PLoS ONE: leuprorelinacetat langvarig Virkninger på GnRH receptorer på prostatakræft celler: en atomic force mikroskopi Undersøgelse af agonist /receptor Interaction

Abstrakt

Høj celle-overflade GnRH receptor (GnRH-R) niveauer har vist sig at have stor indflydelse på omfanget af GnRH-agonist-medieret inhibering af tumorvækst. Evnen af ​​GnRH-agonisten leuprorelinacetat (LA) for at inducere en post-transkriptionel opregulering af GnRH-R på plasmamembranen af ​​androgen-sensitive (LNCaP) og -insensitive (PC-3) prostatacancer (PSA) celler tidligere har været demonstreret ved Western blotting. Her udførte vi enkelt molekyle force spektroskopi ved at bruge Atomic force mikroskopi (AFM), som har vist sig at være et effektivt redskab der giver mulighed for undersøgelse af levende celle overflade biologiske funktioner, såsom den hidtil uklare GnRH-agonist /receptor interaktion. Således i hormon-ufølsomme PC-3-celler, vi kendetegnet styrken af ​​LA-receptorbindingsstedet, og mængden og fordelingen af ​​de funktionelle receptormolekyler på celleoverfladen. Effekten af ​​en lang og kontinuerlig behandling (op til 30 dage) med agonist (10

-11 og 10

-6 M) på de samme parametre blev også undersøgt. En GnRH-R stigning blev observeret, og nåede det maksimale (-80%) efter 30 dages behandling med den højeste dosis af LA (10

-6 M). Analog-inducerede stigning i GnRH-R blev også demonstreret ved Western blotting. Desuden blev to forskellige receptor bundet styrker opdaget af AFM, hvilket tyder på eksistensen af ​​to GnRH-R klasser. En homogen fordeling af de uforpligtende begivenheder har fundet på ubehandlede og behandlede PC-3 celleoverflader. Den vedvarende høje receptor niveauer på membranen af ​​disse levende celler kan berettige opretholdelsen af ​​reaktion på LA også i androgen-reagerer PCa. Desuden kunne bestemmelsen af ​​ligand /receptor vedhæftningsstyrke belyse dårligt forstået tilfælde af LA /GnRH-R interaktion og /eller behandle strukturelle /kemisk agonist optimeringer

Henvisning:. Lama G, Papi M, Angelucci C, Maulucci G, Sica G, De Spirito M (2013) leuprorelinacetat langvarig Virkninger på GnRH receptorer på prostatakræft celler: en atomic force mikroskopi Undersøgelse af agonist /receptor Interaktion. PLoS ONE 8 (1): e52530. doi: 10,1371 /journal.pone.0052530

Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italien

Modtaget: December 29, 2011; Accepteret: November 19, 2012; Udgivet: 9 januar 2013

Copyright: © 2013 Lama et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Takeda Italia Farmaceutici SpA delvist støttet dette arbejde. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. I 2010 Takeda Italia Farmaceutici SpA gav forfatterne en frivillig donation til støtte for videnskabelig forskning af deres institut, ikke specifikt relateret til dette arbejde. Forfatterne angav navnet på virksomheden i retfærdighed. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

gonadotropin-releasing hormon (GnRH), et decapeptid udskilles i en pulserende måde ved hypothalamus neuroner, styrer gonadotropin syntesen og frigivelse ved at aktivere receptorer (type i GnRH-R) udtrykt på hypofyseforlapceller. Den nedregulering og desensibilisering af disse hypophyseal receptorer ved kontinuerlig administration af GnRH agonistiske analoger udgør begrundelsen for den kliniske anvendelse af disse hormoner i terapien af ​​endokrine kræft, da det fører til gonadal steroid undertrykkelse [1] – [3]. Fundet af GnRH /GnRH-R-ekspression i disse tumorer, samt i ikke-maligne væv [4] – [7], frigivet muligheden for celler i extrapituitary væv, der skal direkte berørt af GnRH-analoger. Forskellige studier har vist den inhiberende virkning af GnRH-agonister på væksten af ​​forskellige neoplasmer, herunder prostatacancer (PSA) celler [6], [8] – [14]. Alligevel rapporterede nogle forfattere, at GnRH-agonister er ineffektive, når de anvendes alene, mens modvirke eller endda undertrykke hormon- eller vækstfaktor-stimuleret celleproliferation [15] – [19]. Desuden har de vist, at disse forbindelser er i stand til at modulere PSA ekspression samt ekspressionen af ​​adskillige gener /proteiner regulerer vækst og differentiering, apoptose eller celle /celle-adhæsion [20] – [23]. For nylig blev virkningerne af GnRH-agonistisk analog leuprorelinacetat (LA) på ekspressionen af ​​GnRH-R undersøgt ved Western blotting i to humane PCA cellelinier: androgen-sensitive, veldifferentierede og lave invasive LNCaP-celler og androgenet -insensitive, ringe differentierede og yderst invasive PC-3-celler [24]. I disse to modeller, den analoge ved både lave og høje koncentrationer er effektiv til at inducere en post-transkriptionel forøgelse af receptorekspression på membranen niveau plasma, efter 4, 6 og 12 dage af en kontinuerlig behandling.

