PLoS ONE: KRAS genotypeforandringer af cirkulerende tumorceller under behandling af patienter med metastatisk kolorektal cancer

abstrakt

Indledning

Cirkulerende tumorceller (CTCs) kunne udgøre en ikke-invasiv kilde af cancerceller, der anvendes til langsgående overvågning af tumorale mutation status gennem hele forløbet af sygdommen. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge påvisning af

KRAS

mutationer i CTCs fra patienter med metastatisk kolorektal cancer (mCRC), og sammenligne deres mutation status under behandlingen eller sygdomsprogression med at af de tilsvarende primære tumorer.

Materialer og metoder Salg

Identifikation af syv mest almindelige

KRAS

mutationer på kodon 12 og 13 blev udført ved Peptide Nucleic Acid (PNA) -baserede qPCR metode. blev bestemt Følsomheden af ​​assayet efter isolering af

KRAS

mutante cancerceller tilsat til raske donorers blod, ved hjælp af CellSearch epitelcelle kit. Konsekvent detektion af

KRAS

mutationer blev opnået i prøver indeholdende mindst 10 tumorceller /7,5 ml blod.

Resultater Salg

Den kliniske anvendelighed af assayet blev vurderet i 48 blodprøver taget fra 31 patienter med mCRC. Alle patienter havde

PIK3C

A og

BRAF

vildtype primære tumorer og 14

KRAS

mutant tumorer. CTCs blev påvist i 65% af prøver taget fra 74% af patienterne.

KRAS

mutationsanalyse i CTC-berigede prøver viste, at 45% og 16,7% af patienterne med mutante og vildtype primære tumorer henholdsvis havde påviselige mutationer i deres CTCs. Vurdering

KRAS

mutationer i blodprøver serielle afslørede, at enkelte patients CTCs udstillet forskellige mutationsstatus af

KRAS

under behandlingen.

Konklusioner

Den nuværende resultater support rationalet for at bruge CTCs som en dynamisk kilde af tumorceller, som ved re-evaluere deres

KRAS

mutation status, kunne forudse, måske mere præcist, reaktion FRK patienter til målrettet terapi.

Henvisning: Kalikaki A, Politaki H, Souglakos J, Apostolaki S, Papadimitraki E, Georgoulia N, et al. (2014)

KRAS

genotypeforandringer af cirkulerende tumorceller under behandling af patienter med metastatisk kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (8): e104902. doi: 10,1371 /journal.pone.0104902

Redaktør: Georgia Sotiropoulou, University of Patras, Grækenland

Modtaget: April 29, 2014 Accepteret: 16. juli 2014 Udgivet: 19 August, 2014

Copyright: © 2014 Kalikaki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra den kretensiske Association for Biomedical Research (CABR), Den Hellenske Society of Medical Oncology (Hesmo) og operationelle program “konkurrenceevne Entrepreneurship”, nationale strategiske referenceramme 2007-2013, National Handling: “Samarbejde”, OncoSeed Diagnostics: Biologi af cirkulerende Tumor Cells, fjernmetastaser Udvikling af flydende Biopsi Metoder; Generalsekretariatet for forskning og teknologi i Grækenland. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Adjunkt John Souglakos øjeblikket tjener som en akademisk redaktør. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Sammenhængen mellem

KRAS

mutationer og respons på EGFR-hæmmere har været etableret i flere studier; følgelig

KRAS

genotypebestemmelse anbefales til alle patienter med metastatisk kolorektal cancer (mCRC) før nogen behandling, der udnytter EGFR-målrettede monoklonale antistoffer, cetuximab eller panitumumab [1]. Ikke desto mindre, ikke alle patienter med

KRAS

vildtype tumorer reagerer på EGFR-målrettede behandlinger og de fleste af de oprindeligt responderende patienter oplevede sygdomsprogression inden for 5 til 6 måneder [2].

