PLoS ONE: Identifikation af en cirkulerende MicroRNA Signatur for tarmkræft Detection

Abstrakte

Prognose for patienter med colorectal cancer (CRC) er generelt dårlig på grund af manglen på enkle, passende, og invasive værktøjer til CRC detektion ved den tidlige fase. Opdagelsen af ​​microRNA (miRNA) og deres forskellige udtryk profiler mellem forskellige former for sygdomme har åbnet en ny vej for tumor diagnose. Vi byggede et serum microRNA udtryk profil signatur og testet sin specificitet og sensitivitet som biomarkør i diagnosen af ​​CRC. Vi studerede også sin mulige rolle i overvågningen af ​​udviklingen af ​​CRC. Vi har udført en tofaset case-kontrol-test for at identificere serum miRNA som biomarkører for CRC diagnose. Brug kvantitative reverse transcription polymerase kædereaktioner, vi testede ti ansøgerlande miRNA i et træningssæt (30 CRC’er vs 30 kontroller). Risikoscore analyse blev anvendt til at evaluere den diagnostiske værdi af serum miRNA system. Andre uafhængige stikprøver, herunder 83 CRC’er og 59 kontroller, blev brugt til at validere diagnostiske model. I træningssættet, seks serum miRNA (miR-21, lad-7g, miR-31, miR-92a, miR-181b, og miR-203) havde signifikant forskellige udtryk niveauer mellem de CRC’er og raske kontrolpersoner. Risiko score analyse viste, at seks-miRNA-baserede biomarkør signatur havde høj følsomhed og specificitet til at skelne CRC prøver fra kræft-fri kontrol. Arealerne under modtageren opererer karakteristik (ROC) kurve af de seks-miRNA signatur profiler var 0.900 og 0,923 for de to sæt af serumprøver, hhv. Men for de samme serumprøver, områderne under ROC-kurven bruges af tumormarkører carcinoembryonisk antigen (CEA) og kulhydrat antigen 19-9 (CA19-9) var kun 0,649 og 0,598 henholdsvis. Ekspressionsniveauerne for de seks serum miRNA blev også korreleret med CRC progression. Således kan de identificerede seks-miRNA signatur anvendes som en ikke-invasiv biomarkør til diagnosticering af CRC, med relativt høj følsomhed og specificitet

Henvisning:. Wang J., Huang Sk, Zhao M, Yang M, Zhong Jl , Gu Yy, et al. (2014) Identifikation af en cirkulerende MicroRNA Signatur for tyktarms- og endetarmskræft Detection. PLoS ONE 9 (4): e87451. doi: 10,1371 /journal.pone.0087451

Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Frankrig

Modtaget: 30 oktober, 2013; Accepteret: December 28, 2013; Udgivet: April 7, 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Key Basic Research Program Kina (2007CB914700). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform i verden. Den tegner sig for næsten 50.000 dødsfald hvert år og er den næststørste årsag til kræft dødsfald [1], [2]. Det blev anslået, at hvert år, ville halvanden million nye CRC tilfælde blive diagnosticeret på verdensplan [2]. En undersøgelse er registreret i National Cancer Institute Surveillance Epidemiologi og slutresultater (SEER) database, blev gennemført med 119,363 mennesker diagnosticeret med colon adenocarcinom mellem 1991 og 2000. Denne undersøgelse viste, at de observerede 5-årige overlevelsesrater var relateret til den fase af sygdom på diagnosetidspunktet; for patienter diagnosticeret i I /IIa etape overlevelsen var meget bedre end for patienter diagnosticeret i senere faser [3]. Selvom kvalificerede pleje og screeningsprogrammer spiller en vigtig rolle i overlevelsen af ​​patienter med CRC, kirurgisk resektion i den tidlige fase er den mest effektive behandling og forlænger overlevelsen af ​​patienter. Desværre, tidlige fase CRC’er er vanskelige at opdage på grund af færre symptomer.

I øjeblikket er endoskopi og fækal okkult blodprøver (FOBT) ofte i klinikker til at diagnosticere CRC patienter. Men ikke blot er tilfældig biopsi en invasiv procedure, men potentielle fejl prøveudtagning kan forekomme, hvilket yderligere begrænser deres effektivitet. I mellemtiden, selvom FOBT er enkel, billig og ikke-invasiv, det præsenterer særlig ringe følsomhed til påvisning af tidlige fase CRC [4], [5]. Proteomet af cirkulerende blod er også blevet anvendt til påvisning af biomarkører for CRC såsom carcinoembryonisk antigen (CEA) og kulhydrat-antigen 19-9 (CA19-9), men dets følsomhed og specificitet, især for tidligt kolorektal cancer, synes at være utilstrækkelig [6]. Derfor er nye metoder og nye diagnostiske biomarkører akut behov for masse undersøgelser af tidlige begivenheder i CRC.