stigningen i receptor tilgængelighed på celleoverfladen kunne være en relevant terapeutisk problem, da det kan berettige opretholdelse af reaktionen på agonistterapi [25]. Det kan endvidere give mulighed for udvikling af nye terapeutiske strategier, som især er vigtig for de tumorer, som enten ikke reagerer eller udvikle resistens over for endokrin behandling. Faktisk, selv om det er hårdt vanskeligt at forudsige PCA celle adfærd

in vivo

, er det presumable at selv i hormon-reagerer PCa kan agonisten administration give en gavnlig resultat også på grund af den direkte effekt .

i den foreliggende papir, udførte vi enkelt molekyle kraft spektroskopi ved hjælp af atomic force mikroskopi (AFM) med det formål at karakterisere styrken af ​​LA-receptorbinding, og mængden og fordelingen af ​​den funktionelle receptor molekyler ved androgen-reagerer PC-3 celleoverfladen. Vi demonstrerede også virkningen af ​​en lang og kontinuerlig behandling med agonisten om de samme parametre. AFM faktisk muliggør påvisning af dynamiske ændringer i de mekaniske egenskaber af levende celle overflade [26], [27], samt målinger i luft eller væske af ufarvede og uovertrukne biologiske prøver i kontrollerede miljøer og i nanoskala opløsning [28] – [31], uden krav om nogen særlig behandling, der kan resultere i celle ødelæggelse eller ændring. Desuden enkelt molekyle kraft spektroskopi giver en enestående mulighed for at opdage molekylær genkendelse mellem individuelle ligander og receptorer. Da vedvarende høje receptor niveauer på plasmamembranen efter en relativt lang og kontinuerlig behandling med GnRH-agonist kan forbedre effektiviteten af ​​LA i androgen-reagerer PCa, undersøgte vi virkningen af ​​agonisten ved lave og høje koncentrationer i PC-3-celler i op til 30 dage. Spændende information om hidtil uklare GnRH-agonist-receptor interaktion kan stamme fra studiet af styrken, som en sådan binding forekommer, og tage fat på de strukturelle /kemiske optimeringer af den analoge.

Materialer og metoder

Cell linjer og dyrkningsbetingelser

De humane hormon-ufølsom PC-3 celler [32] blev venligt doneret af Prof F. Labrie (Laval University, Quebec, Canada). Celler blev rutinemæssigt dyrket på 25 cm

2 celle kultur flasker i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Euroclone SpA, Milano, Italien), suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS, Euroclone), antibiotika (100 IE /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, Euroclone), 10 mM Hepes-buffer-opløsning (Euroclone), 1 mM natrium piruvate (Euroclone) og 2 mM L-glutamin (Euroclone). Salg

humane embryoniske nyreceller (HEK293 ) ikke udtrykker nogen endogene GnRH-R blev venligst stillet til rådighed af Prof RP Millar (Medical Research Council menneskelige reproduktive Sciences Unit, Dronningens Medical Research Institute, Edinburgh, UK), der opnåede dem fra American Type Tissue Culture Collection. HEK293-celler stabilt transficeret med GnRH-R (HEK293

[SCL60]) var en gave fra Prof. R. P. Millar og blev genereret i sit laboratorium [33]. HEK293 og HEK293

[SCL60] celler blev anvendt som negativ og positiv kontrol for GnRH-R-ekspression, hhv. Celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS, antibiotika (100 IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin), 10 mM Hepes bufferopløsning, 1 mM natrium piruvate og 4 mM L-glutamin.

alle cellelinier blev inkuberet i en fugtig atmosfære af 5% CO

2-95% luft ved 37 ° C.

