) blev derefter udført for at sammenligne rangordenen opgaver af miRNA i de to forskellige sample grupper for at identificere miRNA hvis gennemsnitlige rangorden udtryk ændret sig betydeligt som følge af behandlingen. Den anden analytiske metode involverede en simpel median normalisering af prøverne, efterfulgt af en t-test (forudsat ulige varians) at sammenligne Ct-værdier mellem Con og AC prøver. Differential udtryk udtrykkes som ACt (forkortet DCT), som repræsenterer (meanCtMed_Norm_AC) – (meanCtMed_Norm_Con). Den tredje metode anvendes den Integromics Statminer pakke, som bruger en Limma-baseret empirisk Bayes gennemførelse at beregne en hyperparamter som igen anvendes til at modulere varians og øge frihedsgraderne tværs prøverne. Den Statminer pakke beregner også varians blandt brugerdefinerede endogene kontrol og identificerer dem med de mindste varians på tværs af alle prøver. Den Statminer pakke tillader flere endogene kontrol, der skal anvendes til at normalisere datasættet. I vores tilfælde de mindst variant endogene kontroller var sno135 og MIR-25, og disse blev anvendt til at normalisere dataene. Differential udtryk udtrykkes som ΔΔCt (forkortet DDCt), som repræsenterer (meanΔCtLimma_SM_Tumor) – (meanΔCtLimma_SM_Con) Således sammenlignede vi en forholdsvis enkel model, hvor blev gjort noget forsøg på at normalisere data (rangorden statistik, forkortet Rnk_Diff), en simpel median normalisering model (Med_Norm), og en mere kompliceret empirisk Bayesian model, der bruges flere endogene kontrol for at normalisere data (Limma_SM).

en sammenligning af ændringerne i rangorden af ​​de enkelte miRNA (Rank Forskel AC-Con) og den log2 fold ændring fra median normaliserede data [Median normaliseret DCT (AC-Con)] er vist i figur 1A, mens en tilsvarende sammenligning af log2 fold ændring efter Limma normalisering til sno135 og miR-25 [DDCt (AC-Con)] er vist i figur 1B. Fordelingerne er naturligvis næsten identiske, som angivet ved Spearman rank korrelationskoefficienter på 0,8324 og 0,8328 for figur 1A og B, hhv. Denne lighed resultater fra nær identitet udtrykket data beregnet fra median normaliserede og Limma-normaliserede data (figur 1C, Spearman rank korrelationskoefficient = 0,9996). Den iagttagelse, at to meget forskellige normalisering protokoller gav i det væsentlige identiske resultater indikerer sandsynligvis, at der er meget lidt varians, enten analytisk eller biologisk, blandt vores prøver.

Ændringer i rangorden, defineret som gennemsnitlige rang i AC prøver minus betyde rang i Con prøver, plottes mod DCT værdier (betyder Ct_AC minus betyder Ct_Con) i panel A eller DDCt (betyder DCt_AC minus betyde DCt_Con) i panel B. Limma normaliserede DDCt værdier for de enkelte miRNA plottes mod median normaliserede DCT værdier i Panel C . differentielt udtrykte miRNA blev filtreret på P 0,01 og rangorden ændre ≥10 eller log2 fold ændring ≥1.0. Overlap mellem differentielt udtrykte miRNA identificeret ved rangorden statistik (Rnk_Diff), t-test ved hjælp af median normaliserede data (Med_Norm), eller Statminer gennemførelse af Limma (Limma_SM) vises i Panel D.

Brug disse tre metoder vi identificeret 193 miRNA, der blev bedømt som signifikant forskellige (P≤0.01) i en eller flere af analyserne (anført i tabel S1). Vi indførte ekstra filtre af rang forskel ≥ (± 10) og P≤0.01 at identificere 73 differentielt udtrykte miRNA ved rangorden statistik. Når vi filtreres på log2 fold change≥ (± 1,0) og P≤0.01 vi identificeret 130 miRNA, der var differentielt udtrykte i medianen normaliserede analyse og 134 miRNA, der var forskelligt udtrykt af Limma analyse. En Venn-diagram af overlap mellem disse miRNA er vist i figur 1D. Noget til vores overraskelse, var der kun 51 miRNA, der opfyldte alle betingelser for alle modeller. En tredimensional korrelation sammenligne rang forskel, DCT (median normalisering), og DDCt (Limma normalisering) afslørede en 3-dimensionel korrelationskoefficient på 1,00 for disse 51 prøver (data ikke vist). Disse miRNA repræsenterer stor sandsynlighed mål, der sandsynligvis vil spille en vis rolle i de allertidligste faser af inflammation. (Disse miRNA er identificeret med fed i tabel S1.) Både median normalisering og Limma gav et betydeligt antal outliers, hvorimod rangorden statistisk analyse udviste næsten fuldstændig overlapning med mindst en af ​​de andre modeller (Fig. 1D).

