PLoS ONE: Hurtig Valg og spredning af CD133 (+) Celler fra kræftceller: Kemoterapeutiske implikationer

abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) betragtes en delmængde af størstedelen tumor ansvarlig for at initiere og opretholde sygdommen. Adskillige overfladeaktive cellulære markører er for nylig blevet anvendt til at identificere CSCS. Blandt dem er CD133, som udtrykkes af hæmatopoietiske progenitorceller såvel som embryonale stamceller og forskellige kræftformer. Vi har for nylig isoleres og dyrkes CD133 positive [CD133 (+)] celler fra forskellige cancer cellelinjer ved hjælp af en NASA udviklede Hydrodynamisk Fokusering bioreaktor (HFB) (Celdyne, Houston, TX). Til sammenligning, en anden bioreaktor, blev den roterende cellekultursystem (RCCS) fremstillet af Synthecon (Houston, TX) anvendes. Både HFB og RCCS bioreaktorer simulere aspekter af hypogravity. I vores undersøgelse, at HFB øgede CD133 (+) cellevækst fra forskellige cellelinjer sammenlignet med RCCS fartøjet og til normal tyngdekraft kontrol. Vi observerede en (+) 15-fold proliferation af CD133 (+) cellulær fraktion med cancerceller, der var dyrket i 7 dage ved optimerede betingelser. Den RCCS fartøj i stedet gav en (-) 4,8-fold fald i CD133 (+) cellulær fraktion forhold til HFB efter 7-dages dyrkning. Interessant, vi fandt også, at hypogravity miljø i HFB stærkt sensibiliserede de CD133 (+) kræftceller, som normalt er resistente over for kemo behandling, til at blive modtagelige for forskellige kemoterapeutiske midler, hvilket banede vejen til mindre giftige og mere effektiv kemoterapeutisk behandling i patienter. For at kunne teste effektiviteten af ​​cytotoksiske midler in vitro forud for deres anvendelse i kliniske omgivelser på kræftceller samt på cancer stamceller kan bane vejen for mere effektiv kemoterapeutiske strategier hos patienter. Dette kunne være et vigtigt fremskridt i de terapeutiske muligheder for onkologiske patienter, der giver mulighed for mere målrettede og personlige kemoterapi samt til højere responsrater

Henvisning:. Kelly SE, Di Benedetto A, Greco A, Howard CM , Sollars VE, Primerano DA, et al. (2010) Hurtig Valg og spredning af CD133 (+) Celler fra kræftceller: Kemoterapeutiske implikationer. PLoS ONE 5 (4): e10035. doi: 10,1371 /journal.pone.0010035

Redaktør: Annarosa Leri, Harvard Medical School, USA

Modtaget: 10. februar, 2010; Accepteret: 16 marts 2010; Udgivet: April 8, 2010

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Denne forskning blev udført med midler modtaget delvist af Cell Differentiering og Development center (råvareafhængige) på Marshall University, NIH- CA138510, NIH-CA140024, NIH-COBRE 5P20RR020180 (til PPC); West Virginia NASA Space Grant Consortium (til S. K. og J.V.V.); WV-INBRE 5P20RR016477 (til D.P.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Neoplasmer kan ses som væv bestående af en heterogen population af celler, der adskiller sig i biologiske egenskaber og potentiale for selvfornyelse [1]. Den klonale natur af visse maligne tumorer er veletableret [2]. Ifølge modellen af ​​klonal evolution af tumorceller, er cancer dannet gennem akkumulering af genetiske ændringer i celler og gradvis udvælgelse af kloner [3], [4]. Derfor er tumoren betragtes som abnormt væv, der nedstammer fra en enkelt celle gennem løbende akkumulering af genetiske fejl og forskellige epigenetiske ændringer. Imidlertid har flere forsøg udført i løbet af de seneste årtier vist, at ikke alle tumor celle er en tumorfremkaldende celle (T-IC), og at så mange som 10

6 murine eller human tumorceller er forpligtet til at transplantere en ny tumor fra en eksisterende [4], [5], [6], [7]. Dette beviser foreslog muligheden at tumorceller kan eksistere i en hierarkisk tilstand, hvor kun et lille antal celler besidder tumorfremkaldende potentiale. Nylige data fra både hæmatologiske maligniteter og faste tumorer har antydet, at der er kun mindre populationer af celler i hver malignitet, der kan tumorinitiering som er de cancer stamceller (CSC) [4], [5], [6], [ ,,,0],7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Disse celler synes at være i stand til asymmetrisk deling og selvfornyelse, og er kun en mindre fraktion blandt hovedparten af ​​mere differentierede celler i tumoren [16], [17], [18].

For nylig, CSCS er blevet undersøgt i forskellige primære tumortyper for at udvikle CSC-specifikke terapier [6], [11], [19], [20], [21]. Interessant visse tumorer er meget resistente over for kemoterapi og andre former for behandling, og selvom aggressive behandlinger ødelægger de fleste af de kræftceller, en lille fraktion af cellerne overlever og ofte regenerere i endnu større masser af tumorceller [22], [23] , [24]. Effektive behandlinger til kræftpatienter kræver en grundig forståelse af mekanismer, der fører til tumor udvikling og resistens.

