PLoS ONE: ALCAM (CD166) Udtryk og serumniveauer i pancreas Cancer

Abstrakt

Baggrund

Denne undersøgelse blev udført for at evaluere udtrykket af den aktiverede leukocyt celleadhæsionsmolekyle (ALCAM) i kræft i bugspytkirtlen (PAC) og til at afgøre, hvorvidt den ektodomæne udgydelse af ALCAM (s-ALCAM) kunne tjene som biomarkør i det perifere blod hos PAC patienter.

Materiale og metoder

Tissue prøver og blod sera fra patienter med PAC (n = 264 og n = 116, henholdsvis) og sera fra 115 patienter med kronisk pancreatitis (CP) blev analyseret via ALCAM immunhistokemi og s-ALCAM ELISA tests. Resultaterne blev korreleret med kliniske, histopatologiske og patientdata overlevelsesdata (Chi-square test, Kaplan-Meier analyse, log-rank test, henholdsvis).

Resultater

ALCAM blev udtrykt i de fleste af PAC læsioner. Immunhistokemi og serum ELISA test viste ingen sammenhæng mellem ALCAM udtryk i primære tumorer eller s-ALCAM og kliniske eller histopatologiske data. Hverken ALCAM eller s-ALCAM viste en betydelig indvirkning med hensyn til samlet overlevelse (p = 0,261 og p = 0,660, henholdsvis). S-Alcam serum blev signifikant forhøjet sammenlignet med sera fra CP-patienter (p 0,001). Følsomheden af ​​s-ALCAM at opdage PAC var 58,6% ved en specificitet på 73,9% (AUC = 0,69).

Konklusioner

ALCAM udtrykkes i de fleste PAC læsioner, men statistisk analyse viste ingen sammenhæng med kliniske eller patologiske data. Selvom signifikant forhøjet hos patienter med PAC, følsomheden og specificiteten af ​​s-ALCAM serum kvantificering test var lav. Derfor sit potentiale som en ny diagnostisk markør for AKP er fortsat, undvigende og yderligere undersøgelser er påkrævet

Henvisning:. Tachezy M, Zander H, Marx AH, Stahl PR, Gebauer F, Izbicki JR, et al. (2012) ALCAM (CD166) Udtryk og serumniveauer i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 7 (6): e39018. doi: 10,1371 /journal.pone.0039018

Redaktør: Frank T. Kolligs, universitetet i München, Tyskland

Modtaget: Februar 27, 2012; Accepteret: 15. maj 2012; Udgivet: Juni 20, 2012 |

Copyright: © 2012 Tachezy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte til denne undersøgelse blev leveret af en forskningsbevilling fra universitetet i Hamburg (Forschungsförderung Medizin – FFM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Da de fleste patienter med pancreas adenocarcinom (PAC) til stede i fremskredne stadier af sygdommen, forekomsten af ​​AKP er næsten lig med dens dødelighed. Selv i den helbredende indstilling, som kun gælder for en undergruppe af patienter, har onkologisk langsigtede overlevelse ikke blevet forbedret betydeligt i de senere år (rapporteret median overlevelse på mellem 14 og 22 måneder); de fleste af tumorerne gentages lokalt eller på fjerne steder [1], [2]. Desværre, forbedringer i (neo-) adjuvans og endda lindrende behandling vedrørende tilbagefald og overlevelse er stadig skuffende; ingen af ​​de nyligt testede målrettede behandlinger var meget lovende i kliniske forsøg [3], [4], [5], [6]

Som følge heraf skal opnås to hovedmål:. første, nye biokemiske bør udvikles test til tidlig påvisning, overvågning og prognose af PAC. Desuden kunne disse hjælper til at skelne mellem maligne og benigne læsioner på bugspytkirtlen, såsom kronisk pancreatitis (CP). I virkeligheden er der stadig ingen etablerede eller anbefalede serum markører for diagnose eller prognose af AKP i rutinemæssig anvendelse [7], [8]. For det andet skal de potentielle innovative mål for biologiske behandlinger identificeres for at forbedre overlevelsen af ​​patienter med PAC.