Cell behandlinger

cellerne blev podet ved en densitet på 25.000 celler /ml standard dyrkningsmedium i 40-mm TPP skåle (Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz). Når de levet op til de kultur- plader (efter 24 timer), blev mediet fornyet med DMEM suppleret med 5% trækul-behandlet FBS (CH-FBS) og 10

-6 M eller 10

-11 M LA ( venligst doneret af Takeda Pharmaceutical Company Limited, Osaka, Japan).

mediet blev skiftet hver 48 h, mens LA blev tilføjet dagligt til kulturerne. PC-3 celler blev udsat for det analoge til 6, 12, 18, 24 og 30 dage.

Hvert halve dage, blev cellerne trypsiniseret, seedet (25.000 celler /ml) ind i de 40-mm TPP retter og , når de klæbes til dyrkningspladerne, behandles som beskrevet ovenfor for en yderligere periode på 6 dage. Ved slutningen af ​​hver behandlingsperiode blev cellerne analyseret ved AFM. I alle eksperimenterne blev kontrolkulturer kørt parallelt.

Atomic force mikroskopi (AFM)

Alle målingerne blev udført ved anvendelse af et atomic force mikroskop

Nanowizard II

( JPK Instruments, Berlin, Tyskland) kombineret med et optisk mikroskop

Axio Overhold

(Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Alle akkvisitioner blev opfyldt i en PBS-opløsning (pH = 7,4), under en kontrolleret temperatur på 37 ° C.

AFM Probe Forberedelse

For at undersøge specifikke interaktioner mellem LA og GnRH- R på overfladen af ​​PC-3-celler, blev de analoge molekyler immobiliseret på AFM tips. Rektangulære bløde siliciumnitrid microcantilevers med UltraSharp koniske tips med en radius på ~ 10 nm belagt på begge sider med guld (CSC16, MicroMash, San Jose, CA) og kalibreret som rapporteret af Papi et al. [34] blev anvendt.

Før immobilisering blev microcantilevers vasket i chloroform for at fjerne olier og grove kontaminanter og derefter udsat i 20 minutter til en UV-ozon renere for at fjerne organiske og andre oxiderbare overfladeforurening.

immobilisering procedure det analoge molekyle, en ofte anvendt metode til spids funktionalisering med et ligandmolekyle [35], er baseret på anvendelsen af ​​en 8 nm langt fleksibelt tværbinder (pyridyl dithio-Polyethylenglycol-succinimidylpropionat, PDP -PEG-NHS, Polypure). Den rene cantilever blev straks nedsænket i en PDP-PEG-NHS /chloroformopløsning i 3 timer (koncentration linker: 2 mg /ml) og derefter, efter to skylletrin i chloroform og én i PBS, behandlet med en dråbe LA-opløsning ( 2 mg /ml) natten over.

Efter funktionalisering, cantilevere blev grundigt vasket tre gange i pufferopløsning og derefter opbevaret ved 4 ° C under sterile betingelser for yderligere anvendelse i eksperimenterne. Opbevaring tid var altid 1 uge. Enhver væsentlig ændring i LA /GnRH-R interaktion blev observeret i denne periode. Før bliver brugt, blev fjederkonstanten for hver cantilever kalibreres med den termiske metode [36].