MicroRNA (miRNA) er en -22-nt lange ikke-kodende RNA, som spiller en negativ rolle i genekspression [7], [8]. Ændret ekspression af miRNA er blevet associeret med forskellige sygdomme, især cancer. MiRNA har vist sig at vellykket differentiere forskellige cancere og forudsige resultater i både faste og hæmatologiske maligniteter [7]. Nylige undersøgelser har vist, at der er store mængder af miRNA i kredsløbet. Disse cirkulerende miRNA kan modstå ugunstige fysiologiske betingelser, såsom ekstreme variationer i pH, temperatur, og flere fryse /tø-cykler [9], [10]. Endvidere har nogle forskere påpeget, at profilerne af cirkulerende miRNA viste konsistente ekspressionsniveauer tværs fysiologisk raske individer [11]. Fordi serum og plasma er relativt let at få adgang, cirkulerende miRNA er en af ​​de mest lovende kandidater til diagnosticering af kræft. Mange undersøgelser har vist, at de ekspressionsmønstre for serum miRNA potentielt kan identificere forskellige typer af cancer, herunder lungekræft, prostatakræft, brystkræft, kræft i æggestokkene, og leverkræft [12], [13]. Derfor identificerer en unik serum miRNA udtryk profil for CRC vil være nyttig i diagnosen og opfølgende behandling af tumorer.

For at styrke den diagnostiske effektivitet cirkulation miRNA, nye metoder til at ophøje deres diagnostiske værdi for CRC er krævet. Mange forskere konstateret, at kombinationen af ​​flere miRNA som biomarkør kunne forbedre den diagnostiske effektivitet [14], [15]. Men disse undersøgelser fokuserede primært på opreguleret miRNA. I denne undersøgelse var det et mål at kombinere både op- og ned-reguleres miRNA, at opbygge et diagnostisk model for CRC. Vi valideret første ti miRNA tidligere er rapporteret at være forbundet med CRC, nemlig miR-21, miR-31, miR-203, miR-92a, miR-181b, miR-145, miR-143, miR-30c, miR-17, og lad-7g. Så, ved statistisk analyse, identificerede vi en profil, kombineret seks serum miRNA, der kan tjene som en ny invasiv biomarkør for CRC diagnose.

Materialer og metoder

Etik erklæring

skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter og raske frivillige før undersøgelsen, og alle prøver blev indsamlet i overensstemmelse med de protokoller, der er godkendt af Clinical Research etiske komité for Cancer Institute og Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences.

undersøgelse design og patienter

for at identificere et surrogat biomarkør for CRC, blev en etapevis case-kontrol undersøgelse designet til at identificere en diagnostisk serum miRNA profil (se figur 1). I alt 113 patienter med primære CRC’er (Stages I-IV) og 89 kontrolpersoner blev rekrutteret til denne undersøgelse. Alle 113 kræftpatienter blev rekrutteret fra Cancer Institute og Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences mellem 2008 og 2010. Patienter med en tidligere historie af ondartede svulster, arvelig ikke-polypose CRC eller familiær adenomatøs polypose, blev udelukket. Serumprøver blev indsamlet forud for enhver tumorresektion såsom kirurgi, kemoterapi og /eller strålebehandling. Hver patient havde en histologisk bekræftet diagnose, og tumor scenen bestemmes hovedsageligt baseret på kirurgi resultater, eller på biopsi og billedteknologi, når tumoren ikke var egnet til kirurgisk behandling. Raske kontrolpersoner uden kendt malignitet eller aktiv inflammatorisk tilstand blev matchet til patienterne baseret på alder, køn og etnicitet. Det TNM klassifikation system blev anvendt til at vurdere tumor fase i henhold til tumor-node-metastaser iscenesættelse system sjette udgave af den amerikanske Joint Commission. De demografi og kliniske funktioner i undersøgelsen kohorten er anført i tabel 1.