I betragtning af at de fleste af de undersøgelser er blevet udført ved hjælp af væv opnået fra den primære tumor mens EGFR monoklonale antistoffer er blevet anvendt til at behandle metastatisk sygdom, er det muligt, at den manglende effekt og /eller fremkomsten af ​​efterfølgende modstand kan skyldes genetisk diversificering af metastatiske celler i forhold til deres primære tumor kolleger eller dynamiske variationer i tumor genotype eller fænotype, der opstår under behandlingen.

Flere undersøgelser har vist uharmonisk mutation status mellem primære tumorer og tilsvarende metastase i en andel (5% -30% ) af CRC patienter [3], [4], [5], [6]. Desuden nyere undersøgelser tyder på, at erhvervet resistens dels opnås ved valg af allerede eksisterende mindre sub-kloner indeholdende mutationer giver resistens over for anti-EGFR-behandling [7], [8]. Fordi invasive biopsier af metastatiske steder kan ikke altid opfyldes og kan ikke let udføres gentagne gange, cirkulerende tumorceller (CTCs) i det perifere blod af cancerpatienter, som menes at mediere hæmatogen spredning af sygdommen til fjerne steder, kan repræsentere en alternativ kilde af metastaserende tumorceller.

det er veldokumenteret, at CTCs, som defineret af FDA-godkendte CellSearch System, kunne tjene som en markør for mikrometastatisk tumor belastning forbundet med patienternes prognose og kan præcist forudsige effektiviteten af ​​behandlingen i metastatisk brystkræft, tyk-, prostata- og lungekræft [9], [10], [11], [12]. Tidligere undersøgelser i metastatisk kolorektal cancer foreslog, at det absolutte antal og de numeriske variationer af CTCs under sygdomsprogression eller terapi kan give værdifulde oplysninger om det kliniske resultat og effekten af ​​administrerede behandlinger [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Men CTCs kan ikke altid identificeres i metastatiske patienter, understreger behovet for at udvikle mere følsomme og kræft typespecifikke CTC detektionsassays [19]. I denne sammenhæng kunne identifikationen af ​​onkogene mutationer CTCs bidrage til en forbedring af de eksisterende metoder til påvisning. Desuden kunne genotypning af CTCs muligvis forbedre overvågningen af ​​svar på målrettede behandlinger ved at identificere genomiske profiler prædiktive for tilbagefald før klinisk sygdomsprogression [20], [21], [22], [23], [24].

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge muligheden for at detektere

KRAS

mutationer i CTC-berigede fraktioner i patienter med mCRC. Yderligere mål var at vurdere, om

KRAS

mutation status CTCs korrelerer med den for tilsvarende primære tumorer og undersøge den genetiske heterogenitet CTCs i forhold til

KRAS

mutation status under behandlingen.

Materialer og metoder

patienter

Enogtredive patienter med metastatisk colorectal cancer blev indrulleret i den aktuelle undersøgelse. Hos alle patienter blev diagnosen bekræftet ved histologisk undersøgelse af den primære tumor før indledningen af ​​enhver systemisk terapi. Alle på nær én patient blev behandlet med 5-FU-baserede first-line kombinationskemoterapi med eller uden et biologisk middel (bevacizumab eller panitumumab). Nitten (55%) patienter fik en irinotecan-baseret kombination og 11 (37%) en oxaliplatin-baserede regime i indstillingen første linje (én patient modtog ikke nogen behandling). Derudover, 25 (83%) patienter fik bevacizumab og to (7%) panitumumab. På tidspunktet for analysen, 19 patienter præsenterede sygdomsprogression til førstevalgsbehandling og 12 af dem blev behandlet med en anden-line kemoterapi; fem ud af disse 12 patienter blev behandlet med panitumumab i kombination med kemoterapi.

Perifert blod blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​CTCs før initiering af første linie behandling hos 12 patienter, på tidspunktet for progression på første linje behandling i 9 og når som helst under behandlingen hos 18 patienter.