Atomic force Spektroskopi

At udforske enkelt molekylære interaktioner, dissociationsprocessen af ​​et tip bundet ligand fra en celleoverflade-bundet receptor blev undersøgt ved at påføre en trækkraft til ligand-receptor-komplekset, indtil bindingen mellem ligand og receptor brød. Interaktion kræfter tip-bundne ligander og overflade immobiliserede receptorer blev målt i kraft-distance cykler. Ved en fast position, blev spidsen nærmede til celleoverfladen og derefter trækkes tilbage efter et bestemt tidsinterval (0,5 s), medens bøjning af cantilever blev observeret. Under denne cyklus, bøjningen af ​​udliggeren, som er proportional med den kraft, blev kontinuerligt målt og afbildet imod spids-overflade separation (dvs. afstand). To repræsentative kraft afstande kurver er rapporteret i fig. 1, når ligand /receptor-interaktioner ikke detekteres (sort firkant), og når en ligand /receptor-interaktion detekteres (røde cirkler). I begyndelsen af ​​spidsen-overfladen tilgang, cantilever deformation forbliver nul. Ved tip-overflade kontakt, den cantilever bøjer opad, i overensstemmelse med en frastødende kraft, der stiger med indrykningen. Efterfølgende tip-overflade tilbagetrækning (fig. 1) først medfører afslapning af cantilever bøjning indtil frastødningskraft falder til nul. Ved yderligere tilbagetrækning, hvis vekselvirkningen mellem liganden og receptoren forekommer, udliggeren progressivt bøjer nedad, hvilket afspejler en tiltrækningskraft, der stiger med stigende tip-overflade separation (fig. 1, røde cirkler). I hvert enkelt eksperiment, for hvert tidspunkt blev ~1000 kraft-afstande kurver udført.

To typiske kraft afstande kurver når interaktioner ikke opdages (sort firkant), og når der registreres interaktioner (rød cirkel). Den uforpligtende begivenhed (eller brud point) er fremhævet ved hjælp af den grønne pil.

Western blot-analyse

plasmamembran-berigede fraktioner blev fremstillet ud fra 6-dages dyrkede PC-3 , HEK293 og HEK293

[SCL60] -celler, ifølge protokollen beskrevet af Limonta et al. [37]. Samme fremgangsmåde blev brugt på PC-3 celler ubehandlede eller behandlet med LA (10

-6 M eller 10

-11 M) til 6, 12, 18, 24 og 30 dage. Prøver blev homogeniseret i 10 mM Tris-HCI (pH 7,6) indeholdende 1 mM dithiothreitol på is. Homogenaterne blev centrifugeret to gange i 10 minutter hver ved 800

g

at fjerne cellerester og de resulterende supernatanter blev centrifugeret ved 18.000

g

til pelletering ned membranen fraktioner. Pelleterne blev solubiliseret i RIPA-buffer [50 mM Tris-HCI (pH 7,7), 150 mM NaCl, 0,8% Triton X-100, 0,8% natriumdeoxycholat, 0,08% SDS, 10 mM EDTA, 100 pM Na

3VO

4, 50 mM NaF, 0,3 mM PMSF og 5 mM iodeddikesyre]. Proteinprøver (100 ug /bane) blev elektroforesebehandlet på en 10% polyacrylamidgel under reducerende betingelser. Proteiner blev derefter elektroblottet på en polyvinylidendifluoridmembran (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA, USA), som blev probet (natten over, 4 ° C) med det monoklonale muse-anti-GnRH-R antistof (Lab Vision Corporation, Fremont, CA, USA) (1:100) i TBS indeholdende 0,02% Tween 20 (TBS-T) og 5% fedtfri tørmælk (blokerende buffer). Blottet blev derefter overlejret med HRP-mærket sekundært antistof (Vector, Burlingame, CA, USA; 1:5,000) i 40 min i blokeringspuffer ved stuetemperatur. Proteinbåndene blev detekteret ved anvendelse af et forøget kemiluminescens-system (ECL, Amersham, Buckinghamshire, UK) og visualiseret på Hyperfilm ECL (Amersham). Membraner blev testet igen med et anti β-actin mAb (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; 1:10,000) som en intern kontrol for protein loading. Signalerne blev kvantificeret ved densitometri (Chemi Doc Documentation System /Mængde One kvantificering software, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Densitometriske enheder af proteinet af interesse blev derefter korrigeret for densitometriske enheder af β-actin. Det specifikke protein /β-actin-forhold fra hver behandlet prøve blev divideret med værdien opnået under kontrolbetingelser at finde gange ændring i GnRH-R niveau.