I biomarkør udvælgelse, et panel af ti kandidatlande miRNA (MIR-21, lad-7g, miR- 31, miR-92a, miR-181b, miR-203, miR-17, miR-30c, miR-143, og miR-145) blev udvalgt til undersøgelse i serumprøver baseret på tidligere anmeldelser på kolorektal cancer [13], [ ,,,0],16]. For træningssættet, valgte vi tilfældigt 30 CRC’er og 30 raske kontrolpersoner og udførte kvantitative revers transkription polymerase kædereaktioner (QRT-PCR’er) for at vælge kandidat miRNA. Efterfølgende validering blev udført ved de resterende 83 CRC og 59 raske donorprøver (validering sæt).

Serum indsamling, RNA isolation, og QRT-PCR assay

Venøse blodprøver (≈5 ml ) blev opsamlet i serum opsamlingsrør, og efterladt ved stuetemperatur i ca. 1 time før den blev centrifugeret ved 820 g i 10 minutter ved 4 ° C. Den resulterende serum blev overført til nye rør, efterfulgt af yderligere centrifugering ved 16.000 ×

g

i 10 minutter ved 4 ° C, til helt at fjerne eventuelle cellerester. Totalt RNA blev isoleret fra 250 pi serum under anvendelse af Trizol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) co-oprensning teknik. For hver 250 pi serum blev faseseparation udført ved tilsætning af 750 pi Trizol LS. Derefter blev 200 pi trichlormethan hvormed forøge RNA faseadskillelse proces. Total RNA blev udfældet ved anvendelse af isopropanol og vasket med 75% ethanol, blev derefter 30 pi RNase-frit vand tilsat til solubilisering. Hver 250 pi serum gav 30 pi total RNA-opløsning, som blev opbevaret ved -80 ° C. Tre pi total RNA blev polyadenyleret ved poly (A) polymerase og revers transkriberet til cDNA ved anvendelse TAKARA microRNA transskription kit (Takara, Japan) ifølge fabrikantens protokol. De revers transkriberet produkter blev fortyndet til en femtedel med RNase-frit vand og anvendt som templates for yderligere PCR-analyse. PCR blev udført under anvendelse af SYBR Premix Ex Taq II kit (Takara) i en ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med producenten-billede universel primer og miRNA-specifikke forward primer. Primersekvenserne er anført i tabel 2. Hver reaktion blev udført i et 20 pi volumen indeholdende 2 pi cDNA, 0,4 pi af hver primer (10 uM), 0,4 pi ROX henvisning farvestof (50 ×), 6,8 pi sterilt destilleret vand, og 2 × SYBR Premix Ex Taq II. PCR-programmet var: denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, efterfulgt af 40 cykler denaturering i 5 s ved 95 ° C og ekstension i 31 s ved 60 ° C. Ved slutningen af ​​PCR-cykler blev smeltekurve analyser udført for at validere specificiteten af ​​det forventede PCR-produkt. Hver reaktion blev udført i tre eksemplarer, og cDNA’et fortynding blev anvendt som template for den negative kontrol.

Endogen MIR-16 blev anvendt som normalizer til cirkulering miRNA kvantificering. De relative ekspressionsniveauer af miRNA blev beregnet ved den sammenlignende 2-

ΔΔCT metode som tidligere [17], [18].

Serum CA19-9 og CEA analyse

Den beskrevne tumor markører CEA og CA-199 blev analyseret med en Elecsys immunoassay analysator (Roche, Basil, Schweiz). De øvre normale grænser for tumormarkører var 6,5 ng /ml for CEA og 39 U /ml for CA-199.

Statistisk analyse

Sammenligning af de demografiske og kliniske funktioner mellem CRC patienter og de raske kontroller blev bestemt ved t-test, envejs variansanalyse (ANOVA) eller chi i anden-test.

Risikoscore analyse blev udført for at evaluere associationen mellem CRC prøverne og miRNA ekspressionsniveauerne. Risikoen score på hvert miRNA i træningssættet blev betegnet som

s

. For op-regulerede miRNA, var stillingen risiko indstillet som en hvis udtrykket niveau var højere i CRC prøver end den øvre 95% referenceinterval for den tilsvarende miRNA niveauet i kontrollerne, og for de ned-regulerede miRNA, risikoscore var indstillet som -1, hvis ekspressionsniveauet var lavere i CRC prøver end den nedre 95% referenceinterval i kontrollerne; ellers var stillingen angivet som 0. For korrelationen af ​​hver miRNA med CRC risiko, blev hver patient risikovægtes score funktion (RSF) baseret på en lineær kombination af ekspressionsniveauerne af de miRNA. Brug af oplysninger fra seks miRNA, at RSF for prøve