I den seneste tid, blev teorien om den hierarkiske organisering af tumorceller omfattende undersøgt, støtter kræft stamceller hypotese [ ,,,0],9], [10], [11], [12], [13]. Disse celler kan være potentielle terapeutiske biologiske mål og prognostiske markører. Flere forfattere har identificeret formodede stamcellemarkører for tarm samt PAC, nemlig CD133, CD44, og CD166, den aktiverede leukocyt-adhæsionsmolekyle (ALCAM) [10], [14], [15], [16], [17 ]. Sidstnævnte er et højt konserveret 110 kDa multidomain transmembrane type 1 glycoprotein af immunglobulin-superfamilien. Dette molekyle medierer homotypisk og heterotypiske interaktioner mellem celler [18], [19]. Det spiller en rolle i udviklingen af ​​forskellige væv, for eksempel i neurogenese og haemotopoiesis, og den deltager i mekanismerne i immunresponset [20], [21], [22]. Som med andre membranproteiner, ALCAM betegner et potentielt mål for terapi og dens anvendelighed som et lægemiddel target struktur kan yderligere forbedres ved ligand-induceret endocytose [23]. Desuden er en nyligt beskrevet internalisere single-chain anti-ALCAM antistof har potentialet til at levere terapeutiske midler til kræftceller [23], [24].

Flere undersøgelser rapporteret sit potentiale som biomarkør for forskellige tumor enheder, såsom melanom, pancreas og ampullary adenocarcinom, og colorectal, gynækologisk og neuroendokrine karcinomer. Dens udtryk er forbundet med forskellige resultater i forskellige tumorer [17], [18], [19], [20], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Endvidere er det ekstracellulære domæne af ALCAM (s-ALCAM) kaste af metalloproteaser (fx ADAM 17), fungerer som en aktiv messenger og interagerer med omgivende væv [33]. Efter spaltning fra tumorcelleoverfladen, kan detekteres s-ALCAM i blodserum. En øget s-ALCAM udtryk blev observeret i æggestokkene, bryst og kræft i spiserøret patienter sammenlignet med raske kontrolpersoner [30], [33], [34], [35], [36]. Desuden har undersøgelser med små patientprøver viste en forhøjelse af s-ALCAM ekspression i sera fra patienter med PAC [37], [38].

Vi har udført denne undersøgelse at undersøge sammenhængen mellem ALCAM ekspression i et stort antal primære PAC læsioner og kliniske og histopatologiske data og dets potentielle prognostisk værdi. Desuden har vi bestemt den præoperative s-Alcam serumniveauer af patienter med PAC og CP og evalueret dens betydning som en diagnostisk og prognostisk markør.

Resultater

Karakteristik af de patienter

bugspytkirtelkræft vævsprøver fra 264 patienter i alderen 33 til 87 år (median 63 år) og blod sera fra 116 PAC patienter mellem 33 og 92 år (median 64 år) og 115 CP-patienter 79 (median 51 år) i alderen mellem 31 und blev inkluderet i denne undersøgelse. Alle patienter blev kirurgisk behandlet mellem 1993 og 2006 på Institut for General, Visceral og Thorax kirurgisk fra University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Tyskland.

drift metoder var den klassiske Whipple procedure, pylorus-bevarelse pancreaticoduodenectomy , subtotal eller total pankreatektomi i tilfælde af PAC og orgel-bevarelse resektion metoder i tilfælde af CP.

den mediane follow-up tid af patienterne inkluderet i overlevelsesanalyse var 14 måneder (interval 0-193 måneder) og median samlet overlevelse (OS) var 15 måneder (95% CI 13.2-16.7 måneder). Tyve-ni (10,5%) patienter døde inden for de første 30 dage efter operationen.

