PLoS ONE: CDKN3 mRNA som biomarkør for overlevelse og terapeutisk mål i Livmoderhalskræft Cancer

Abstrakt

cyklin-afhængige kinase inhibitor 3 (

CDKN3

) gen, der er involveret i mitose, opreguleres i livmoderhalskræft (CC). Vi undersøgte

CDKN3

mRNA som en overlevelse biomarkør og potentiel terapeutisk mål for CC.

CDKN3

mRNA blev målt i 134 CC og 25 kontroller ved kvantitativ PCR. En 5-års overlevelse undersøgelse blev udført i 121 af disse CC patienter. Desuden

CDKN3

-specifikke siRNA’er blev brugt til at undersøge, om

CDKN3

er involveret i proliferation, migration og invasion i CC-afledte cellelinjer (SiHa, CaSki, HeLa).

CDKN3

mRNA var i gennemsnit 6,4 gange højere i tumorer end i kontrollerne (p = 8 x 10

-6, Mann-Whitney). I alt 68,2% af CC patienter over udtrykke

CDKN3

gen (fold ændring ≥ 17) døde inden for to år efter diagnosen, uafhængigt af det kliniske fase og HPV-type (Hazard Ratio = 5,0, 95% CI: 2,5 -10, p = 3,3 x 10

-6, Cox proportionel farer regression). I modsætning hertil kun 19,2% af patienterne med lavere

CDKN3

udtryk døde i samme periode. In vitro inaktivering af

CDKN3

faldt celledeling i gennemsnit 67%, selv om det havde nogen effekt på celle migration og invasion.

CDKN3

mRNA kan være en god overlevelse biomarkør og potentiel terapeutisk mål i CC

Henvisning:. Barrón EV, romersk-Bassaure E, Sánchez-Sandoval AL, Espinosa AM, Guardado-Estrada M, Medina I, et al. (2015)

CDKN3

mRNA som biomarkør for overlevelse og terapeutisk mål i livmoderhalskræft. PLoS ONE 10 (9): e0137397. doi: 10,1371 /journal.pone.0137397

Redaktør: Zhi-Ming Zheng, National Institute of Health-National Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: 18. december 2014 Accepteret: August 17, 2015; Udgivet: 15 September, 2015

Copyright: © 2015 Barrón et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af det nationale Råd for Videnskab og Teknologi (CONACYT, www.conacyt.mx), tildele numrene 8135 /A1, 24.341 (til JB ), National University of Mexico (www.unam.mx), tilskud nummer SDI.PTID.05.2 (til JB), og National Council of Science and Technology (CONACYT, www.conacyt.mx), stipendium (til EVB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser : CC, Livmoderhalskræft; HPV, Human papillomavirus; CDKN3, cyklin-afhængig kinaseinhibitor 3; FIGO, Fédération Internationale de Gynécologie Obstétrique; GAPDH, glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase; RT-qPCR, Retro transkription-kvantitativ PCR; FC, Fold ændringer; ROC, Receiver Operator Karakteristisk; MW, Mann-Whitney test; HR, Hazard ratio

Introduktion

Livmoderhalskræft (CC) er den fjerde mest almindelige kræftform hos kvinder på verdensplan [1]. Hvert år 530.000 nye tilfælde er rapporteret, hvilket gør det den hyppigste årsag til død ved kræft hos kvinder i udviklingslandene [2, 3]. Humant papillomvirus (HPV) er til stede i næsten 100% af CCS patienterne og betragtes som den vigtigste årsag til udviklingen af ​​CC. Worldwide, HPV 16 er den hyppigst opdaget viral type CC, der findes i ca. 50% af tilfældene, efterfulgt af HPV 18 (15%) [4, 5]. Vacciner for øjeblikket anvendes, er meget effektive til at forebygge infektioner med HPV type 16 og 18. De forhindrer også udvikling af high-grade cervikal intraepithelial neoplasi forbundet med disse vira [6, 7]. da disse vacciner giver beskyttelse mod kun nogle vira og varigheden af ​​immunresponset er ukendt, anbefales det dog, at vaccinerede kvinder fortsat være indskrevet i tidlig påvisning programmer for CC [8, 9]. I mange lande har disse vacciner blevet indarbejdet i vaccinationsprogrammer for piger i alderen 9-12 år [10, 11]. Trods implementering vaccine, den naturlige historie af sygdommen viser, at en indvirkning på livmoderhalskræft forekomst ikke vil blive set i årtier. [10, 12]. Endvidere ifølge fordelingen af ​​HPV type 16 og 18 i forskellige aldersgrupper, omkring halvdelen af ​​kvinder over 50 år med CC ville ikke være beskyttet af sådanne forebyggende vacciner [13]. Derfor er det nødvendigt at forbedre procedurerne for tidlig påvisning og behandling af CC.