jeg

er som følger: I ligningen ovenfor,

SIJ

er risikoen score for miRNA

j

på prøve

i

, og W

j

er vægten af ​​risikoen score på miRNA

j

. For at bestemme de Ws blev seks univariate logistiske regressionsmodeller monteret med sygdomsstatus med hver af de risikofaktorer scoringer. Den regression koefficient på hver risikoscore blev brugt som vægten til at angive bidraget fra hver miRNA til RSF. Hyppigheden tabel og Receiver Operating karakteristiske (ROC) kurver blev derefter anvendt til at vurdere de diagnostiske virkninger af profilering og at finde en passende cutoff point. Validering af proceduren og de cutoffs blev udført på valideringen sæt.

En uafhængige stikprøver t-test blev anvendt til at sammenligne serum miRNA-koncentrationer mellem kræft og sunde prøver. På grund af størrelsen og omfanget af relative miRNA ekspressionsniveauerne, der blev observeret, blev resultaterne data log-transformeret til analyse (log

2). Alle tests var to-sidet og et signifikansniveau på p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS 16.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) og grafer blev genereret med Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA). Data er præsenteret som middelværdi. For klyngen analyse blev hierarkisk klyngedannelse udført ved hjælp af Cluster 3,0 (Berkeley, Californien, USA) med den komplette kobling metode.

Resultater

Beskrivelse af patienterne

Alle 113 patienter, der deltog i denne undersøgelse havde klinisk og patologisk diagnose af CRC. Som det fremgår af tabel 1, var der ingen signifikant forskel i fordelingen af ​​alder, køn og andre sygdomme, såsom hjerte-dysfunktion eller neurologisk sygdom, mellem CRC patienter og raske kontroller i uddannelses- og validering sæt. Forhøjede niveauer af CEA ( 6,5 ng /ml) og CA19-9 ( 39 U /ml) blev fundet i 40 og 26 patienter henholdsvis

Evaluering af miRNA ekspression i CRC-patienter og raske kontroller. af real-time QRT-PCR-analyse

En to fase case-kontrol-test er designet til at identificere serum miRNA som kandidat biomarkører for CRC diagnose. Vi valgte ti kandidatlande miRNA rapporteret i tidligere undersøgelser, og brugte QRT-PCR-analyser til at bekræfte deres udtryk i de 30 CRC tilfælde og 30 alders- og køns- matchede raske kontrolpersoner i træningssættet. MIR-16 ekspression blev anvendt til at normalisere QRT-PCR data. Ingen signifikant forskel blev observeret i niveauerne af MIR-17, MIR-145, MIR-143, MIR-30c mellem CRC og kontrolprøver (data ikke vist). Imidlertid ekspressionsniveauerne af seks af de miRNA var signifikant forskellige mellem CRC og kontrolprøver to miRNA, miR-21 og lad-7g blev opreguleret, og fire miRNA, MIR-31, miR-92a, miR-181b, og MIR-203, blev nedreguleret (tabel 3). Koncentrationerne af de seks differentielt udtrykte miRNA blev undersøgt ved QRT-PCR i de 83 CRC patienter og 59 matchede kontroller i valideringen sæt. Ændringerne i miRNA ekspressionsmønstre observeret i valideringsprocessen sæt var i overensstemmelse med dem, der findes i træningssættet. Den differentielle ekspression af de seks miRNA i de 113 CRC tilfælde sammenlignet med de 89 kontroller er vist i figur 2. Således er denne tofasede test og analyse proces genereres en profil af seks serum miRNA, der tjente som en potentiel biomarkør for CRC. De seks ansøgerlande biomarkører blev derefter udsat for yderligere test og analyser.

serum ekspressionsniveauerne for de seks udvalgte miRNA blev målt i 113 CRC tilfælde og 89 raske kontrolpersoner (i både den indstillede træning og validering sæt) anvendelse af en SYBR-baserede QRT-PCR analyse. Hver reaktion blev udført i tre eksemplarer.