ALCAM Expression i PAC og dets overensstemmelse med kliniske og Histopatologiske Kendetegn

I alt 192 (78,6%) primært PAC tumorprøver var tolkes i vores væv microarryay (TMA) analyse. Grunde til ikke-informative tilfælde (52; 21,3%) indeholdt en fuldstændig mangel på vævsprøver eller manglende entydig kræftvæv i TMA sektioner. Analyse af sunde pancreasvæv afslørede en svag eller mellemprodukt ALCAM ekspression (+ /++) i normal acinære eller duktale pancreasceller (n = 10, figur 1F). Farvningsmønstret af ALCAM immunhistokemi viser en fremherskende membranøs ekspression af ALCAM molekylet. Selv om nogle cytoplasmatisk farvning lejlighedsvis blev set, var dette altid forbundet med en langt større grad af farvning i membranerne. Thirty-otte procent af tumorerne udviste et lavt niveau af ALCAM ekspression, 44% medium og 18% et højt ALCAM ekspression (figur 1A-1E, se Materialer og Metoder til kriterier). Tumorerne viser en heterogen farvningsmønster inde i de ondartede læsioner (Figur 1A-1E).

(A) og (B) stærk ALCAM ekspression, (C) og (D) medium og (E) ingen ekspression. (F) Sund pancreasvæv. (G) Komplet scanning af PAC væv microarray.

De histopatologiske fund af fortolkelige tumorer er sammenfattet i tabel 1. udtryk for ALCAM viste ingen sammenhæng med kliniske eller histopatologiske parametre som alder, køn , tumor stadie (UICC 6

th klassificering) eller tumor bedømmelse (G).

de overordnede overlevelseskurver plottet af Kaplan-Meier analyse viste ikke en signifikant forskel mellem lav, medium eller høj ALCAM-ekspressionssystemer patienter (p = 0,261, figur 2A). På grund af dette, blev udført nogen multivariat analyse.

(A) Immunohistokemisk ALCAM farvning af primære pancreas cancer prøver og (B) lave og høje s-ALCAM serumniveauer (patienter, der døde inden for de første 30 dage efter operationen var udelukket).

S-ALCAM i blodserum

s-Alcam værdier blev signifikant forhøjet i blodet serum af PAC patienter (n = 116, mener 29,4 ng /ml , standardafvigelse (SD) 1.1 ng /ml, p 0,001) sammenlignet med CP-patienter (n = 115, betyder 18,2 ng /ml, SD 1,0 ng /ml) og raske bloddonorer (n = 128, betyder 21,1 ng /ml , SD 0,7 ng /ml, figur 3A)

(A) s-ALCAM serumniveauer af de patienter med kræft i bugspytkirtlen (PAC) og kronisk pancreatitis (CP) og raske kontrol bloddonorer (p. 0,001) . (B) Modtager opererer karakteristiske (ROC) kurver af s-ALCAM til diagnosticering af PAC versus CP-patienter.

Receiver Operating karakteristiske kurver blev anvendt til at etablere følsomheden-specificitet forhold til s-ALCAM ( Figur 3B). Cut-off-niveau bestemt af Youden indekset var 22 ng /ml. AUC var 0.690. Følsomheden af ​​s-ALCAM at opdage PAC var 58,6% ved en specificitet på 73,9% i forhold til patienter med CP.

For at fastslå virkningen af ​​forhøjet s-Alcam niveauer på patienter med PAC, kontinuerlig og kategoriske analyser blev perfomed

Ingen signifikante forskelle blev fundet med hensyn til køn (kvindelige 33,6 ng /ml, mandlige 31,3 ng /ml, p = 0,649), alder ( . 64 år 33,0 ng /ml, 64 år 33,0 ng /ml; p = 0.775), UICC stadium (la 24.1 ng /ml, Ib 36,0 ng /ml, IIA 26.8 ng /ml, IIb 36.4 ng /ml, III 19,0 ng /ml; IV 28,1 ng /ml; p = 0,277) og tumor celle sortering (G1 og G2 31,1 ng /ml, G3 35,0 ng /ml;. p = 0,479)