Statistisk analyse

Data blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligningstest. En værdi på p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

GnRH-R kvantificering og bindende styrke i ubehandlede PC-3 celler

I fig.. 2A en repræsentativ fordeling af uforpligtende begivenheder (~1000 force-distance cyklusser med en hastighed på 2 um /s) opnået på ubehandlede PC-3-celler efter 6 dage er vist. Den bimodal fordeling er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​to, godt indlysende toppe, hver udvindes ved en gaussisk pasform. Den første top (lilla linje) blev detekteret ved en lavere kraft (f~37 pn), mens den anden (grøn linje) ved en højere kraft (f~65 pn). Tilstedeværelsen af ​​disse to toppe antyder eksistensen af ​​to forskellige interaktioner. Fra bimodal fordeling, en samlet uforpligtende sandsynlighed (til dvs. sandsynligheden optage et uforpligtende begivenhed fra en enkelt kurve kraft-afstand) på ca. 13% blev opnået (fig. 2A, blå linje). Den bimodale fordeling sammen med den uforpligtende sandsynlighed ikke ændre i op til 30 dage (data ikke vist).

Fordeling af uforpligtende begivenheder opnået ved en belastning på 2 um /si ubehandlede (A) og LA ( 10

-6 M) -behandlede (B) PC-3 celler efter 30 dage kultur og i HEK293

[SCL60] celler (C). Frekvens svarer til antallet af begivenheder. I begge ubehandlede og LA-behandlede PC-3-celler er tydeligt påvises og kvantificeres ved hjælp af to Gauss-fordeling kurver (lilla og grøn stiplede linjer) en bimodal fordeling (blå linie). Den første top blev detekteret ved en lavere kraft (f~37 pn), medens den anden ved en højere kraft (f~65 pn). I HEK293

[SCL60] celler uforpligtende begivenheder på højere kræfter er mindre hyppige.

For at vurdere mængden af ​​mulige ikke-specifikke uforpligtende begivenheder grund af den særlige spids funktionalisering procedure og følsomhed vores tilgang, vi udførte de samme kraft spektroskopi eksperimenter på HEK293 og HEK293

[SCL60] celler. Som forventet i vildtype HEK293 celler blev fundet meget få tip /prøve interaktioner (-3%). Tværtimod i GnRH-R-udtrykkende HEK293

påvistes [SCL60] -celler flere tip /prøve interaktioner (~59%). Interessant nok i disse celler den bimodale fordeling af uforpligtende kræfter var ikke indlysende, da de uforpligtende begivenheder på større kræfter (-65 PN) er klart mindre sandsynlig forhold til de mere hyppige uforpligtende begivenheder ved lavere kræfter ~37 PN (fig. 2C).

GnRH-R kvantificering og bindende styrke i behandlede PC-3 celler

En stigning i agonist /GnRH-R uforpligtende hændelser blev observeret i PC-3 celler under 30 dages eksponering til LA (10

-6 M eller 10

-11 M) (fig. 3A). Forstærkningen kunne detekteres på alle tidsintervallerne betragtes (fra 6

th til 30

th dag; p 0,001), og det nåede den maksimale værdi af -80% i forhold til kontrol efter 30 dages behandling med den højeste dosis af analogen. En statistisk signifikant forskel blev altid fundet i effekten udløst af de to lægemiddelkandidater koncentrationer, med den højeste dosis er mere effektive til at fremme stigningen.

(A) histogrammer for LA /GnRH-R uforpligtende begivenheder i LA- behandlede PC-3-celler. I hver måling udføres hver 6 dage,, optællingen er normaliseret til den, der opnås med ubehandlede celler (kontrol) sat til 1. Kolonner, betyder; barer, SD. * P 0,001

vs

kontrol,

• p 0,001

vs

10

-6 M LA (envejs ANOVA og Tukey s multiple sammenligning tests). (B) Modellering af GnRH-R rate ekspression. Mængden af ​​uforpligtende begivenheder detekteret i PC-3-celler behandlet med 10

-6 M LA (blå diamanter) eller 10

-11 M LA (røde firkanter) blev normaliseret til mængden af ​​uforpligtende begivenheder i ubehandlede celler ( kontrol) sat til 1. Gompertz kurve blev tilpasset til både de eksperimentelle data (blå eller røde linjer). De GnRH-R stigningstakter var klart forskellige [(9,3 ± 0,1) dag

-1 for 10

-6 M LA og (6,1 ± 0,1) dag

-1 for 10

-11 M LA] men havde en tendens til den samme værdi (1,9 ± 0,1) ved lange tider (ud over den 30

th dag). Data er givet som middelværdi ± SD fra to uafhængige forsøg.