Adskillelse af CRC sager og raske kontrolpersoner med risikoscore analyse

For at evaluere den diagnostiske værdi af en miRNA udtryk signatur omfatter seks identificerede miRNA, udførte vi en risikoscore analyse for at skelne mellem de CRC serumprøver og serumprøver fra raske kontroller. Først blev risikoen score for hvert af de miRNA i træningssættet beregnet under anvendelse af risikoscore formel. På den optimale cutoff prædiktiv værdi på 9,595 for den risiko score-funktionen, når følsomheden og specificiteten var på deres maksimale, blev serumprøver opdelt i en lav risiko gruppe og en højrisikogruppe, der repræsenterer de raske donorer og CRC sager, henholdsvis . Dernæst brugte vi cutoff værdi til analyse af de 142 prøver i valideringen sæt. Som vist i tabel 4, den positive prædiktive værdi og negativ prædiktiv værdi af de seks-miRNA signatur i træningssættet var 0,96 og 0,85 henholdsvis og i valideringssættet de positive og negative prædiktive værdier var 0,95 og 0,92 hhv. Vi konstruerede også ROC kurver at vurdere følsomheden og specificiteten af ​​miRNA-baserede biomarkører. Arealerne under kurverne (AUC) var 0.900 og 0,923 for sættet uddannelse og validering sæt henholdsvis (figur 3A og 3B). Under anvendelse af samme serumprøver, sammenlignede vi AUC for de seks-miRNA signatur med AUC for tumormarkører CEA og CA19-9, som allerede anvendes i klinikker for CRC detektion. De AUC-værdierne for de seks-miRNA signatur var markant højere end AUC for CEA (0,649) og CA19-9 (0,598) (figur 3C og 3D). Disse resultater indikerer, at seks-miRNA signatur er en mere nøjagtig biomarkør end CEA og CA19-9 for CRC diagnose.

(A) ROC-kurve analyse for profilen af ​​den seks- miRNA signatur i træningssættet gav en AUC-værdi på 0,900 (95% CI: 0,812-0,988) med 83,3% følsomhed og 96,7% specificitet (cut-off-værdi = 9,595). (B) ROC kurve analyse for profilen af ​​de seks-miRNA signatur i valideringen sæt gav en AUC-værdi på 0,923 (95% CI: 0,869-0,976) med 96,4% følsomhed og 88,1% specificitet (cut-off-værdi = 9,595) . (C) carcinoembryonisk antigen (CEA) gav en AUC-værdi på 0,649 (95% CI): 0,574-0,724) med 35,4% følsomhed og 94,4% specificitet og (D) carbohydratantigen 19-9 (CA19-9) gav en AUC-værdi af 0,598 (95% CI: 0,521-0,676). med 23% sensitivitet og 96,6% specificitet, for de samme serumprøver

Foreningen med demografiske og kliniske faktorer

for at bestemme rollen af ​​de seks miRNA-baserede tumormarkører i CRC fremkaldelse blev CRC tilfælde yderligere stratificeres ud fra deres TNM mellemstationer. I denne analyse blev CRC prøver fra træningssættet og validering sæt kombineret og ekspressionsniveauerne af de seks miRNA blev korreleret med tumor fase af CRC patienterne. Vi fandt, at score værdierne risiko var forskellige blandt CRC sager på forskellige tumor stadier (se figur S1A). Den gennemsnitlige risiko score på CRC sager på senere stadier (IIb, III og IV) var signifikant højere end scoren på tidligere stadier (I og IIa). Der var ingen signifikant sammenhæng mellem de seks miRNA og køn, alder, nodal status og tumor invasiv dybde (se figur S1B-E).

Unsupervised klyngeanalyse

For at analysere forskellen udtryk for de miRNA mellem CRC og kontrol serumprøver, vi gennemført en uovervåget klyngedannelse proces, der var blind for de kliniske anmærkninger. Den dendrogram viste en klar adskillelse af CRC prøver fra kontrolprøverne baseret på seks miRNA signatur profil (se figur S2). I træningssættet, blev ingen af ​​30 CRC prøver og kun fire af 30 kontrolprøver forkert klassificeret (Figur S2A). I valideringen sæt blev de 83 CRC tilfælde og 59 kontroller inddeles i to hovedkategorier; kun en CRC-sagen og tre kontroller blev fejlklassificeres (figur S2B)