Aktuel behandling for CC omfatter kirurgi, kemoterapi, strålebehandling, eller en kombination af disse behandlinger, afhængigt af den kliniske fase af sygdommen. Selvom resultaterne af disse konventionelle fremgangsmåder afhænger af det kliniske stadium af sygdommen, i almindelighed, patientoverlevelse aftager med fase af sygdommen [14]. Mens der er målrettet terapier for mange typer af kræft [15], er der ingen specifikke målrettede behandlinger mod CC. Muterede oncoproteiner, især protein kinaser, er målene for de fleste specifikke for målgruppen kræft narkotika [16]. Desuden er nogle specifikke lægemidler målrette normale proteiner opreguleret i tumorer, såsom HER2 /neu ved brystcancer [17, 18]. Identifikation af opreguleres molekylære mål i CC, som er afgørende for tumorvækst og fraværende i sunde livmoderhalsen, er det første skridt mod udvikling af specifikke mål lægemidler til behandling af CC.

hæmning af mitose er en velkendt strategi til bekæmpelse af kræft [19, 20]. Stoffer, der hæmmer processen med celledeling er sædvanligvis effektiv som anticancermidler. Taxaner og vinca-alkaloider, som inhiberer dannelsen af ​​den mitotiske spindel, er velkendte eksempler på disse lægemidler. Men deres effektivitet er begrænset, fordi de også påvirke mikrotubulus netværk af celler, der ikke deler påvirker endoteliale funktioner og producerer neurotoksiske virkninger.

I et tidligere arbejde viste vi at genet “cyclin-afhængig kinase inhibitor 3 “(

CDKN3

), der er involveret i mitose, opreguleres i CC i forhold til, at der i normal cervikal epitel. Desuden i en foreløbig 3,5 års overlevelse analyse, herunder en lille prøve af CC-patienter (n = 42) positive for HPV 16, de høje ekspressionsniveauer af

CDKN3

er blevet fundet, er forbundet med en kortere patient overlevelse [21 ]. Disse data antyder, at

CDKN3

kan være involveret i tumorudvikling, i det mindste i CC positiv for HPV16. Det vides ikke, om overekspression af

CDKN3

er også forbundet med en overlevelse fald i CC patienter er positive for andre end HPV16 HPV’er.

For at demonstrere endeligt, om overekspression af

CDKN3

er associeret med reduceret overlevelsestid i CC patienter blev en 5-års overlevelsen analyse gennemført i en større prøve (n = 121). Dette omfattede en gruppe patienter var positive for andre end HPV16 HPV’er og en større gruppe af HPV16-positive patienter. Endvidere at undersøge, om

CDKN3

er involveret i carcinogenese proces, vi analyserede effekten af ​​hæmning af

CDKN3

genekspression om spredning, migration og invasion af cellelinjer afledt fra HPV16 -positive (SiHa og CaSki) og HPV18-positive (HeLa) CCS.