Den nylige opdagelse af CSCS har spillet en central rolle i at ændre vores opfattelse af carcinogenese og kemoterapi. CSCS menes at være ansvarlig for dannelsen og væksten af ​​neoplastisk væv. De CSCS er naturligt resistente over for de fleste nuværende kemoterapi på grund af deres hvilende karakter. Dette kan forklare, hvorfor traditionelle kemoterapier begynde med kan reducere størstedelen af ​​tumormasse, men undlader at udrydde den fuldt ud, så eventuel gentagelse [1], [11], [17], [18], [22]. CSCS er mere resistente over for behandling ikke kun sekundært til hvile, men også på grund af øget ekspression af anti-apoptotiske proteiner og drug effluxtransportører. Kræft behandlinger til rådighed i dag for det meste udnytte de proliferative og metastatiske potentialer kræftcellerne; Derfor er de fleste behandlinger rettet mod hurtigt delende celler og molekylære mål, der repræsenterer størstedelen af ​​tumoren. Dette kan forklare den fejlslagne behandlinger for at udrydde sygdommen eller for at hindre en gentagelse af kræft. Desuden, hvis et lægemiddel påvirker væksten af ​​kun en mindre population af celler, vil der kun være en minimal reduktion i væksten af ​​tumoren på kort sigt.

Teoretisk identifikation og karakterisering af CSCS kan tillade udvikling af behandlingsmodaliteter, der er målrettet de cancer stamceller snarere end de hurtigt delende celler i kræft.

Langvarig eksponering af mennesker og i forsøgsdyr til de ændrede gravitationelle betingelser for rumfart har negative virkninger på forskellige cellulære systemer. Virkningerne af hypogravity miljø på tumorvækst og carcinogenese er endnu ukendt, og dette forskningsområde mangler stadig systematisk undersøgelse på hypogravity induceret genekspression, som er nøglen nødvendige oplysninger til sidst udfolde mekanismen bag hypogravity-inducerede sygdomme. Til dette formål har vi undersøgt effekterne af simulerede hypogravity på humane osteosarcom-celler dyrket i NASA udviklede hydrofocusing bioreaktor (HFB) og i den roterende cellekultursystem (RCCS). Forskellige udformninger af roterende væg fartøjer er blevet brugt til at skabe en tredimensionel kultur miljø med variabel stress forskydning og hypogravity simulerer den i rummet [25]. Den HFB (Celdyne, Houston, TX) er udviklet af NASA på Johnson Space Center, er en væskefyldt kuppel, der roterer ved en specificeret hastighed og har en konisk spinner at give en unik hydrofocusing kapacitet, der vil give mulighed for en ekstremt lav-forskydning kultur miljø og en nylon gas transfer membran [25]. Den RCCS består af en horisontalt roteret dyrkningsbeholder iltet med en fast siliconegummi gas transfer-membran [26]. NASA-designet HFB bioreaktor og RCCS er med held blevet brugt på Jorden og i rummet til at gøre det muligt for efterforskerne at bruge modellerede eller faktisk hypogravity henholdsvis at studere betydningen af ​​tyngdekraften på dannelsen af ​​tredimensionale pattedyr celle væv modeller og produktion af bio-produkter [25], [27], [28], [29], [30], [31].

I denne undersøgelse viser vi, at cancer stamceller stimuleres til at formere sig, når de dyrkes i hypogravity betingelser produceret af HFB, og at reduktionen af ​​tyngdekraften simuleres i HFB sensitizes CSCS til kemoterapeutiske midler.

Resultater

osteosarkom stamceller-lignende celler formere i Hydro-Fokusering bioreaktor ( HFB), men ikke i roterende cellekultursystem (RCCS)

Modeled hypogravity er en tilstand, hvor cellerne er i konstant frit fald, og hvor de er i stand til at vokse i en forankringsuafhængig måde. Da virkningerne af hypogravity på tumorer er ukendt, vi troede at undersøge effekterne af modelleret hypogravity i mangel af klipning stress på væksten kapacitet af tumorceller af forskellig embryonale oprindelse. Vi har anvendt en HFB udviklet af NASA på Johnson Space Center, som er sammensat af et 50 ml væskefyldt kuppel, der roterer ved en specificeret hastighed og som har en indre konisk spinner som hydro-fokuserer cellekulturen giver mulighed for en lav forskydning miljø.

til vores overraskelse, fandt vi, at når et kendt antal Saos-2-celler blev podet i HFB, kun en lille fraktion af disse celler overlevede behandlingen, uafhængigt af den cellulære tæthed podet i bioreaktoren . Figur 1A viser, at antallet af levedygtige Saos-2-celler dyrket i 5 dage i HFB dramatisk reduceret.