Alle patienter samt 16 raske bloddonorer, der ikke havde kendt sygdom og ingen historie ondartet sygdom, blev testet for tilstedeværelsen af ​​CTCs bruger CellSearch epitelcelle Kit (Veridex LLC). Perifert blod blev opnået fra FRK patienter (7,5 ml) og raske donorer (23 ml, til anvendelse i standardtilsætningsforsøg) ved venepunktur i de specifikke CellSave rør; for at undgå kontaminering af prøverne med epitelceller de første 5 ml blod blev kasseret. Samtlige forsøg blev udført inden for 72 timer fra blodet draw ifølge producentens anvisninger. Celler, der var CK (+) /CD45 (-). Og havde et DAPI-positiv intracellulær kerne blev karakteriseret som CTCs af erfarne biologer (EP og SA)

Da denne undersøgelse var en pilot forundersøgelse, var der nej en statistisk stikprøve estimering og prøvetagning var baseret på tilgængeligheden af ​​CellSearch patroner.

Etik erklæring

Alle patienter gav deres skriftlige informerede samtykke til at deltage i undersøgelsen, som er blevet godkendt af Etik og videnskabelige komitéer fra University General Hospital i Heraklion, Kreta, Grækenland; manuskriptet blev fremstillet i overensstemmelse med bemærkningen kriterier [25]

Cellelinjer

Kræft cellelinjer huser

KRAS

mutationer [LS174T, Human kolon adenocarcinom, c.35G A (p.G12D); HCT116, human colon adenocarcinoma, c.38G A (p.G13D); HUP-T3, Human pancreas adenocarcinom, c.34G C (p.G12R); KYSE410, Human spiserøret pladecellekræft, c.34G T (p.G12C); A549, Human alveolær adenocarcinom, c.34G A (p.G12S); SW403, Human colon adenocarcinom, c.35G T (p.G12V) og RPMI8226, Human myelom, c.35G C (p.G12A)] eller vildtype for

KRAS

(HT-29, Human colon adenocarcinom)] stammede fra American Type Culture Collection (ATCC, USA) og blev venligst stillet til rådighed fra Prof. A. Jung (Patologisk Institut, Ludwig-Maximilian-universitetet, München, Tyskland). Alle cellelinier blev dyrket i kolber ifølge leverandørens anbefalinger, før efterfølgende høst anvendelse af 0,25% trypsin og 5 mmol /l EDTA (GIBCO-BRL). Godkendelse blev udført ved at bestemme

KRAS

mutations status for hver cellelinje ved Sanger sekventering. Alle cellelinjer undtagen SW403 var heterozygote for

KRAS

mutationer og afslørede den forventede genotype.

DNA isolation fra CTC-berigede fraktioner og væv

Efter CTC optælling, tilfangetagne celler blev overført fra kammeret til et 2 ml rør og underkastet en proteinase K-fordøjelse ved 65 ° C i 2-5 timer; DNA-isolering blev udført ved anvendelse af Epicentre MasterPure Complete DNA RNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger og det ekstraherede DNA blev kvantificeret ved anvendelse af en NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies, USA) og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. Det gennemsnitlige udbytte af DNA var ~1.5 ug; imidlertid DNA kvantificering af UV-spektroskopi ikke er præcis på grund af detektion af enkeltstrenget DNA, frie nucleotider eller RNA i prøven.

Formalin-fikserede paraffin-indstøbt (FFPE) primær tumor-væv blev histologisk evalueret af en patolog (MT) og mikro-dissektion blev udført for at øge procentdelen af ​​tumorceller. Tre 5 um vævssnit blev deparaffinised af xylen og ethanol vaske og underkastes en proteinase K-fordøjelse natten over ved 56 ° C DNA blev derefter oprenset ved anvendelse af et QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Tyskland).

Mutation analyse i primær tumorer

i samtykkende patienter, primære tumorer blev evalueret for mutationer i

KRAS

,

PIK3CA

BRAF

af både Sanger sekventering og metoder med høj følsomhed som tidligere beskrevet [26].