Vores konklusion fra denne indledende sammenligning af tre forskellige normalisering metoder er, at de alle giver meget lignende resultater, i form af relativ miRNA overflod, i et datasæt med lidt analytisk eller biologisk varians inden for kontrol og forsøgsgrupper. De forskellige statistiske modeller giver markant forskellige p-værdier, hvilket sandsynligvis skyldes for en stor del af det lille antal prøver, der blev inkluderet i denne analyse, samt brugen af ​​modereret varians (Limma) versus umodereret varians (t-test). Samlet rang orden statistikken fungerer mindst lige så godt som en af ​​de normaliserede modeller, har tendens til at være mere konservative med hensyn til antallet af forskelligt regulerede miRNA, og har de yderligere fordele, at det kræver noget kendskab til relevante endogene kontrol og gør ingen antagelser om lige store mængder RNA eller lig effektivitet miRNA ekstraktion eller cDNA konvertering fra prøve til prøve. Vi har derfor valgt at gå videre med vores analyser ved hjælp rangorden statistik til at identificere differentielt udtrykte miRNA. Men ændringer i rangorden er ikke informative i absolut (eller mere præcist analog) miRNA overflod, så vi påberåbt Limma at beregne normaliseret overflod, udtrykt som DDCt, hvilket svarer til -log2 fold ændring normaliseret til sno135b /miR-25 .

Identifikation af differentielt udtrykte miRNA i eksperimentelle modeller af colitis-associeret tyktarmskræft og familiær adenomatøs polypose coli

Vi brugte AB TaqMan miRNA arrays til at måle den overflod af 384 miRNA i tumorer isoleret fra distal koloner af APC

Min /+ mus (APC tumorer) og tumorer, der dannes i de distale koloner af kronisk betændte mus (CAC tumorer). APC

Min /+ mus blev pensioneret opdrættere, 120d af alder, og vedligeholdes på højt fedtindhold opdrætters chow. CAC tumorer blev isoleret fra mus, der var blevet udsat for 12 runder af lav inflammation niveau, induceret af DSS som beskrevet i Materialer og Metoder. Som kontrolprøver, vi isoleret epitelceller fra tilstødende, uengagerede epitel fra APC

Min /+ (APC kontrol) eller kronisk betændte (CC kontrol) mus. Rangorden statistik blev anvendt til at identificere kandidat differentielt udtrykte miRNA i APC og CAC tumorer. (Raw Ct-værdier for disse prøver er angivet i tabel S2.)

Ct-værdier for alle miRNA i individuelle tumorer og kontrolprøver blev bestemt og kraft rangeret som beskrevet ovenfor, og t-test blev anvendt til at identificere miRNA hvis gennemsnitlige rang var signifikant forskellig i kontrol og tumorer. De gennemsnitlige rang ordrer for individuelle miRNA fra APC kontrol og APC tumorer vises i figur 2A. Der var generelt en god overensstemmelse mellem rangorden af ​​miRNA overflod i APC kontrol og APC tumor prøver (Spearman Rank Order korrelationskoefficient = 0,973, p = 2.0E

-07), dog 10 miRNA (vist som røde symboler ) faldt uden for forudsigelse intervaller 95% (vist som parallelle linjer i fig. 2A).

Mean rang ordrer af miRNA overflod (baseret på Ct-værdier) blev bestemt for tumorer fra de distale koloner eller uengagerede tilstødende distal colon epithelceller (Panel A). SigmaStat blev anvendt til beregning 95% konfidensintervaller for disse data (parallelle optrukne linier) og miRNA detektorer, der faldt uden for disse intervaller er fyldt med rødt. Ligeledes vi sammenlignet rangorden af ​​ekspressionen af ​​miRNA fra tumorer, der dannes i de distale koloner af kronisk betændte mus (CAC) og uengagerede, kronisk betændte distale colon epitel celle præparater (CC kontroller), som vist i panel B. miRNA detektorer, faldt uden for konfidensintervaller de 95% er fyldt med rødt.