Metoder

Patient udvælgelse, studiedesign og endpoints

De forsøgspersoner der indgår 134 patienter diagnosticeret med CC på Institut for Onkologi og 25 kvinder med normal cervikal epitel (eksperimentelle kontroller) evalueret ved Institut for Obstetrik og Gynækologi på Hospital General de México i Mexico City. CC prøver var en delmængde valgt fra i alt 462 patienter med CC, der blev rekrutteret med kriterierne følgende inklusionskriterier: klinisk diagnose af invasiv CC ved Onkologisk Afdeling, ingen tidligere behandlinger, og er født og bosiddende i Mexico med en mexicansk herkomst går tilbage to generationer. Patienter, som opfyldte inklusionskriterierne blev efterfølgende rekrutteret i perioderne fra og med november 2003 til april 2005 og januar 2006 til juli 2007 og udgjorde omkring 80% af patienter diagnosticeret med CC i denne periode. Udvælgelseskriterierne for CC delmængde var baseret på tilgængeligheden af ​​høj kvalitet RNA udvundet af frisk tumor biopsi med mere end 70% tumorceller i den morfologiske analyse og den virale typen positivitet af tumorer. Baseret på kvaliteten af ​​RNA, blev de fleste tilfælde (88%) valgt i anden rekrutteringsperiode. CCs omfattede 90 prøver positive for HPV 16 (42 tidligere rapporterede [21], som blev opdateret med de 5-års overlevelsesdata, og 48 nye prøver analyseret for denne rapport) og 44 positive for andre HPV-typer: 18, 31, 33, 35 , 45, 51, 52, 53, 58, 59, og 68. kvinderne i denne rapport var sammenlignelige med dem udelukket på grund af alder (middelværdi = 50 år), race /etnicitet, histologi, og tumor stadie. Hyppigheden af ​​HPV-typer i denne undergruppe var ikke sammenlignelig med frekvensen i hele prøven [13], da en højere andel af HPV16-positive tumorer blev valgt. De tumorer i CC patienter blev iscenesat i henhold til Fédération Internationale de Gynécologie Obstétrique (FIGO) [22]. To biopsi prøver blev taget fra tumorer i colposcopy undersøgelser. Én prøve blev delt i to lige store dele: én del blev fikseret i pufret formalin i morfologisk analyse og den anden side, sammen med den anden biopsiprøve, var lynfrosset på tøris og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Kontrol- cervikale prøver blev opnået fra patienter, der undergår hysterektomi på grund myomatosis. Løbet og gennemsnitlige alder (49 år) af disse patienter svarede til de patienter med CC. De blev tidligere diagnosticeret med en normal cervix ved cytologi og kolposkopi. Umiddelbart efter en cervikal fragment fra operationsstuen, vi dissekerede de exocervical epitheliums under et stereoskopisk mikroskop for at undgå stromaceller. Kun fire prøver (16%) var positive for HPV, men signalerne var svage. Det primære endepunkt var den 5-årige samlet overlevelse. Undersøgelsen Protokollen blev godkendt af de videnskabelige og etiske komitéer i Hospital General de Mexico (godkendelsesnummer DIC /03/311/04/051) og informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle deltagere forud for deres optagelse.

DNA og RNA-isolering

DNA blev oprenset fra biopsiprøver under anvendelse af en PureLink Genomisk DNA Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og holdt ved -20 ° C indtil analyse. Totalt RNA blev isoleret fra halvdelen af ​​den opdelte biopsi under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Kvaliteten af ​​RNA blev bekræftet med agarosegelelektroforese, som demonstreret ved tilstedeværelsen af ​​intakt ribosomalt RNA, med 28S band to gange så intenst som den 18S-båndet.

Detection og HPV typebestemmelse

påvisning HPV blev udført ved PCR ved hjælp af universelle primere placeret i HPV L1 gener

MY09

/

MY11

,

GP5 +

/

6 +

, og

L1C1

, som tidligere beskrevet [23-25].

HBB

genet blev anvendt som en intern kontrol for at vurdere kvaliteten af ​​DNA. HPV-typerne blev identificeret ved sekventering af de amplificerede bånd ved hjælp af fluorescerende cyklus-sekventering metode (BigDye Terminator Ready Reaction Kit; Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Sekvensanalyse blev udført under anvendelse af en ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer System (Applied Biosystems). Hvert bånd sekventeret blev analyseret med FASTA sekvenslighed værktøjet [13, 26]. Den gennemsnitlige identitet detekterede procentdel af HPV-typer var 98,7% sammenlignet med reference- sekvenser.