KRAS

mutation assay

En mutation assay der kombineret peptidnucleinsyren (PNA) -medieret PCR klemme med TaqMan-MGB allel diskrimination assays er tidligere blevet udviklet til påvisning af syv mere almindeligt

KRAS

mutationer [6] .De termiske forhold for PNA-medieret PCR fastspændingsanordninger for hver af de syv

KRAS

mutante skabeloner blev yderligere optimeret ved hjælp en PNA mærket med et fluorescerende farvestof som både sensor probe og PCR klemme ifølge Luo JD et al [27]. Den største selektivitet, blev dvs. høj Ct-værdi i vildtype-probe og lav Ct-værdi i mutanten probe opnået ved 62 ° C med 200 nM PNA for c.35G A (p.G12D), c.38G A (p.G13D) og c.35G T (p.G12V) og 150 nM PNA for c.34G C (p.G12R), c.34G T (p.G12C), c.34G A ( p.G12S) og c.35G C (p.G12A)

KRAS

mutant skabeloner hhv. Reaktionerne blev udført på Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System i 384-brønds plader i et totalt volumen på 5 pi, indeholdende 2 pi (ca. 1/8 af det samlede ekstraherede DNA fra CTC-berigede prøver og 20 ng ekstraheret DNA fra FFPEs ) DNA, 2,5 pi 2X TaqMan genotypebestemmelse mastermix (Applied Biosystems, USA), 0,25 pi genotypebestemmelsesassay mix og 150 eller 200 nm PNA; parallelt, blev en ikke-PNA-clamp reaktion udført. PCR-betingelserne var 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af to trin cykling: 50 cykler af 92 ° C i 15 s og 62 ° C i 90 s. Alle prøver blev kørt som minimum dobbeltbestemmelser. Ct-værdier blev opnået fra instrumentets realtid indsamlingen PCR-data software ved hjælp af 0,2 manuel tærskel. En positiv kontrol for hver

KRAS

mutation (model prøver, der omfattede blandinger af cellelinier med muterede /vildtype nøgletal 1/100 og 1/500) og en negativ kontrol (

KRAS

vildtype cellelinje) i total effekt på 50 ng blev inkluderet i hver kørsel

ACt = Ct

mut sonde (+ PNA) -. Ct

vægt sonde (-PNA) værdi blev beregnet for hver prøve; Ct

mut probe (+ PNA) og Ct

wt probe (-PNA) betegnet Ct (tærskelcyklus Ct, der betegnes som det cyklusantal, ved hvilken et signal over baggrund fluorescens) værdier for mutanten og wt prober ifølge reaktionerne med og uden PNA hhv. Ct

mut probe (+ PNA) afspejler mængden af ​​

KRAS

mutante DNA i prøven, mens Ct

wt probe (-PNA) afspejler mængden af ​​amplificerbare template, der stammer fra varierende antal af kontaminerende leukocytter i CTC fraktion [28].

assay gyldighed

gyldigheden af ​​analyseresultatet for hver prøve blev bestemt ved Ct

wt probe (-PNA) værdi, der burde være 24≤Ct

vægt sonde (-PNA) 32; hvis Ct

wt probe (-PNA) i en prøve er større end 32, analyseresultatet er ikke pålidelige på grund af en lav mængde af DNA eller mislykkedes målamplifikation. Effektiv PCR PNA fastspænding blev bekræftet af en Ct

wtprobe (+ PNA) værdi 45.

KRAS

mutation status blev bestemt ved sammenligning af ACt værdier til tidligere definerede ACt cutoff værdier for hver af de syv mere almindelige

KRAS

mutationer. De cutoff værdier for hver mutation assay er blevet bestemt ud fra en analyse af 16 raske donorers blodprøver efter CellSearch analyse. Som cutoff værdi blev defineret ACt svarende til den maksimale specificitet; det vil sige, ingen mutation påvises i 100% (16/16) af raske donorer (tabel 1, figur 1).