Figur 2B sammenligner rang ordrer af den overflod af miRNA målt i CCcontrol og CACtumors prøver. Som med APC prøver, der var en generelt høj overensstemmelse mellem rangorden overflod af miRNA i disse prøver (Spearman Rank Order korrelationskoefficient = 0,970, p 2.0E

-07). Men 10 miRNA (rød symboler) faldt uden for de 95% forudsigelse intervaller (Fig. 2B), hvilket indikerer, at rækken af ​​disse miRNA var forskellige i kontrol og tumorer, i overensstemmelse med en høj sandsynlighed for, at disse miRNA differentielt blev udtrykt. Det er vores erfaring, at meget store ændringer i miRNA overflod (som det fremgår i dette tilfælde af store rangorden forskelle) er lejlighedsvist forbundet med atypiske kinetik for opformering af meget lav hyppighed miRNA. Vi har derfor visuelt inspiceret qPCR forstærkning kurver for hver af miRNA i hver prøve og elimineret dem, for hvilke log-lineær forstærkning kinetik (1CT /cyklus) ikke fik. Denne datasikring trin reducerede antallet af høj sandsynlighed differentielt udtrykte miRNA i APC tumorer til 5, og antallet af sådanne miRNA i CAC tumorer til 7. Som vist i tabel 1, blev to miRNA undertrykt i APC tumorer (MIR-215 og MIR-137 ), sammenlignet med tilstødende kontrol epitel, mens 3 miRNA blev induceret (miR-708, miR-31, miR-135b). Kun en miRNA blev undertrykt i CAC tumorer i forhold til at styre kronisk betændt epitel (miR-215), mens 6 miRNA blev induceret i CAC tumorer (miR-133a, miR-467d, miR-218, miR-31, miR-135b). Tre miRNA blev induceret i både APC og CAC prøver (MIR-31, MIR-135b, og MIR-708) og 1 miRNA blev undertrykt i både APC og CAC prøver (MIR-215). Desuden blev 1 miRNA entydigt undertrykt i APC tumorer (MIR-137), og 3 miRNA blev entydigt induceret i CAC tumorer (MIR-133a, MIR-467d, og MIR-218). De 8 differentielt udtrykte miRNA i tabel 1, blev derfor udvalgt til validering.

Selvom rangorden statistik er et nyttigt værktøj til indstilling af miRNA, som udtrykkes forskelligt, er en mere kvantitativ tilgang nødvendig for at bestemme omfanget af reaktionen i en given sammenligning. Til dette formål brugte vi Statminer gennemførelsen af ​​Limma at udføre normalisering og sammendrag af TaqMan array-udtryk data. Dataene er vist i figur 3 som log 2 transformation af fold ændring for hver af de 8 indsatsområder miRNA, hvor Fold Change = – [middelværdi (DCtTumor-DCtControl)]. P-værdier blev beregnet for hver sammenligning i Limma empiriske Bayesian gennemførelse af t-test til sammenligning normaliserede (DCT) med henblik på tumorer og kontroller. Som vist i figur 3, alle kandidat miRNA udviste store, statistisk signifikante forskelle i ekspression i APC tumorer (Fig. 3A) og CAC (fig. 3B), i forhold til kontrolprøver.

MicroRNA overflod i fire forskellige prøve kohorter blev normaliseret ved hjælp Statminer og sno135 /miR-25 som endogene kontrol. APC kontroller blev normaliseret til APC tumorer (panel A) og CC kontrol til CAC tumorer (panel B). Den overflod af hver af de 8 kandidat miRNA er repræsenteret som log2 gange ændring (middel Ct tumor – middelværdi Ct kontrol) og p-værdier blev beregnet under anvendelse af Limma empiriske Bayesian gennemførelse af modereret t-test

Vi brugte konventionelle TaqMan cDNA konvertering primere og qPCR reagenser for at bekræfte forskellen udtryk for de fire miRNA, der udviste fælles lovgivningsmæssige reaktioner i CAC og APC tumor prøver, der anvendes i den indledende multiplex qPCR-analyse. Som vist i figur 4 blev undertrykkelse af MIR-215 bekræftet i både CAC og APC tumorprøver, hvorimod induktion af MIR-708, MIR-31, og MIR-135b blev ligeledes bekræftet i tumorer af begge oprindelser. Vi forberedt et ekstra sæt kontroller og tumorer fra både kronisk colitis og APC mus og målte overflod af miR-215, miR-708, miR-31, og miR-135b. Figur 5 viser, at inden for eksperimentel fejl resultaterne forudsagt fra rangordenen statistiske analyser blev valideret på en uafhængig prøve kohorte.