Den samme bimodal distribution (med én pick på f~37 pN og en anden på f~65 PN) påvist i ubehandlede PC-3 celler var observeret i LA-behandlede celler over tid (fra 6

th til 30

th dag), uanset behandlingen administreres til cellerne. I fig. 2B, en repræsentativ fordeling af uforpligtende begivenheder opnået ved en hastighed på 2 um /si PC-3-celler behandlet i 30 dage med 10

-6 M LA illustreret. Den blå kurve viser den bimodale fordeling af uforpligtende begivenheder og en samlet uforpligtende sandsynlighed på omkring 22%.

Modellering af GnRH-R rate udtryk på PC-3 celler

For at kaste lys over den specifikke dynamiske beskriver stigningen i de eksponerede receptorer, sammenlignede vi forskellige mængder af receptorer opnået under behandlingstiden ved de to analoge anvendte koncentrationer (fig. 3B). De stigningstakter var klart forskellige, men havde en tendens til den samme værdi ved lange gange (ud over 30

th dag). Denne adfærd kan parallel til dem observeret i tumorceller, hvor deres vækst er begrænset af den begrænsede plads, hvor cellerne er begrænset og af tilgængeligheden af ​​næringsstoffer, som modelleret af Gompertz kurven [38]: hvor X (t) repræsenterer antallet af GnRH-R, X (0) receptoren nummer ved startpunktet observationstiden (her normaliseret til en), K det maksimale antal receptorer, der kan udtrykkes på celleoverfladen og a en konstant karakteriserer stigningstakten GnRH-R .

Figur 3B viser de bedste tilpasning kurver til de eksperimentelle data opnået for PC-3 celler udsat for 10

-6 M (rød linje) eller 10

-11 M (blå linje) LA. I begge tilfælde, den bemærkelsesværdige kvalitet pasform tillader genvinding af receptor tilvækst sats og plateau værdier. Plateauet værdi (K = 1,9 ± 0,1) var den samme ved begge LA anvendte koncentrationer. Eftersom K blev sat til 1 for ubehandlede prøver, plateauet opnåede værdi indikerer, at receptoren nummer i LA-behandlede PC-3-celler kan øges op til 90% sammenlignet med ubehandlede celler, uafhængigt af agonisten anvendte koncentration. På den anden side, blev stigningstakten stærkt påvirket af LA koncentration [α = (9,3 ± 0,1) dag

-1 for 10

-6 M LA og α = (6,1 ± 0,1) dag

– 1 for 10

-11 M LA], således den højere koncentration jo hurtigere GnRH-R-ekspression.

Topografisk fordeling af de bindende steder i

​​Et todimensionale kort over uforpligtende begivenheder udført over celleoverfladen fremlægger en klar visualisering af GnRH-R rumlige fordeling (fig. 4). Uforpligtende begivenheder på kraft 50 PN (. Svarende til den første top af bimodal fordeling i figur 2A) er repræsenteret i blå, mens dem i intervallet 50-100 PN (svarende til den anden top i figur 2A.) , med rødt. Den rumlige fordeling af GnRH-R over PC-3 celleoverfladen vises homogen. Behandlinger med agonisten påvirkede ikke receptoren rumlige fordeling (fig. 5) samt tidsintervallerne men steg receptorniveauet. Sjældent blev nogle klynger fundet (data ikke vist).