Vi definerede forskellige afskæringsværdier for kategoriske analyse af s-ALCAM data . Med ingen af ​​dem, (25

percentil, median og 75

percentil, den ‘optimale afskæringsværdi “, bestemt ved anvendelse af Youden-indeks for diskrimination af klassificering og tumorceller grading af UICC) en betydelig forbindelse med kliniske symptomer eller histopatologiske parametre blev beregnet

for at illustrere dette, tabel 1 viser analysen med en cut-off værdi af 75

percentil ( . 42,3 ng /ml s-Alcam, 75

percentil, tabel 1). De overordnede overlevelseskurver plottet af Kaplan-Meier analyse viste ingen signifikante forskelle mellem de lave og høje s-Alcam grupper (p = 0,660, figur 2B). På grund af dette, blev udført nogen multivariat analyse. Desuden blev ingen sammenhæng fundet med hensyn til alder eller køn i både PAC og CP. Desuden var der ingen signifikant korrelation mellem s-ALCAM grupper og Alcam immunhistokemisk farvning resultater (n = 39; p = 0,699)

Discussion

Formålet med den aktuelle undersøgelse var. at evaluere udtrykket og kliniske betydning af ALCAM i PAC væv og til at afgøre, hvorvidt s-ALCAM kunne tjene som en diagnostisk og prognostisk markør i det perifere blod hos PAC patienter. Resultaterne viste, at ALCAM blev udtrykt i de fleste PAC læsioner og at s-Alcam serum blev signifikant forhøjet sammenlignet med sera fra CP-patienter og raske kontroller (p 0,001).

Korrelationen mellem ALCAM ekspression i de primære PAC læsioner med de kliniske og patologiske parametre viste ingen signifikante resultater, hvilket bekræfter resultaterne af nyligt offentliggjorte undersøgelser på mindre patientprøver [29], [37]. Ikke desto mindre, beskrev de samme forfattere en potentiel rolle ALCAM i reduktion celleadhæsion og induktion af kemoresistens in vitro [37], og ALCAM blev også beskrevet som en uafhængig prognostisk markør i PAC-patienter (n = 97) [29]. I modsætning til resultaterne fra Kahlert og kolleger, en samlet overlevelse analyse af vores resultater (n = 138) viste ingen signifikant sammenhæng mellem tidspunktet for overlevelse og intensiteten og mængden af ​​ALCAM udtryk (lav, middel eller høj) (p = 0,261, figur 2A).

lokalisering af ALCAM udtryk i bugspytkirtelkræftceller er tidligere beskrevet som værende overvejende cytoplasmatisk i PAC prøver [29]. I modsætning til disse resultater har det immunhistokemisk farvning protokollen i den foreliggende undersøgelse afslørede en overvejende membranøs ekspression af adhæsionsmolekyle ALCAM (figur 1) [27], [30], [31], [32]. Cytoplasmatisk farvningsintensitet var relateret til intensiteten af ​​membranøs farvning og forekom ikke i fravær af membranøs farvning. Lignende observationer blev foretaget af Kristiansen og kolleger, som også findes overvejende membranøs farvning med en variabel grad af cytoplasmatisk farvning [39]. Derudover har vi ikke observere en membranøs-cytoplasmatisk skift mellem normale duktale celler eller lav kvalitet og høje kvalitet tumorer som Kahlert og kolleger gjorde [29].