Måling af

CDKN3

genekspression ved brug af kvantitativ real-time revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR)

revers transkription af totalt RNA blev udført under anvendelse af High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems) i et totalt volumen på 20 pi. Blandingen omfattede 2 ug RNA, 2 pi 10 x RT-puffer, 0,8 pi 100 mM dNTP’er, 2 pi 10 x RT vilkårlige primere, 1 pi MultiScribe

TM revers transkriptase (5 U /pl), og 1 pi RNase inhibitor (2 U /pl). Reaktioner blev inkuberet ved 37 ° C i 120 min, og derefter opbevaret ved -20 ° C.

CDKN3

genekspression blev målt i 134 CC og 25 sunde cervikale prøver epitel kontrol ved revers transkription-kvantitativ PCR (RT-qPCR) ved hjælp af TaqMan prober.

GAPDH

blev anvendt som intern kontrol. TaqMan genekspression assays blev anvendt (

CDKN3

, Hs00193192_m1;

GAPDH

, Hs02758991_g1, Applied Biosystems). Forsøgene blev kørt tredobbelt i en slutvolumen på 20 pi, hvoraf 200 ng cDNA skabelon, 10 pi 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 pi 20 × TaqMan Gene Expression Assay, og 7 pi RNase-frit vand. Cyklusprogrammet blev kørt i en Rotor-Gene (Corbett Research, Sydney, Australien), der blev fastsat som følger: en indledende PCR aktiveringstrin ved 50 ° C i 2 minutter efterfulgt af 95 ° C i 10 minutter, derefter 40 cykler der smeltede ved 95 ° C i 15 s og annealing /forlængelse ved 60 ° C i 1 min. Måling af genekspression var baseret på relative standardkurver konstrueret ud fra et 10-fold seriefortyndet pulje af CC cDNA’er fra 500 til 0,05 ng. Ekspressionen af ​​

CDKN3

genet blev normaliseret i hver tumor og kontrolprøve til intensiteten af ​​den interne reference (

GAPDH

) under anvendelse af en tidligere beskrevet metode [21]. De normaliserede værdier intensitet blev målt i ng /pl. En normalitet test (Shapiro-Wilk) blev udført for at prøve for en normal fordeling af genekspression data. Fold-change-ekspression blev beregnet ved at dividere den gennemsnitlige normaliserede intensitet af hver tumor prøve ved medianen normaliserede intensitet af kontrolprøverne. Den statistiske signifikans mellem medianerne i tumorer og kontroller blev beregnet med Mann-Whitney (MW) ikke-parametrisk test.

Identifikation af

CDKN3

RNA-varianter under anvendelse af RT-PCR og DNA-sekventering

CDKN3

RNA-varianter blev bestemt i cDNA af 45 tumorer, 22 normal cervikal epitel, og tre cellelinier (CaSki, HeLa, og Siha) under anvendelse af RT-PCR. De anvendte primere til RT-PCR blev beskrevet tidligere [27] eller designet ifølge publiceret varianter sekvenser [28] (S1 tabel). PCR-produkterne blev analyseret ved anvendelse af agarosegelelektroforese og sekventeret ved anvendelse af fluorescerende cyklus-sekventering metode (BigDye Terminator Ready Reaction Kit, Applied Biosystems). Sekvensanalyse blev udført under anvendelse af en ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer System (Applied Biosystems). Sekvenser blev analyseret med FASTA sekvenslighed værktøjet [13, 26], SeqScape software (Applied Biosystems), og ClustalW2 justeringsværktøj (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).