RNA-prøver analyseres i figur 2 og 3 blev omdannet til cDNA under anvendelse individuel Taqman hårnål RT-primere, i modsætning til den universelle primer mix anvendes til de TaqMan arrays. forskellige cDNA præparater blev således fremstillet og undersøgt for miRNA overflod i APC prøver (Panel A) og CAC prøver (Panel B). MicroRNA overflod blev normaliseret med sno135 og p-værdier beregnet med Statminer Limma protokollen. Data for hver miRNA blev kalibreret til udtryk (2e-DCT) i det relevante kontrolprøve. Barer repræsenterer middelværdi og standardafvigelse for hver miRNA, n = 4. * angiver p-værdi. 0,05

RNA blev fremstillet af et uafhængigt sæt APC tumorer (n = 9) og kontroller ( n = 9) (panel A) eller CAC tumorer (n = 4) og kontroller (n = 8) (Panel B). MicroRNA overflod blev målt ved specifikke stamceller Taqman microRNA PCR og normaliseret med sno135. Data blev normaliseret ved hjælp Statminer og kalibreret til udtryk af individuelle miRNA i kontrolprøverne. Barer repræsenterer middelværdi og standardafvigelse. * Angiver p-værdi. 0,05

Focus miRNA udtryk i primære humane coloncancerformer

mønster af udtryk af de 8 indsatsområder miRNA anført i tabel 1 indebærer, at nogle eller alle disse miRNA kan spille en potentiel rolle i ætiologien af ​​de tidlige stadie adenomer, der danner i APC

Min /+ mus og /eller mus, der har undergået eksperimentel kronisk colitis. En litteratur undersøgelse viser, at nogle af disse fokuserer miRNA er tidligere blevet rapporteret at være differentielt udtrykt i primære humane coloncancere, som vist i tabel 2. MikroRNA’er MIR-31 og MIR-135b er blevet rapporteret at blive induceret i coloncancer, svarende til det svar, vi har observeret i fase tumorer tidligt i kronisk betændt eller APC

Min /+ mus. Ligeledes observerede vi nedregulering af miR-215 i tumorer i begge typer, og nedregulering af miR-133a i CAC, men ikke APC tumorer. Begge disse miRNA er rapporteret til at blive nedreguleret i humane coloncancerformer [18], [21] – [23], [37]. Vores analyser viser, at disse miRNA arter induceres meget tidligt i transformation og sandsynligvis påvirke signalveje der er centrale for processer, der er uafhængige af den mekanisme af indvielse.

Analyse af potentielle miRNA mål og funktioner i begyndelsen stage tumorer

Flere forskellige algoritmer er blevet udviklet til at forudsige miRNA mål baseret på forskellige parametre til at vurdere de komplementære miRNA frø sekvenser til sekvenser i 3′-utranslaterede regioner af mRNA’er [10], [57] – [59 ]. Selv om disse analyser er langt fra perfekt i form af prædiktiv evne, de forbliver de eneste værktøjer til rådighed til at forudsige miRNA mål, og produktionen af ​​disse analyser er nyttig til at forudsige hypotetiske sammenhænge mellem miRNA, målrettede veje og biologiske funktioner. Da forskellige algoritmer ofte giver forskellige resultater, vi brugte PicTar, mikrokosmos Targetscan, og DianaT at generere lister over potentielle mål for hvert af de differentielt udtrykte miRNA. Vi indgår i disse lister kun mål, der blev bevaret i mus og menneskelige udskrifter, og de enkelte forudsigelser blev samlet for at danne en overordnet liste over formodede mål for alle fire miRNA. Denne liste blev derefter sammenholdes med microarray data fra isolerede mus distal colon epitelceller [60], og mål, der ikke blev scoret som “Present” i disse celler blev elimineret. De kuraterede lister blev derefter anvendt til vej forudsigelse.

Vi fokuserede på de 4 miRNA, der var differentielt udtrykte i tidlige fase læsioner af både genetiske og inflammatorisk oprindelse (miR-215, miR-31, miR-708, miR -135b). Hjælp af filtre er beskrevet ovenfor, identificerede vi 527 potentielle target mRNA’er, der blev udtrykt i muse distal colon epitelceller. Gene ontologi analyse (tabel 3) identificerede Kræft som toppen biologiske funktion er forbundet med dette gen sæt, med 130 af de 527 mål knyttet til kræft gennem GO vilkår (p-værdi rækkevidde 5.86E

-05 til 2.87E

-02). GO vilkår forbundet med Gene Expression opstået som øverste Molekylær og Cellulær Function, med 131 mål er knyttet til denne kategori (p-værdi rækkevidde 5.78E

-11 til 2.87E

-02). Den øverste Tox-funktionen var TGF-β Signaling (p = 5.2E

-04, med 9/77 signalering komponenter identificeret som potentielle mål). De resterende statistisk signifikante Tox funktioner blev relateret til nukleare receptorer der er blevet undersøgt i udstrakt grad inden for rammerne af colon epitelcelle fysiologi og patologi, herunder TR /RXR, VDR /RXR, og FXR /RXR.