Grafer viste ACt-værdier (

y

aksen) versus CTC- berigede prøver (

x

akse) af FRK patienter (n = 31), raske individer (n = 16) og model prøver tilsat 100 og 10 celler fra cellelinier (LS174T, SW403, KYSE410 og HCT116) huser hotspot

KRAS

mutationer c.35G A; p.G12D (A), c.35G T; p.G12V (B), c.38G A; p.G13D (C) og c.34G T; p.G12C (D). Cutoff tærskel er repræsenteret ved dot-line; Prøver med ACt under tærsklen betragtes mutant; ACt = Ct

mut probe (+ PNA) – Ct

wt probe (-PNA); NVD, ingen variant opdaget.

Analytisk specificitet og sensitivitet

Den analytiske specificitet af de syv analyser var individuelt evalueret ved hjælp af genomisk DNA (gDNA) isoleret fra

KRAS

vildtype-cellelinje (HT29) eller positive for specifik

KRAS

mutationer; den nedre detektionsgrænse for alle analyser var 0,015 ng. For at vurdere analytisk sensitivitet, hver af de syv

KRAS

mutant cellelinie gDNA blev seriefortyndet over et område af tre forskellige koncentrationer (100 ng, 50 ng og 20 ng) af vildtype gDNA tilvejebragt af HT 29 cellelinie til opnåelse mutation /vildtype-forhold på 100%, 50%, 10%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% og 0%. Alle assays have en følsomhed på 0,1%, holder det samlede input konstant ved 20 ng, undtagen assays til påvisning af p.G13D og p.G12V at have en følsomhed på 0,5% (tabel 1).

krydsreaktivitet

Cross-reaktivitet blev udført for alle mutation analyser, der potentielt identificere en anden assay skabelon grund ufuldkommen baseparring og læse-through. Resultaterne indikerer, at G12D assayet viser signifikant krydsreaktivitet med G12V og G12A mutant templates, det G13D assay med G12S mutant template, den G12R assay med G12C og G12S mutant templates og G12C assay med G12S mutant skabelon (tabel 2).

Intra- og inter-assay præcision

Intra-assay præcision er blevet evalueret ved at analysere model prøver at køre i tre eksemplarer på det samme eksperiment ved hjælp af seriel fortynding (100%, 50%, 10%, 2%, 1%, 0,5% og 0,1%) af

KRAS

mutante DNA’er, som nævnt ovenfor, i 20 ng baggrund

KRAS

vildtype DNA. De ACt variationskoefficienter for

KRAS

muteret DNA varierede mellem 0,3% og 2,5%. Inter-assay reproducerbarhed er blevet målt på samme måde ved at beregne ACt variationskoefficienter af tredobbelte prøver på forskellige dage under anvendelse af de samme serielle fortyndinger af muterede DNA. De ACt variationskoefficienter for

KRAS

muteret DNA varierede mellem 0,4% og 2,5%. Desuden i model prøver med et muteret /vildtype forholdet 0,5%, den samlede mutation assay fejlrate var 0%.

Resultater

Mutation assay optimering

følsomhed vores eksperimenterende tilgang til at bestemme præcist

KRAS

mutation status i et begrænset antal CTCs stede blandt normale blodlegemer i cirkulerende blod blev valideret ved at tilsætte

KRAS

mutant kræftceller ind i blod fra raske donorer . Ca. 100 og 10 tumorceller blev tilsat til 7,5 ml blod i CellSave rør og analyseret ved CellSearch inden for 2 dage, i mindst 3 uafhængige forsøg. Den gennemsnitlige procent recovery for de 100 og 10 spidse celler [LS174T, c.35G A (p.G12D), n = 5 forsøg; HCT116, c.38G A (p.G13D), n = 4 eksperimenter; SW403, c.35G T (p.G12V), n = 4 eksperimenter og KYSE410, c.34G T (p.G12C), n = 3 eksperimenter] var 95% (interval, 70% -100%) og 92,5 % (interval, 25% -130%), hhv. Den brede vifte af genopretningen kan tilskrives fejl i forbindelse med spike-i lavt antal af celler. Efter CTC tælling af CellSearch epitelcelle kit, blev DNA ekstraheret fra de opfangede celler og prøver blev analyseret for alle syv

KRAS

mutationer. Ved denne analyse,

KRAS

mutationer kunne konsekvent identificeret fra 10 spidse tumorceller.

patientrettigheder karakteristika og evaluering af CTCs

Patientens demografi, kliniske og patologiske kendetegn er anført i tabel 3.