Survival analyse

Ifølge FIGO mellemstationer patienter med livmoderhalskræft modtog individualiseret behandling baseret på retningslinjerne for livmoderhalskræft af American cancer Society (S2 Table) behandling. Efter behandlingen var udført, blev hver patient evalueres klinisk hver 1, 3 eller 6 måneder af en erfaren onkolog. Kliniske data for opfølgende undersøgelse blev opnået fra patienternes journal. Også en socialrådgiver udførte telefonopkald og hjemmebesøg til patienterne hver 6. måned i løbet af undersøgelsen. Kun 121 af 134 patienter udforskes med QRT-PCR blev inkluderet i opfølgende studie, og omfattede 83 prøver positive for HPV 16 og 38 prøver positive for andre HPV-typer, herunder HPV18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 53, 58, 59 og 68. Overlevelse analyse blev udført på alle patienter, der fik behandling og blev fulgt op i mindst 10 måneder. De, der er markeret med en stjerne i S2 tabel ikke modtog behandling (n = 8) eller blev tabt under opfølgningen i de første 10 måneder (n = 5). Den mediane efter tidspunktet for 121 patienter var 64 måneder efter den første diagnose. Status i live blev registreret ved sidste opfølgning, blev død forårsaget af primær tumor af livmoderhalskræft, undtagen tilfældet mærket med to stjerner i S2 tabel (R221), og ukendte sager blev henvist til de patienter, vi mistede styr på deres status før 60 måneders opfølgning (R251, R278, R289 og R379). Disse tabte sager og patienten afdøde fra andre end livmoderhalskræft (R221) årsager blev betegnet som censureret. Censureret og afdøde patienter blev fulgt i det antal måneder, der er angivet i S2 tabel. Patienterne blev anset tabt, når deltog ikke til medicinske aftaler for sygdomsbekæmpelse, ikke blev fundet ved hjemmebesøg eller svarede ikke telefonopkald. Dødsårsagen af ​​alle patienter i follow up blev bekræftet af journal og dødsattest. Foreningen af ​​FIGO, HPV-type og

CDKN3

udtryk med overlevelse blev undersøgt ved overlevelse analyse (se nedenfor i afsnittet af statistisk analyse).

Cellelinjer

CC cellelinier positive for HPV 16 (CaSki, SiHa) og HPV18 (HeLa) blev leveret af Dr. JC Gomora fra Institut for Biofysik for IFC-UNAM, Mexico City. Cellerne blev dyrket med Dulbeccos modificerede Eagles medium (Gibco® DMEM Cat: 12.100-038, Life Technologies, Grand Island, NY) suppleret med føtalt bovint serum (Gibco @ Cat: 16.000-044, Life Technologies) og antibiotisk-antimycotisk opløsning ( Gibco® Cat: 15240-062, Life Technologies) ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. Cellelinier blev bekræftet ved kort tandemgentagelse profilering før eksperimenterne (data ikke vist).

Transfektion af siRNA’er

Forsøgene blev gentaget to gange i tre eksemplarer. I alt 2 × 10

5-celler blev podet i hver brønd af en tolv-brønds plade og dyrket til 60-80% konfluens forud for transfektion. Celler blev transficeret med en blanding af tre specifikke siRNA’er mod

CDKN3 Hotel (

CDKN3

siRNA, sc-43.877) eller kontrol siRNAs, som indeholder tre scrambled sekvenser, der ikke vil føre til den specifikke nedbrydning af enhver ved cellulær mRNA (kontrol siRNA-A, sc-37007) ved anvendelse af siRNA transfektionsreagens (sc-29528) ifølge producentens anvisninger (alle regenter fra Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA). Forskellige koncentrationer af siRNA’er blev undersøgt (80, 100, og 120 nM) for at undersøge den passende koncentration til at inhibere

CDKN3

mRNA i cellelinjer, inkubere cellerne 48 timer efter transfektion.

CDKN3

genekspression blev målt ved RT-qPCR som beskrevet ovenfor.

Immunfluorescensfarvning

CDKN3-proteinekspression blev bestemt i de tre cellelinier transficeret med specifikke

CDKN3

eller scrambled siRNAs ved immunofluorescens. Transficerede celler blev dyrket direkte på dækglas deponeret i pladebrøndene. Celler dyrket 96 timer efter transfektion blev fikseret i absolut ethanol i 20 minutter ved -20 ° C. Derefter blev en opløsning indeholdende 5% bovint serumalbumin i PBS og 0,05% Triton X-100 for celle permeabilisering blev tilsat og inkuberet i 30 min. (. Cat 118.702; ABCAM Biochemicals, Cambridge, MA) Den primære kanin polyklonale antistof mod CDKN3, opnået fra Abcam, blev fortyndet 1: 200 i 5% bovint serumalbumin i PBS og 0,05% Triton X-100. Et samlet volumen på 20 pi sattes til hver dækglas, der blev inkuberet natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Efter vask med PBS blev antigen-antistof-komplekser påvises ved at inkubere dækglassene med 20 pi anti-kanin FITC-konjugeret sekundært antistof (1: 100; ZyMax