Hvorfor er der forskelle i morfologiske og statistiske resultater af undersøgelser undersøge ALCAM i PAC? Selvfølgelig, flere faktorer påvirker farvningsintensitet og specificiteten af ​​immunohistokemi og koncentration antistof kun en af ​​dem. Brugt fortyndinger spænder fra 1:100 til 1:450 og forskellige forbehandlinger er beskrevet i undersøgelserne, hvilket afspejler den generelle problem med sammenlignelighed i immunhistokemiske undersøgelser. Desværre er almindeligt anerkendte retningslinjer for optimal immunhistokemi protokol udvikling mangler [40], [41]. For nylig, i en undersøgelse undersøger den kliniske betydning af p53 ændringer i prostatakræft, en immunhistokemisk protokol, der blev bevidst designet til at være “overfølsom” resulterede i en meget højere sats af positive immunhistokemiske fund (2,5% positivitet med standard-protokol sammenlignet med mere end 90% positivitet med “overfølsom” protokol) [42]. Facing dette problem, har vores gruppe etableret et omfattende og meget standardiseret protokol for en objektiv optimering af immunhistokemiske farvninger [40]. Afslutningsvis forskellige protokoller fremstille forskellige kvaliteter af følsomhed og specificitet, hvilket fører til betydelige forskelle i farvede mønstre og, som følge heraf, i de statistiske data. En anden kilde til statistiske forskelle er forskelle i stikprøvestørrelser og divergerende pointsystemer. Mens vores protokol er optimeret til at måle både mængden og tha intensiteten af ​​farvning, Kahlert og kolleger har fokuseret på intensitet kun [29], [40]. For at udelukke dette som en årsag til de afvigende resultater, har vi foretaget en analyse kun at bruge farvning intensitet, hvilket også fundet ingen statistisk signifikante resultater (data ikke vist).

Ikke desto mindre, ikke kun gjorde de fleste af primær PAC læsioner udtrykker ALCAM, men metastatiske og tilbagevendende læsioner viste også et medium til stærk ekspression (lymfeknudemetastaser 46%, n = 50; fjernmetastaser 85%, n = 7; tilbagevendende tumorlæsioner 67%, n = 15, data ikke vist) . Tilsvarende Piscuoglio og kolleger har beskrevet en betydeligt forhøjet ekspression i kræft i ampulla Vateri sammenlignet med raske pancreas prøver og adenom [17]. Disse resultater tyder på en potentiel involvering af denne faktor i tumor progression af PAC [17].

Denne hypotese står i kontrast til de seneste bemærkninger fra Zhang og kolleger, som identificerede ikke småcellet lungekræft (NSCLC) stængel celler eller tumor-initierende-celler ved Alcam specifikke FACS-sortering [13]. Alcam positive NSCLC celler viste en høj proliferativ potentiale in vitro og in vivo i modsætning til Alcam negative celler. Interessant, en knock-down af ALCAM resulterede ikke i et fald i tumorgenicitet, hvilket er i overensstemmelse med den undersøgelse, som Hong og kolleger, der observerede lignende resultater i en ALCAM dæmpning eksperiment af en PAC cellelinje via ALCAM RNAi [37]. Ingen effekt på proliferation eller migration blev set. Desuden Zhang og kolleger præsenteret immunhistokemiske resultater om effekten af ​​ALCAM væv udtryk på overlevelse i en TMA-format med 143 NSCLC patienter, finde nogen statistisk signifikant effekt. De konkluderede, at ALCAM ville være en meget robust, men indifferent celle-overflade markør for NSCLC tumor-initierende celler. Da vi ikke har fundet en signifikant klinisk sammenslutning af ALCAM udtryk, måske ALCAM godt have en lignende rolle i PAC stamceller. Hvis denne hypotese kan bekræftes ved yderligere in-vitro og in-vivo eksperimenter, kan ALCAM blive et potentielt mål for hidtil ukendte antistofbaserede behandlingsstrategier. Nytten af ​​ALCAM som et lægemiddel målstrukturen kan forstærkes yderligere af ligand-induceret endocytose af ALCAM [23]. Desuden er en nyligt beskrevet internaliserende enkeltkædet antistof [23], [24], målretning ALCAM er blevet foreslået for den potentielle intracellulær levering af forskellige terapeutiske midler til prostatacancerceller. Dog skal man vigtig indvending rejses: ALCAM er en ubikvitært udtrykt molekyle med fysiologiske roller i tarmslimhinden [43]. Alvorlige virkninger på normalt væv kan således resultere og skal tages i betragtning ved en anvendelse af systemiske specifikke cancerterapier anses [43].