Diskussion

Mange undersøgelser har fundet, at miRNA udtryk er afvigende i CRC udvikling.; De fleste af disse undersøgelser fokuseret på ekspressionen af ​​miRNA i tumorvæv og celler. Selvom væv miRNA kan give en præcis diagnose af forskellige former for kræft, at det er vanskeligt at indsamle vævsprøver begrænser dens anvendelse til påvisning af kræft biomarkører. Erhvervelse vævsprøver er en invasiv procedure og afhænger af kirurgiske snit efter indledende klinisk klassifikation. Søgningen efter invasive værktøjer til diagnosticering af kræft har længe været et mål for mange forskere, og meget af interesse har været om omsætning af nukleinsyrer i plasma og serum. Sammenlignet med DNA og mRNA, cirkulerende miRNA viser bemærkelsesværdig stabilitet efter langvarig inkubation ved stuetemperatur og /eller multiple frysning-optøning processer. Men den beskyttende mekanisme af cirkulerende miRNA er stadig ukendt. Nogle forskere rapporterede, at cirkulerende miRNA var i form af Argonaute 2 (Ago2) -miRNA komplekser, som kunne undgå RNase fordøjelse [19]. MiRNA i plasma kan secerneres af celler og frigivelse proces kan være en selektiv mekanisme, der er korreleret med malignitet [20]. Der er mange fordele ved at anvende cirkulerende miRNA for CRC detektion. Prøvetagning er let og lave omkostninger, og vigtigere, er en relativt ikke-invasiv procedure, der kan anvendes let i screening og monitorering af kræftpatienter. Desuden miRNA-profiler er primært konsekvent blandt raske personer og er meget stabile i blodet.

Tidlige søgninger efter invasive værktøjer til diagnosticering af kræft blev primært fokuseret på en enkelt eller kun nogle få tumor-specifikke miRNA [9] , [21] – [23]. For eksempel Liu et al. [21] studerede miRNA profiler i serum af gastriske kræftpatienter, kolorektale kræftpatienter og raske personer. Interessant fandt de, at cirkulerende MIR-378 var relateret til gastrisk cancer, men var ikke forbundet med andre gastrointestinale cancerformer. De rapporterede, at MIR-378 ekspressionsniveauer kunne skelne gastriske cancerpatienter fra raske kontroller, med 87,5% følsomhed og 70,73% specificitet [21]. Serum miR-1246 alene gav et område under ROC-kurven af ​​0,754, med 71,3% følsomhed og 73,9% specificitet til at skelne esophageal kræftpatienter fra raske kontroller [23]. Selv om denne form for tilgang er enkel og tilgængelig, specificiteten af ​​biomarkører baseret på en enkelt tumor-specifikke miRNA er generelt dårlig. Iværksættelse og udvikling af cancere omfatter mange forskelligartede og komplekse molekylære begivenheder, som vil påvirke spredning, cellecyklus og apoptose. Derfor bør en kombination af flere serum miRNA være mere pålidelige til tumorpåvisning end de konventionelle enkelt protein-baserede eller kulhydrat-baserede biomarkører. I denne undersøgelse identificerede vi to opreguleret serum miRNA (MIR-21, lad-7g) og fire nedreguleres miRNA (MIR-31, MIR-181b, MIR-92a, MIR-203). Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at beskrive et serum miRNA-baserede signatur, der blev bygget ved at kombinere over- og under-udtrykt miRNA, som begge spiller en væsentlig rolle i tumoren proliferation, migration og invasion. Den seks-miRNA signatur kunne registrere CRC serumprøver med en sensitivitet og specificitet på 93% og 91%, henholdsvis (se tabel S2), betydeligt højere end nogen enkelt faktor biomarkør, såsom CA19-9 eller CEA. Vores resultater viste, at for de samme serumprøver, følsomheden af ​​CRC påvisning ved CA19-9 og CEA var 35% og 23%. Det er klart, kan den kombinerede seks-miRNA signatur held adskille CRC patienter fra kontrollerne, og kunne tjene som en nøjagtig biomarkør for CRC diagnose. Især viste denne biomarkør en anden ekspressionsprofil mellem de normale kontroller og CRC patienter med kun stadium I /II cancere (tabel S1). CRC patienter med stadium I /II kan undergå fuldstændig resektion af tumoren, og vil have en bedre prognose. Vores data tyder på, at anvendelsen af ​​den seks-miRNA signatur som biomarkør for at definere den tidlige fase CRC kan være en effektiv måde at ændre resultaterne og forbedre prognosen. Vi har fundet, at miRNA ekspression er korreleret med tumor stadium, og serummet miRNA signatur kan anvendes til at påvise progressionen fase af CRC. Der blev ikke fundet, når CRC sager blev stratificeret efter demografiske og kliniske faktor, såsom køn, alder, nodal status, og tumor invasiv dybde; imidlertid viste vores resultater, at en høj risiko score var forbundet med de avancerede kliniske stadier af denne sygdom (Figur S1). I øjeblikket TNM er det vigtigste redskab, der anvendes af klinikere til at estimere tumor byrde og forudsige prognosen og overlevelse. Vi foreslår, at seks-miRNA signatur i serumprøver kan blive en vigtig prædiktiv parameter i valget af den bedste kombination af behandlingsmodaliteter, såsom kirurgi, stråling, og /eller kemoterapi. Men vores data er delvis modstridende med resultaterne af nogle tidligere undersøgelser; for eksempel, blev rapporteret ekspressionsniveauerne af miR-181b, miR-92a, miR-31, og miR-203 at være forhøjet i CRC vævsprøver sammenlignet med kontroller. Denne forskel kan tilskrives forskellige miRNA udtryk niveauer mellem væv og plasma. Mange undersøgelser har vist, at miRNA ekspression i vævsprøver ændret sig i den modsatte retning fra deres ekspression i serumprøver [21], [24]. Dette kan være forårsaget af den cellulære udvælgelsesmekanisme af miRNA frigivelse [20]; for eksempel kan cancerceller selektivt bevarer nogle miRNA, hvilket resulterer i et fald af miRNA i serum. Mere interessant, blev også fundet ekspressionen af ​​disse fire nedreguleres miRNA skal nedreguleres i nogle andre cancertyper. For eksempel MIR-31, som er placeret på kromosom 9p21.3, var signifikant lavere i blærekræft [25], brystcancer [26], gastrisk cancer [27], prostatacarcinom [28], og CRC med hjernemetastase [ ,,,0],29]. Mange forskere har fundet, at MIR-31 kan inhibere brystkræft metastase [26], [30], og dereguleringen af ​​MIR-31 er blevet forbundet med cancer progression og metastase. Den høje ekspression af MIR-92a er blevet forbundet med udviklingen og progressionen af ​​mange cancere [31]; dog Shigoka et al. [32] fandt, at miR-92a blev stærkt udtrykt i hepatocellulært carcinom væv, var lavere i plasmaet af disse patienter, men blev forhøjet i deres plasma efter kirurgisk behandling. Nilsson et al. [33] viste, at lave MIR-92a-niveauer i tumorer blev forbundet med den fase af tumoren og at dets nedregulering øget cellemigration. MIR-181b har vist sig at virke som et tumorsuppressorgen, og blev nedreguleret i humane gliomer [34], [35].