TM, Life Technologies Jackson Lab) 2 timer ved stuetemperatur. Cellekerner blev modfarvet med DAPI [4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol, dihydrochlorid] (1: 1000; Invitrogen). Analyser blev udført tre gange. Som vi har rapporteret tidligere [21], i væv lysbilleder af normal cervikal epitel, dette CDKN3 detection system, der involverer primære og sekundære antistoffer, gav ikke noget signal (data ikke vist). Tilsvarende i cellelinje eksperimenter anvendt til at teste specificiteten af ​​systemet, i hvilket det primære antistof ikke var medtaget, detektionssystemet gav ikke noget signal (S1 Fig). Disse data indikerer, at vores system er specifik for CDKN3 proteinpåvisning. Billeder blev set ved 60 × forstørrelse ved hjælp af en konfokal Olympus fluorescens mikroskop (Olympus FV1000, Center Valley, PA), og digitale billeder blev erhvervet med et CCD-kamera. Den grønne fluorescens intensitet blev kvantificeret i 140 områder af hvert forsøg ved hjælp ImageJ software [29].

Immunhistokemi (IH)

Protein udtryk for CDKN3 blev bestemt i 37 CC (22 og 15 positive for HPV16 og andre HPV’er, henholdsvis) og 21 kontrolprøver ved hjælp af immunhistokemi (IH). Fem væv microarrays (TMA) blev bygget med hver indeholder 10-12 CCS og 4-5 kontroller. Assayet blev udført som tidligere beskrevet [21]. Kort fortalt blev TMA afparaffiniseret i xylen og derefter rehydratiseret i rækkefølge med graduerede koncentrationer af alkohol. Det primære antistof mod CDKN3 (sc-475, 1: 100) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antigen-antistof-komplekser blev påvist under anvendelse af avidin-biotin peroxidase metode, med 3,3′-diaminobenzidin-tetrahydrocloride som et kromogent substrat (. Cat KO679 LSAB + Sys /HRP; Dako-Cytomation Carpinteria, CA, USA) og blev snittene modfarvet med hematoxylin. Analyser blev udført tre gange. Den cellulære lokalisering af immunreaktionen blev identificeret, og intensiteten blev scoret 0-4, hvor 0 er angivet nogen farvning og 4 den mest intens farvning.

Western blotting

CDKN3-proteinekspression blev bestemt under anvendelse western blotting i de tre cellelinier transficeret med specifikke CDKN3 eller krypterede siRNA’er. Proteiner blev opnået i radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) lysis reagens (Kat: 89900, Life Technologies). Indholdet af hvert lysat-protein blev bestemt ved anvendelse af et Bradford-proteinassay (Kat: B6916, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) med bovint serumalbumin (BSA) som en standard. En 50-ug prøve af hvert lysat blev opløst på 12% denaturerende polyacrylamidgeler (med 5% polyacrylamid stacking gel) og overført elektroforetisk til en nitrocellulosemembran. Efter blokering med 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand plus Tween (TBST) blev membranen inkuberet med et kanin polyklonalt antihumant CDKN3 antistof (sc-475 Santa Cruz Biotechnology, Inc.) og et monoklonalt muse-antihuman actin antistof (den monoklonalt anti-actin-antistof blev venligst doneret af Manuel Hernámdez, Ph.D, CINVESTAV) natten over ved 4 ° C. Membranen blev derefter inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer (GE Healthcare Bio-Sciences) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med TBST blev de immunoreaktive proteiner udviklet ved hjælp af forbedrede kemiluminescenskittet (GE Healthcare Bio-Sciences).

spredning assay

Forsøgene blev gentaget to gange i tre eksemplarer. Celler transficeret enten med de specifikke siRNA’er mod

CDKN3

mRNA eller kontrol siRNA’er blev podet i hver brønd i fireogtyve-brønds plader og høstet 24, 48, 72, og 96 h efter transfektion. Celleproliferation blev målt med en kolorimetrisk metode baseret på omdannelsen af ​​tetrazoliumsalte til formazan ved dehydrogenase aktivitet i aktiv mitokondrier (Vybrant