På grund af den forhøjede ekspression af ALCAM i størstedelen af ​​kræft vi evaluerede også niveauerne af s-ALCAM (fra ektodomæne udgydelse af ALCAM) i blod sera. De s-ALCAM værdier blev signifikant forhøjet i PAC patienter sammenlignet med patienter med CP, og de raske bloddonorer (p 0,001 og p 0,001 henholdsvis, figur 3A). AUC viste en acceptabel diskriminerende magt s-ALCAM (AUC = 0,690, figur 3B). Følsomheden (58,6%) og specificitet (73,9%) af s-ALCAM var helt ringere end den tumormarkør anvendes hyppigst til PAC, CA19-9, (følsomhed på 58% til 87%, specificitet 93%) [44] . Men potentielle metodiske svagheder i undersøgelsen skal ses i vurderingen af ​​resultaterne,: Selv om håndtering af serumprøver er standardiseret på vores institution, kan selv små forskelle i behandlingen eller håndtering få enorme virkninger [45]. Desuden undersøgelsen var retrospektiv og gennemført over en relativt lang periode. Derfor behøver vores resultater ikke udelukke en potentiel nytte af s-Alcam serum kvantificering test, vi mener, at testen bør evalueres yderligere i prospektive studier med større patientgrupper.

For at bestemme foreningen af ​​forhøjede s -ALCAM niveauer med patientens overlevelse og tumor fase blev forskellige statistiske analyser udført. Hverken en analyse ved hjælp s-Alcam niveauer, som en kontinuerlig variabel eller en kategoriske analyse med forskellige afskæringsværdier viste signifikante associationer med kliniske eller histopatologiske parametre (Tabel 1 viser eksemplarisk resultaterne af 75

percentil som cut-off niveau ). Som allerede nævnt, kan ALCAM være en inaktiv faktor, som kunne forklare manglen af ​​en forening [13].

For nylig, en potentiel rolle ALCAM i gemcitabin-induceret kemoresistens i PAC blev beskrevet, da ALCAM-tavshed PAC celler viste en induceret kemoresistens [37]. Undersøgelse den kliniske effekt af de in vitro-data, vi udførte en sub-analyse af patienter, der får adjuverende kemoterapi med hensyn til overlevelse (log-rank test). Patienter med høj eller mellemliggende ALCAM udtryk viste ikke et reduceret eller langvarig overlevelse sammenlignet med Alcam negative patienter (n = 60, p = 0,176). Desuden blev der ikke overlevelse fundet i patienter med reducerede s-Alcam serumniveauer (75

percentil, n = 28, p = 0,672). På grund af den retrospektive karakter af undersøgelsen, blev nogle patienter, der fik adjuverende kemoterapi identificeret, som væsentligt begrænser strømmen af ​​analysen. Desuden blev forskellige ordninger administreret (Gemcitabin, fluorouracil og andre). Yderligere analyser bør udføres med større og mindre heterogene patientkohorter, som kan hjælpe til at identificere patienter, som vil drage størst fordel af en adjuverende behandling, og også hjælpe skræddersy den bedste individuel behandling for hver patient.

serumniveauer af s -ALCAM er blevet undersøgt i pancreascancer før, men denne undersøgelse var den første til at analysere både ALCAM ekspression og s-Alcam niveauer i de samme patienter [36], [37], [38]. Overraskende blev der ikke fundet signifikant sammenhæng eller forening mellem den forhøjede væv udtryk og serum niveau i patienter (n = 48, p = 0,699). For nylig blev s-Alcam niveauer undersøgt i bryst- og esophageal kræftpatienter men der fandtes ingen korrelation med væv udtryk [30], [35]. Dette kan have flere årsager: For eksempel giver den blotte udtryk for ALCAM protein ikke at medføre en øget afgivelse af s-ALCAM af proteaser såsom ADAM17, som for nylig blev vist [29], [30]. Endvidere rødmen i Shedded molekyle i blodstrømmen kan være en konsekvens af afbrydelsen af ​​anatomiske barrierer omgivende værtsvæv og endotelceller. Tilsammen er de mekanismer, der regulerer afgivelse af ALCAM og dens udbredelse i det omgivende væv og den træder i blodet systemet knapt forstået og er behov for yderligere undersøgelser.