(A) Et repræsentativt billedet i høj opløsning af PC-3 cell overfladeareal anses for receptoren kortlægning. (B) En repræsentant LA /GnRH-R uforpligtende kraft map opnået på PC-3 celler behandlet i 30 dage med 10

-6 M LA. I blå er repræsenteret uforpligtende begivenheder på kraft 50 pN mens i rødt dem ved kraft i intervallet 50-100 pN

Den homogene fordeling af receptormolekyler var ikke påvirket af behandlingen. med den analoge (10

-6 M) og ikke variere gennem tidsintervaller. I blå er repræsenteret uforpligtende begivenheder på kraft 50 pN mens i rødt dem ved kraft i intervallet 50-100 pN

GnRH-R kvantificering af Western blot analyse

Western blot-analyse af GnRH-R-udtrykkende celler (HEK293

[SCL60]) viste en klar bånd ved ca. 60 kDa, den molekylære masse af type i hypofyse receptor rapporteret i litteraturen [39]. PC-3-celler viste en mindre intenst bånd ved den samme position. En ubetydelig signal blev detekteret i ikke-transficerede HEK293-celler (figur 6A.)

(A) Western blot-analyse af GnRH-R i:. PC-3-celler, HEK293-celler (som ikke udtrykker GnRH-R) og HEK293

[SCL60] -celler (stabilt transficeret med GnRH-R) efter 6 dages dyrkning. (B) Western blots viser LA-udløste forøgelse af GnRH-R i PC-3-celler behandlet i 6-30 dage med analog (10

-11 eller 10

-6 M). Repræsentative blots fra to separate eksperimenter hvilket gav lignende resultater er vist. (C) grupperede densitometriske data for Western blot-analyse af GnRH-R. Intensiteten af ​​signalerne blev kvantificeret ved densitometrisk scanning og normaliseret til den for β-actin (anvendt som en loading kontrol). Dataene er forholdet mellem værdierne af behandlede og ubehandlede prøver (kontrol, sat til 1), og de er vist som middelværdi ± SD af 2 uafhængige eksperimenter. * P 0,001

vs

kontrol,

• p. 0,001

vs

10

-6 M LA (envejs ANOVA og Tukey s multiple sammenligning tests)

I PC-3 celler, en 6-30 dages behandling med både LA koncentrationer (10

-11 og 10

-6 M) inducerede en statistisk signifikant stigning (fra 70% til 110 %, p 0,001) i receptor niveauer (fig 6B og 6C), understøttende data fra atomic force spektroskopi.. Selvom den højeste LA dosis syntes at være mere effektiv til at fremme GnRH-R stigning, var statistisk signifikans ikke altid nået (fig. 6C).

Diskussion

De direkte extrapituitary virkninger af GnRH-analoger kan betragtes som resultatet af en kompleks mosaik af molekylære begivenheder, der nødvendigvis er afhængig af mængden af ​​GnRH-R-molekyler findes på celleoverfladen og den aktiverede signalvej, som begge kan variere fra væv [4], [40].

Knappe oplysninger om virkningerne af GnRH-analoger på GnRH-R. De fleste af de offentliggjorte undersøgelser af virkningen af ​​GnRH-agonister på GnRH-R-ekspression er blevet udført på

in vitro

og

in vivo

hypofyse-modeller. I disse undersøgelser syntes de observerede virkninger er strengt afhængig administrationen modalitet, hvor en kort eller pulserende eksponering for agonisten førte til en opregulering af receptoren niveauer hvorimod kontinuerte og langvarige behandlinger bestemt en nedsættelse eller venstre dem uændret [41] – [43]. I PCa, er rapporteret meget heterogene resultater. En immunhistokemisk undersøgelse beskrev en GnRH-R fald i PSA-prøver fra patienter, som gennemgik en 3-måneders lange neoadjuverende hormonterapi med leuprolid og antiandrogenet bicalutamid, sammenlignet med immunoreaktivitet observeret i prøver fra ubehandlede patienter [44]. Dette resultat blev tilskrevet af forfatterne til binding af analogen til PCA-celler. Også i DU-145 xenotransplanteret PCAS, en agonist-induceret mindre fald i GnRH-R-niveauer blev beskrevet, mens der ikke væsentlige variationer blev observeret i de receptor mRNA-niveauer [45]. Lignende resultater blev opnået, når PCA-celler og fibroblaster, isoleret fra patienters prøver blev dyrket sammen og udsat for leuprolid [46]. På den anden side blev en kraftig stigning i GnRH-R mRNA beskrevet i rotte prostata efter 28 dages behandling med goserelin [43]. I denne sammenhæng har vi observeret ved Western blotting, at LA var i stand til at inducere en post-transkriptionel opregulering af membran GnRH-R efter 4, 6 og 12 dages behandling i androgen-ufølsom, stærkt invasive og dårligt differentieret PC-3-celler [24 ].