KRAS

mutationer blev identificeret i de primære tumorer i 45% af patienterne; otte (57%) patienter primære tumor nærede den c.35G A (p.G12D) mutation, tre (21%) af c.35G T (p.G12V), en (7%) den c.38G A (p.G13D), en (7%) af c.34G T (p.G12C) og én (7%) af c.35G C (p.G12A). Alle tumorer blev

PIK3CA

BRAF

vildtype. Den mediane tid mellem kirurgisk resektion af primær tumor og analyse af CTCs var 6 måneder (mellem 1 og 134).

I alt 48 blodprøver blev opnået fra 31 patienter til CTC optælling ved hjælp CellSearch ( tabel 4). Tolv (39%) patienter var kemoterapi naive på tidspunktet for første blodprøve. Tolv (71%) og 11 (79%) patienter med

KRAS

vildtype og mutant primære tumorer henholdsvis havde påviselige CTCs; en median på 9 (området 2 til 660) og 7 (spændvidde 1 til 865) CTCs blev påvist hos patienter med

KRAS

vildtype og mutant primære tumorer hhv. I alt kunne detekteres 1 eller flere CTCs i 31 (65%) blodprøver taget fra 23 (74%) patienter (tabel 4).

KRAS

mutation analyse på codon 12 og 13 blev udført i alle prøver med påviselige CTCs (Figur 1).

KRAS

mutationer i patienternes CTC-beriget prøver

KRAS

mutationer kunne identificeres i CTCs af fem (45%) patienter, hvis primære tumorer havde muteret

KRAS

. Især før indledningen af ​​en

st line kemoterapi kun to af de seks kemoterapi-naive patienter (# 1 og # 5) nærede CTCs med påviselige mutationer, mens på tidspunktet for sygdomsprogression, kan mutationer identificeres i én (# 8) af de to patienter; mutationer var også påvises under opfølgningen af ​​1

st line behandling i to patienter (# 6 og # 10) (tabel 4).

KRAS

mutationer kunne også identificeres i CTCs af to (17%) patienter (# 15 og # 16), hvis primære tumorer havde ingen påviselige mutationer; i både patienter blev CTCs indsamlet under overvågning af 1. linie kemoterapi (tabel 4).

KRAS

mutations status CTCs i serielle blodprøver

Fire serielle blodprøver af patient # 1 havde påviselige CTCs;

KRAS

mutationer blev dokumenteret selv efter administration af den første kemoterapiserie trods det store fald i antallet af CTCs; behandling fortsættelse (efter 3

rd cyklus) resulterede i yderligere fald i CTC nummer og målbart

KRAS

mutationer i CTC-berigede prøver, mens vurdering af behandlingsrespons afsløret et partielt respons; efter 8

th kemoterapicyklus, at antallet af CTCs blev øget og

KRAS

mutationer kunne påvises igen, mens patienten stadig forblev i partielt respons (tabel 4).

I patient # 15, som havde en

KRAS

vildtype primær tumor, ingen

kunne påvises KRAS

mutationer i CTC-berigede eksemplar, når patienten var i delvis respons og under behandling med vedligeholdelse panitumumab; Men efter 4 måneders behandling, på tidspunktet for sygdomsprogression, som dokumenteret af de radiologiske forværring af hepatiske læsioner og kliniske udseende af ascites, at antallet af CTCs blev øget og

KRAS

mutationer kunne identificeres i CTCs beriget cellefraktion.