® MTT Cell Proliferation Assay Kit, V-13154, Life Technologies). Kort fortalt, efter udskiftning af dyrkningsmediet med 400 pi frisk dyrkningsmedium (Gibco ® DMEM ingen phenolrødt, Life Technologies), 20 pi MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium ) opløsning blev tilsat i hver brønd, herunder negative kontroller uden celler. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 3 timer, derefter alle af dyrkningsmediet fjernet og erstattet med 350μl dimethylsulfoxid (DMSO), blandet forsigtigt, og der inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Pladerne blev aflæst med et spektrofotometer ved 560 nm (BioPhotometer Eppendorf). Cellevækst følger en eksponentiel tendens forudsagt af ligningen y

t = y

0 * e

rx, hvor y

t = absorbans ved bestemt tidspunkt, x = inkubationstid i timer, y

0 = en konstant absorbans ved tid = 0, og r = rate vækst. Cell fordoblingstid (Td) blev beregnet i overensstemmelse med to forskellige metoder: 1) formlen: Td = (t

2-t

1) x [log2 /(log y

t2-log y

t1)], hvor y

t1 er absorbansen ved t

1 (24 h), y

t2 er absorbansen ved t

2 (96 h), og 2) med formlen Td = ln (2) /r. Effekten på dobbeltarbejde blev beregnet ved at dividere fordoblingstiden for de transfekterede celler med specifikke siRNA’er mod

CDKN3

af fordoblingstiden af ​​de transfekterede celler med scrambled siRNA’er.

Invasion og migration analyser

forsøgene blev gentaget to gange i tre eksemplarer. Invasion assay blev udført i en 24-brønds transwell kammer (BD BioCoat ™ Matrigel ™ invasion Chamber # 354.480, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Celler suspenderet i 250 pi serumfrit medium (5,0 x 10

4 celler) blev tilsat til Matrigelcoatede filtre i tredobbelte brønde. I den nederste rum af kamrene 500 pi kvæg-føtal-serum-konditioneret medium blev anvendt som kemo lokkemiddel. Efter 48 timers inkubation ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator blev celler, der invaderede gennem filtrene indsamlet fra det nedre rum og farvet med MTT kolorimetrisk assay beskrevet ovenfor. Migrationen assay blev udført med lignende procedure. Celler blev læsset på Transwell polycarbonat membran indsatser (BD BioCoat ™ Control Indsætter 24-godt, Cat # 354.578, Becton Dickinson) i tredobbelte brønde. Pladerne blev inkuberet i 22 timer ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. De celler, der var migreret til den nedre rum af kamrene blev indsamlet og farvet med MTT kolorimetrisk analyse beskrevet ovenfor.

Statistisk analyse

Den statistiske signifikans af forskelle i

CDKN3

udtryk mellem tumorer og kontroller blev beregnet med Mann-Whitney (MW) ikke-parametrisk test. Receiver Operator Karakteristisk (ROC) kurve analyse blev udført, og blev brugt Youden indeks [21] for at vælge den bedste cut-off point for at skelne tumorer fra død og levende patienter i de tilfældige udvalgte uddannelse sæt, ved hjælp af FC udtryk værdier

CDKN3

gen opnået ved RT-qPCR. Kort sagt, med hele prøvesæt, blev tilfældigt skabt 500 uddannelse sæt 60 prøver. At kategorisere

CDKN3

genekspression data kvantificeret ved QRT-PCR, blev ROC analyse udført i hvert træningssæt. Denne analyse blev udført for at fastsætte en afskæringsværdi til genekspression, der repræsenterede disse værdier med den højeste sensitivitet og specificitet at skelne mellem døde og overlevende patienter. Hele prøvesæt blev derefter analyseret med den gennemsnitlige afskæringsværdi, beregnet ud fra værdierne af de 500 træningssæt. Prøver med

CDKN3

genekspression værdier lig med eller over cut-off blev sat til 1, og dem med værdier under cut-off blev sat til 0.