med det formål at få indsigt i de funktionelle egenskaber af GnRH-R eksponeret på celleoverfladen, og derfor aktivt involveret i agonist-receptor signalering, en AFM tilgang på levende PC-3 celler var vedtaget for første gang i den foreliggende undersøgelse. Virkningerne af en lang og kontinuerlig behandling med LA om afgørende aspekter af membranen GnRH-R (dvs. mængden af ​​de uforpligtende begivenheder, styrken af ​​analog-receptor-binding og receptor distribution) blev undersøgt.

Ved at påvise beløb og styrken af ​​vekselvirkningen, vi demonstreret evne af hormonet til at øge ekspressionen /tilgængeligheden af ​​GnRH-R på PC-3 celleoverfladen, når den kontinuerligt administreres til cellerne, med en maksimal stigning på -80% efter 30 dages behandling med den højeste dosis af LA.

i den forbindelse undersøgte vi også kinetikken for GnRH-R eksponering i PC-3-celler behandlet med høje og lave agonist koncentrationer. Kinetics blev analyseret ved at montere Gompertz kurve, en logistisk kurve bredt vedtaget at beskrive befolkningstilvækst i flere biologiske systemer. Den Gompertz kurve godt genopretter den tidsafhængige forøgelse af GnRH-R på celleoverfladen. Ifølge denne model, hastigheden af ​​ekspression af GnRH-R i LA-behandlede celler afhænger af den agonist anvendte koncentration, hvorimod den asymptotiske værdi er uafhængig af LA koncentration og relateret til de specifikke cellekarakteristika og eksperimentel betingelse anvendes. Dette beviser, mens klart oprettelse forekomsten af ​​en LA-udløst langvarig opregulering af sin egen receptor på celleoverfladen, giver mulighed for påvisning af den maksimale mængde af receptorer, at cellen kan udtrykke. Sidstnævnte fund muliggør finjustering af dosis /effekt-forhold ved at ændre LA koncentration. I overensstemmelse med de ovenstående resultater er data fra immunoblotanalyse af membran GnRH-R udført på PC-3-celler behandlet i 6-30 dage med analog, som klart viste LA virkningsfuldhed til at inducere en signifikant opregulering af receptoren, som tidligere påvist af den samme teknik indtil 12 dages behandling [24]. Western blot fund enig med AFM data som den højeste LA dosis syntes at være mere effektive i at fremme GnRH-R stigning, selv om statistisk signifikans ikke altid nået. Dette kan skyldes, at de iboende forskelle mellem de to metoder.

Som for de mekanismer, der er ansvarlige for den analoge-induceret receptor ekstraudstyr, forskellige funktionelle parametre kan være involveret i fastsættelsen af ​​receptorer til rådighed på plasmamembranen. Vores tidligere undersøgelse vedrørende LA-inducerede opregulering af GnRH-R på PC-3 celleoverfladen vist, at denne virkning forekom ved en post-transkriptionel niveau [24]. Således er det tænkeligt, at agonisten kan handle forøge translation hastigheden af ​​receptoren transkriptet og /eller forsinke proteinnedbrydning. På basis af litteraturen, er det også muligt at spekulere i, at en af ​​de involverede mekanismer kan repræsenteres af agonist evne til at fremme GnRH-R udgang fra det endoplasmatiske reticulum (ER) derfor begunstige receptoren anterograd trafficking, inden intracellulær transport vesikler, til plasmamembranen. Dette ville stemme overens med den observation, at andre syv transmembrane (7TM) receptorer, såsom A-opioid peptid-receptorer, der er bredt gemt i ER, sendes til celleoverfladen som respons på aktivering af en lille subpopulation af membranreceptorer [47 ]. Siden 7TM-receptorer også gennemgå retrograd transport fra celleoverfladen via endosomer, en alternativ mulig forklaring er, at GnRH-R-aktivering kunne hæmme receptorinternalisering, at for type I pattedyr GnRH-R vides at forekomme meget langsomt [48].