KRAS

mutationer var yderligere påvises efter 2

nd cyklus af bjærgning kemoterapi trods faldet i CTC nummer (tabel 4).

Diskussion

Mutationer i

KRAS

resultat i konstitutiv aktivering af ras /MAPK-vejen og forudsige manglende respons på anti-EGFR-monoklonale antistoffer. Til dato, beslutninger terapi hovedsagligt

KRAS

mutation status af den primære tumor; dog kan genetiske ændringer ved sygdomsprogression og erhvervet resistens over for behandling ændre tumor biologi. Derfor er et vigtigt spørgsmål vedrører muligheden for at bruge CTCs som en ikke-invasiv alternativ af en ny biopsi, der kunne være mere repræsentative for den aktuelle biologiske tilstand tumorceller og kan anvendes som en biomarkør for enten følsomhed eller erhvervet resistens til EGFR målrettet terapi.

resultatet af den aktuelle undersøgelse klart angive muligheden for at bestemme den

KRAS

mutation status i CTC-berigede blodprøver i forbindelse med rutinemæssig klinisk praksis, efter CTCs tælling af CellSearch system. De præsenterede data støtter stærkt den hypotese, at CTCs kan repræsentere en real-time kilde til flydende biopsi, der kan tillade dynamiske genotypning af tumorceller under behandlingen. Dataene viser også, at den etablerede assay tilvejebringer en detekteringsfølsomhed på ca. 10 muterede celler /7,5 ml blod, uden behov for hele genomet amplifikation, og giver mulighed for en ikke-invasiv, hurtig og billig seriel overvågning af

KRAS

mutation status i codon 12 og 13 i løbet af behandlingen.

KRAS

mutationer blev identificeret selv i kliniske prøver, der indeholder så lavt som 3 CTCs /7,5 ml blod; Vi kan ikke udelukke, at dette kan skyldes tilstedeværelsen af ​​

KRAS

mutationer i CTC fragmenter, der ikke betragtes som reelle CTCs under dokumentation og optælling af CTCs af CellSearch og /eller celle fri DNA (cfDNA) adsorberet til overfladen af ​​kontaminerende leukocytter [29]. Det er at bemærke, at tidligere undersøgelser har vist, at både CTCs og CTC fragmenter korrelerer med patientresultater i prostatakræft [30].

På trods af den lille stikprøvestørrelse og den heterogene patientgruppe analyseret den foreliggende undersøgelse giver belæg for, at

KRAS

mutation status CTCs kan være meget forskellige fra den for tilsvarende primære tumor. CTCs uden påviselig

KRAS

mutationer blev opnået fra seks ud af de 11 patienter med mutante primære tumorer; Dette kunne forklares ved intratumoral heterogenitet og /eller berigelse af mindre allerede eksisterende kloner med forøget metastatisk potentiale i sygdomsprogression. Ikke desto mindre, i tre af de seks disharmoniske tilfælde resektion og undersøgelse af den primære tumor for

KRAS

mutationer blev udført kun en måned før analysen af ​​CTCs (data ikke vist), hvilket indikerer muligvis en model af parallel evolution af den primære tumor og metastase. Tidligere undersøgelser har vist, at mutationen status CTCs ikke altid afspejler den tilsvarende metastase [31]; derfor, sammenligning af

KRAS

mutation status af primær tumor, svarende metastaser og serielle CTC-berigede blodprøver kan kaste lys på oprindelsen af ​​metastaser.