Den kumulative samlede overlevelsestid blev beregnet ved Kaplan-Meier-metoden og analyseret ved log-rank test. FIGO iscenesættelse,

CDKN3

genekspression og HPV type blev inkluderet i univariate og multivariable Cox proportionel risiko regressions modeller. Den statistiske signifikans mellem de gennemsnitlige forskelle i cellelinjer eksperimenter blev beregnet med t-test. Alle tests var to-sidet, og p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Dataanalyse blev udført under anvendelse Sigma Stat og SPSS ver. 17 software.

Resultater

CDKN3

genekspression i livmoderhalskræft

Box plots (Fig 1A) viser klart, at

CDKN3

ekspression var betydeligt højere i CC end hos raske cervikale væv (FC = 6,4, p = 8 x 10

-6, MW test). Desuden, når cancer prøver blev grupperet efter HPV16 status, en forskel i ekspression, sammenlignet med kontrolgruppen, blev opretholdt i både CC positiv for HPV16 (FC = 6,6; p = 8 x 10

-5, MW) og CC positive for andre HPV-typer (FC = 5; p = 8 x 10

-6, MW) (fig 1A). Selv

CDKN3

ekspression viste sig at blive nedreguleret (FC 1) eller FC-værdien var lig med eller mindre end 1,5 i 10,4% (n = 14) af tumorer, primært fra tumorerne positive for HPV-typer andet end HPV 16 (p 0,05, Chi-square test, fig 1B), understøtter disse data den konklusion, at

CDKN3

udtryk blev øget i de fleste CC uafhængig af HPV-type

udtrykket. af cyclin-afhængig kinase inhibitor 3 (

CDKN3

) blev målt ved RT-qPCR i 25 normale, raske livmoderhalsen prøver og 134 livmoderhalskræft (CC) prøver positive for humant papillomvirus (HPV) 16 (n = 90) eller for andre HPV-typer (n = 44), herunder 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 53, 58, 59, og 68. (A) Intensitet af genekspression, udtrykt i log2 værdier i box plots . De øvre og nedre grænser for kasserne repræsenterer den 75. og 25. percentil, hhv. De sorte og stiplede linjer i kasserne repræsenterer median og gennemsnit henholdsvis og knurhår repræsenterer minimum og maksimum værdier, der ligger inden for 1,5x den interkvartile afstand fra enden af ​​kassen. Værdier uden for dette område er repræsenteret ved sorte cirkler. Fold-change (FC) blev beregnet ved at dividere medianen af ​​hver CC gruppe ved medianen for kontrolgruppen. Statistiske forskelle mellem grupper blev beregnet under anvendelse af ikke-parametriske Mann-Whitney U test. (B) Frekvens (%) fordeling af

CDKN3

FCS, som blev beregnet i hver tumor overvejer medianen af ​​kontrolgruppen.

Foreningen af ​​

CDKN3

genekspression, klinisk fase og viral type med overlevelse

Vi undersøgte, om opregulering af

CDKN3

blev forbundet med nedsat overlevelsestid i 121 CC patienter, og hvis eventuelle virkninger på overlevelse var afhængig af klinisk fase og HPV type. At etablere en skillelinje mellem døde og levende patienter og den potentielle værdi af

CDKN3

udtryk som en markør for overlevelse, blev en gennemsnitlig cut-off FC beregnes ved hjælp af ROC-kurver (se Materialer og metoder). Den gennemsnitlige afskæringsværdi opnåede FC = 17. Af de 121 prøver, 83 var positive for HPV 16 og 38 for andre HPV-typer (S2 Table). Den gennemsnitlige tid for follow up var 64 måneder fra den oprindelige diagnose. Kliniske faser (Figo) af de 121 patienter var IA1 (n = 1), IB1 (n = 35), IB2 (n = 29), IIA (n = 7), IIB (n = 35), IIIB (n = 9 ), og IV (n = 5). Den samlede overlevelse af alle patienter var 71,9% og for Figo kliniske stadier IA1 /IB1, IB2, IIA, IIB, IIIB og IV var 94,4%, 79,3%, 57,1%, 57,1%, 55,6% og 20%, hhv. Disse forskelle var statistisk signifikante (p = 1,2 x 10

-6, log-rank test, S2A Fig).

De patienter med høj ekspression af

CDKN3

gen (FC ≥ 17