Sammenfattende er dette den første undersøgelse for at rapportere klinisk diagnostisk værdi af en seks-miRNA-baserede biomarkør signatur i serum, der indeholder både up- og nedreguleret miRNA. Vores arbejde vil danne grundlag for yderligere undersøgelse, helst storstilet validering i kliniske forsøg, før serum miRNA kan bruges som en rutinemæssig screening værktøj til CRC.

Støtte oplysninger

figur S1.

sammenslutning af ekspressionsniveauer for de seks miRNA med demografiske og kliniske faktorer af CRC patienter. (A) Når CRC sager blev grupperet efter deres TNM mellemstationer, den gennemsnitlige risikoscore for CRC sager på senere stadier (IIb, III og IV) var signifikant højere end på tidligere stadier (I og IIa) (p 0,05). (B-E) Der var ingen signifikant sammenhæng mellem de seks miRNA og tumor invasiv dybde, nodal status, køn og alder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0087451.s001

(DOCX)

figur S2.

dendrogram af de uovervågede klyngedannelse resultater. Dendrogrammet indikerer en klar adskillelse af CRC prøver fra kontrolprøverne baseret på de seks-miRNA signatur i både uddannelsen sæt (A) og validering sæt (B)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0087451. S002

(DOCX)

tabel S1.

differentielt udtrykte miRNA i fase I /II CRC serumprøver sammenlignet med i kontrol serumprøver. De normaliserede miRNA ekspressionsniveauerne præsenteres som gennemsnit ± SD

doi:. 10,1371 /journal.pone.0087451.s003

(DOCX)

tabel S2.

Følsomhed og specificitet af de seks-miRNA biomarkør signatur i forhold til CEA og CA19-9 markører

doi:. 10,1371 /journal.pone.0087451.s004

(DOCX)