Selvom de betingelser og hastigheden af genotype konvertering er ikke godt forstået, den aktuelle undersøgelse tyder på, at der kan opstå CTCs af forskellig mutation status under behandlingen i den samme patient (patienter # 1 og # 15). Faktisk kunne det antages, at behandlingen med eller uden targeted midler, ved at eliminere nogle kemoterapi-sensitive kloner kan tillade, at der opstår andre lavfrekvente kloner, der afviger fra de fremherskende tumorcellerne i forhold til mutationen status. Denne hypotese er stærkt foreslået af tilstedeværelsen af ​​

KRAS

mutationer i CTCs af to ud af de 12 patienter med

KRAS

vildtype primære tumorer, der blev behandlet med regimer indarbejde panitumumab eller bevacizumab (patienter # 15 og # 16). Ikke desto mindre kunne den fejlslagne påvisning af mutationer i CTC-berigede prøver også tilskrives den lave hyppighed af CTCs huser mutationer samt metodologiske begrænsninger; FDA godkendte CellSearch epitelcelle Kit, der er rapporteret at være ringere end CellSearch epitelcelle Profil kit i form af CTCs ‘molekylær karakterisering [32]. Det er imidlertid blevet vist, at CTCs taget med CellSearch epitelcelle Kit held kan analyseres ved næste generation sekventering metoder [33]. Endvidere kunne en underpopulation af CTCs ikke detekteres ved CellSearch grund af utilstrækkelig ekspression af EpCAM og /eller cytokeratiner; dog en nylig undersøgelse i SCLC viste, at CTCs, der udtrykker EpCAM, fanget med CellSearch systemet kan danne tumorer i immunsvækkede mus [34].

Tidligere undersøgelser har anvendt forskellige metoder til at isolere og molekylært karakterisere CTCs. I metastatisk brystkræft og prostatakræft, genomisk profilering af CTCs isoleret ved immunmagnetisk berigelse og fluorescens-aktiveret cellesortering afslørede nye genomiske ændringer ved sygdomsprogression [35], [36]. Ved hjælp af en mikrofluid CTC capture enhed,

TMPRSS2-ERG

fusion, den TKI’er sensibiliserende

EGFR

aktiverende mutationer og

EGFR

T790M TKI-resistensmutation blev fundet i CTCs fra patienter med prostata- og lungekræft metastatisk sygdom, hvorimod mutationer af

AR

,

KRAS

BRAF

gener er blevet identificeret i CTC-berigede prøver isoleret fra prostata og FRK patienter, henholdsvis ved hjælp af den CellSearch Profile Kit [24], [37], [38], [39]. Genotypebestemmelse af enkelte CTCs isoleret ved den CellSearch eller IsoFlux systemet hos patienter med mCRC bekræftet en intra- og inter- patient heterogenitet baseret på

PIK3CA

KRAS

mutation status [22], [ ,,,0],31]; øvrigt allerede er blevet rapporteret forskellige genetiske ændringer på enkelte CTCs hos patienter med bryst- og esophageal cancer [23], [40].

Tidligere rapporter foreslået en sammenhæng mellem forekomsten af ​​CTCs og cellen frit DNA (cfDNA ) i serum eller plasma fra cancerpatienter [41].

KRAS

mutationer detekteret i serum fra patienter med mCRC er blevet foreslået at overvåge reaktionen på behandling, før det kliniske udseende af sygdomsprogression henviser i NSCLC-patienter er det blevet rapporteret forøget følsomhed over for EGFR mutation detektion i cfDNA end i CTCs [7], [8], [42]. Ikke desto mindre er oprindelsen af ​​cfDNA ikke godt forstået, da det kan være afledt af apoptotiske tumorceller, apoptotiske leukocytter produceret af cytotoksisk behandling samt ved exosomer eller CTCs frigivet fra tumorceller i blodbanen. Selvom isolering og analyse af cfDNA er enklere og mere reproducerbar end at isolere og genotypebestemmelse CTCs, den molekylære karakterisering af CTCs ud over at være nyttige for manglende overvågning behandling eller sygdom tilbagefald kan også give oplysninger til at guide optimale behandling udvælgelse og /eller udvikling af nye behandlingsformer. Salg

i konklusion, de præsenterede data beskrive en simpel metode baseret på den daglige brug af CellSearch platform til identifikation af

KRAS

mutations status CTCs fra patienter med metastatisk kolorektal cancer og give en begrundelse for at overveje revurdering af

KRAS

mutationsstatus i CTCs for bedre forudsige respons på anti-EGFR-behandling.