ALCAM er stærkt udtrykt i PAC prøver. Det forhøjede ALCAM udtryk i primære og metastatiske steder af AKP kunne måske gøre ALCAM en målværdi for nye antistof-baserede behandlingsstrategier. De immunohistokemiske resultater af vores undersøgelse viste ingen signifikant sammenhæng mellem ALCAM udtryk og kliniske eller patologiske data i PAC patienter. Dette resultat er i klar kontrast til yderligere studier for at undersøge ekspressionen af ​​ALCAM i bugspytkirtelkræft og flere andre faste tumorer i mave-tarmkanalen. skal foretages en yderligere indsats for at undersøge den fysiologiske og onkologiske rolle ALCAM og validere den kliniske brug af s-ALCAM som en potentiel klinisk markør for AKP.

Metoder

Patienter og Kliniske data

for denne undersøgelse, vævsprøver (n = 264) og blod sera (n = 116) af patienterne med PAC og sera fra 115 patienter med CP behandlet på Institut for General, Visceral og thorax kirurgisk, University Medical center Hamburg-Eppendorf mellem 1993 og 2006 blev analyseret. Blodprøver blev taget umiddelbart før kirurgi. Ingen af ​​patienterne modtog neoadjuverende behandling. Alle data, herunder køn, histologi, tumorstørrelse, lymfeknude metastaser, sygdom etape (UICC 6

th udgave). Opfølgende data blev indhentet fra en kombination af kliniske og patologiske rekord anmeldelser fra ambulatorium journaler og kommunikation med patienter og deres behandlende læger, og fra Cancerregisteret. Samlet overlevelse blev beregnet fra datoen for operationen til datoen for død eller sidste opfølgning. Patienter, som ikke overlevede de første 30 dage efter operationen blev udelukket fra overlevelse analysen.

Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for den afdeling af Læger i Hamborg, Tyskland. Skriftligt samtykke til at bruge prøverne til forskningsformål blev opnået fra alle patienter før operation eller blod tegning.

Tissue Microarray (TMA)

Den præ-eksisterende bugspytkirtelkræft væv microarray består af i alt 600 vævsprøver [31], [46]. Disse omfatter 244 prøver af primær pancreasadenocarcinom, 116 lymfeknudemetastaser, 12 fjernmetastaser og 23 lokale gentagelser fra 264 patienter med PAC. Desuden kan andre end adenocarcinom (endokrine, intraduktal papillære mucinous neoplasmer, godartede og maligne cystiske tumorer og acinære celletumorer), pancreas-tumorer en standard kontrolområde indeholdende 40 tumorer fra andre organer, sunde pankreatiske væv og 18 raske væv fra andre steder er inkluderet. Konstruktion af TMA blev beskrevet tidligere [47]. Kort beskrevet hæmatoxylin-eosin farvede snit blev foretaget fra udvalgte primære tumorblokke (donor blokke) for at definere repræsentative tumor regioner. Vævscylinderne (0,6 mm i diameter) blev derefter udstanset fra det område af donorblokken anvendelse af et hjemmelavet halvautomatisk væv arrayer. Dele af 3 um i størrelse blev skåret ved hjælp af Paraffin Sektionsinddeling Aid System (Instrumentics, Hackensack, NJ, USA).