Disse hypotetiske GO funktioner forudser en stærk kobling mellem de fire differentielt udtrykte miRNA og transformation af colon epitelceller. Denne hypotetiske kobling understreges af de data, der er vist i figur 6, hvor formodede miRNA mål (vist i grønt) er overlejret på de videnbaserede (Opfindsomhed) molekylære mekanismer i kræft kanonisk vejen (p = 1.14E

-06, 28 forudsagte mål /372 pathway komponenter). Kritiske membran signalering funktioner relateret til Ras /MAPK, PI3K, og WNT /β-catenin repræsentere potentielle mekanistiske forbindelser mellem disse miRNA og transformation, mens nukleare funktioner i forbindelse med RB /E2F kontrol fremstå som potentielle mediatorer af cellecyklus kontrol. Endelig, som angivet af GO analyse af Tox-funktion, er TGF-β /BMP /SMAD signalering nomineret som en meget betydelig potentiel sammenhæng mellem disse fire miRNA og transformation af colon epitelceller.

Formodede mRNA mål for 4 fokus miRNA blev kompileret med PicTar, mikrokosmos Targetscan, og DianaT databaser. Forventede mål blev overlejret i grå på opfindsomhed molekylære mekanismer i kræft kanoniske vej.

Diskussion

Vores centrale mål var at sammenligne miRNA udtryk i kolon tumorer, der opstår som følge af kronisk inflammation og kimcelletransformanter mutationer i modelsystemer. Det var klart tidligt, at normalisering af dataene ville være et problem, da vi var at sammenligne forskellige væv tilstande (

f.eks

, kronisk betændt mus på standard lab chow versus alderen opdrættere på højt fedtindhold kost.); og der er ingen veletableret objektive kriterier for at identificere passende endogene kontrol for normalisering af miRNA udtryk under sådanne betingelser (For en gennemgang af dette emne, se [61]). Vores første mål var derfor at anvende en uvildig prøvesæt at sammenligne forskellige modeller for normalisering. Til dette formål har vi fremstillet og analyseret distale colon epitelceller fra kontrol- og akut inflammeret væv, anvendelse af en konventionel DSS akut colitis model. Vi undersøgte en tidlig, præ-betændt, tilstand, før påviseligt tab af histologisk integritet af den distale colon epitel, tænker at minimere ændringer i miRNA udtryk, der kan være forbundet med massiv infiltration af immune celler. Ved hjælp af tre forskellige analytiske tilgange vi identificeret 51 høj prioritet miRNA-mål, der sandsynligvis vil spille en væsentlig rolle i at kontrollere genekspression i epitelceller i de allertidligste faser af DSS-induceret inflammation. Selv om disse fund udgør, så vidt vi ved, den første detaljeret rapport over forskellen miRNA udtryk i denne colitis model, vi har ikke yderligere analyseret disse data. bruges Snarere vi disse data til at validere vores valg af rangorden statistik til at identificere differentielt udtrykte miRNA. Denne analytisk tilgang kræver ikke identifikation af passende intern kontrol og er især egnet til analyse af relativt små grupper af prøver, da der ikke antagelser kræves om lige RNA lastning eller effektiviteten af ​​udvinding af miRNA eller cDNA konvertering fra meget forskellige slags væv [62 ]. Generelt rang orden forskelle, vi observerede korrelerer godt med analog miRNA overflod, udtrykt som DCT i mediane normaliserede data eller DDCt i sno135 /miR-25 normaliseret (Statminer) analyser. Men p-værdier tildelt af de forskellige statistiske modeller varierede betydeligt, skyldes i det mindste delvis til den lille stikprøvestørrelse og brugen af ​​modereret (Limma empiriske Bayesian) versus umodereret (t-test) tilgange til estimering varians. I betragtning af, at enhver statistisk model er tilbøjelige til at bryde ned med små prøvesæt, vi valgt at bruge de enkleste, mest konservative tilgang: rangorden statistik. Vi brugte Statminer normalisering (mod sno135 og miR-25) til at udtrække relativ miRNA overflod.

rangorden statistik blev anvendt til at identificere 8 differentielt udtrykte miRNA i tumorer, der dannes i de distale koloner af APC

Min /+ mus og kronisk betændte mus. Det skal bemærkes, at disse tumorer er primært adenomer og således repræsentere et meget tidligt stadium i transformation. Vi bør også understrege, at disse 8 miRNA repræsenterer kun de mest fremtrædende, og derfor sandsynligvis den mest reproducerbare, ændringer i miRNA udtryk i disse prøver.