immunhistokemisk farvning for ALCAM og vurdering af ALCAM Expression

ALCAM farvningsprotokollen var optimeret i en omfattende og standardiseret flertrinsprocedure om forskellige benigne og maligne væv; protokollen blev ændret indtil selektiv farvning med de laveste baggrundssignaler blev etableret [40]. Frisk afskårne TMA snit blev analyseret på en dag i et enkelt eksperiment. Ekspressionen af ​​ALCAM blev påvist under anvendelse af et monoklonalt muse-antistof (klon MOG /07, 1:450; Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK) efter sektionerne var blevet dækket med en citratpuffer, pH 7,8, og kogt i en autoklave. Envision systemet (Dako, Glostrup, Danmark) blev anvendt til at visualisere immunfarvning

Kun membranøs farvning blev evalueret, fordi cytoplasmatisk farvning -. Hvis tilstede – var altid forbundet med stærkere membranøs farvning. Farvningsintensiteten (0, 1+, 2+, 3+) og fraktionen af ​​positive tumorceller blev scoret for hvert væv stedet som for nylig offentliggjort [40]. Steder uden farvning og med en farvning intensitet på 1+ i 70% og 2+ i 30% af tumorcellerne blev bedømt som ALCAM lav, blev medium scorer gives for en farvning intensitet på 1+ i ≥70%, 2+ i ≥30% eller 3+ i 30% af tumorcellerne, og high scores blev givet til en farvningsintensitet på 2+ i ≥70% eller 3+ i ≥30% af tumorcellerne. Immunhistokemisk analyse af sektionerne blev udført uden kendskab til patientens identitet eller klinisk status.

Sandwich ELISA til påvisning af s-Alcam

Til s-ALCAM kvantificering i perifert blod, serumprøver af 116 kaukasiske patienter med PAC og 115 kaukasiske patienter (37 kvinder og 78 mænd, median alder 50,1 år (31.4-79.2 år)) med CP, der var angivet for kirurgisk behandling, blev analyseret med en s-ALCAM sandwich enzymbundet immunassay ( ELISA). Alle blodprøver blev opnået direkte før operation. Som raske kontroller, blev 128 kaukasiske blod-bank donorer (62 kvindelige og 66 mandlige, median alder 48,7 år 19.2-65.3 år) inkluderet i undersøgelsen. Alle sera blev forarbejdet senest efter 4 timer [45].

Til påvisning af s-ALCAM, fleksible 96-brønds mikrotiterplader (Costar, Corning, NY, USA) blev overtrukket med 50 ul pr brønd af 2 ug /ml monoklonalt muse indfangende antistof (MAB6561; R Fraktion V, 98% renhed, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) i PBS /T (PBS pH 7,3 indeholdende 0,05% volumen /volumen Tween) i 45 minutter ved stuetemperatur, og derefter inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med humane serumprøver fortyndet 1:50 i PBS. Efter fem vaske med PBS /T, blev bundet protein detekteres af en biotin-konjugeret polyklonalt antistof (BAF656; R 10% variationskoefficient (CV) for de intra- og inter-assay variabilitet undersøgelser

Statistisk analyse

blev udført Den statistiske analyse hjælp SPSS Statistics for Windows (version 17, SPSS Inc., Chicago Ill, USA). Sammenhængen mellem immunfarvning og ELISA-resultater samt den kliniske data blev beregnet ved anvendelse Chi-square og Fishers eksakte tests og vises i krydstabeller. Cut-off-niveau for s-ALCAM kvantificering blev bestemt ved anvendelse af Youden-indekset. Gruppeforskelle blev beregnet ved t-testen, ANOVA; Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis test. Receiver Operating karakteristiske kurver blev anvendt til at beskrive udførelsen af ​​s-ALCAM. Overlevelseskurver blev afbildet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og analyseret under anvendelse af log-rank test. Alle tests var to-sidet og p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Tak

Vi takker de patienter, der villigt og generøst leveret data og prøver til forskningsformål samt Petra Schroeder og Christina Koop for deres fremragende tekniske support.