A) trypanblå udelukkelse celletal på Saos-2-celler (osteosarcomceller) og SAOS-2 celler dyrket i HFB, CD133 (+) Saos-2-celler og CD133 (+) Saos-2-celler dyrkes i HFB, og af CD133 (+) Saos-2-celler og CD133 (+) Saos-2-celler dyrket i normale tyngdekraften tilstand. Grå søjler angiver antallet af celler anbragt i kontrolgruppen på dag-1. Sorte bjælker angiver antallet af levedygtige celler genvundet efter 5 dages kultur i denne dyrkning tilstand. B) Bright felt kontrast fase billede (20 ×) 3-D kultur (kugler) er dannet ud fra Saos-2-celler, der blev dyrket i HFB i 5 dage. Indsat (øverst til højre) viser et billede af CD133 immunfluorescensfarvning af Saos-2-celler dyrket i bioreaktoren i 5-dage. C) Flowcytometri diagram af CD133 immunofænotype af Saos-2-celler. Et isotype antistof blev anvendt som kontrol. D) trypanblåteksklusion celletal på en optimeret eksperiment HFB kultur af Saos-2-celler i HFB efter syv dage. CD133 (+) Saos-2-celler dyrket i bioreaktoren blev udvalgt og prolifererede 15-fold efter syv dage. Hvid bjælke angiver antallet af Saos-2-celler podet i HFB. Sort bjælke angiver antallet af levedygtige CD133 (+) Saos-2-celler udvundet efter 7 dages optimeret dyrkning i bioreaktoren. Grå bjælke angiver antallet af CD133 (+) celler til stede i det parentale Saos-2-population. Dataene er repræsentative for tre separate forsøg der giver sammenlignelige resultater.

Interessant SAOS-2 celler dyrket i bioreaktoren dannede celle kugler og syntes at være betydeligt mindre end Saos-2-celler dyrket i skåle og høstet ved trypsinbehandling (data ikke vist). Figur 1B viser en 20 × lysfelt billede af sfærer dannet af Saos-2-celler, der blev dyrket i HFB i 5 dage. Celler blev fjernet fra HFB reaktor og billeder blev taget straks under anvendelse af et omvendt mikroskop ved anvendelse af kontrast fase.

På grund af deres tilsyneladende ændring i morfologi og evnen til at danne sfærer i HFB miljø og fordi andre har vist tilstedeværelse af CD133 (+) celler inden primære knoglesarkomer, samt osteosarkom cellelinier MG-63, OS-521, 0S-01-187, OS-99-01, og Saos-2 og den chondrosarcoma cellelinie CS-828 [ ,,,0],32], [33], fremsatte vi den hypotese, at HFB udvalgte celler blev CD133 (+). For at teste denne hypotese vi immunophenotyped disse celler med et antistof rettet mod CD133 (Miltenyi, Tyskland), og fandt, at HFB valgte celler var 100% positive for CD133, en typisk stamcellemarkør af mesenchymal oprindelse (figur 1B, indsatte panel og Figur 1C ). Da Saos-2-celler udvundet fra bioreaktoren blev alle CD133 (+) (98,8%) (figur 1C), ønskede vi at bestemme, om CD133 (+) celler ikke kun overlevede, men også prolifererede i hypogravity miljø. Til dette formål valgte vi CD133 (+) celler fra Saos-2-eller HOS cellelinjer under anvendelse et MACSorting systemet og udfordret disse CD133 (+) celler til en 5-dages løb den HFB. Interessant SAOS-2 eller HOS-celler MACSorted med et antistof mod CD133 og dyrket i bioreaktoren i 5 dage steg i antal af to-fold (figur 1A). Figur 1A viser de trypanblåt udelukkelse celletal af CD133 (+) Saos-2-levedygtige celler inddrives efter 5 dages dyrkning i bioreaktoren.

Efter et par forsøg med cellekulturer optimering, var vi i stand til at opnå en 15 gange stigning i udbredelsen af ​​CD133 (+) cancer stamceller-lignende celler fra forældrenes SAOS-2-celler over en periode på syv dage ved at stoppe reaktoren hver 24 timer og forsigtigt blande kulturen 10 gange i en ortogonal måde over en periode på et minut, hvilket gav mulighed for omfordeling af medierne i kuplen og blanding af næringsstoffer med de prolifererende celler (Figur 1D). Figur 1D viser, at ifølge en optimeret protokol af cellekultur i HFB, er det muligt at vælge og til at formere en specifik population indeholdt i Saos-2-parentale cellelinje. Lignende resultater blev opnået ved hjælp af forskellige andre kræft cellelinjer af forskellig væv oprindelse, og som udtrykker en variabel mængde af CD133 markør (HOS, U2OS, T98G, U87MG, DU145, LNCaP, WI38, H23, Hep3B, Hela, MEWO, HO-1 celler, HN12 og HN30), se tabel 1, og data ikke vist.

en anden bioreaktor, der simulerer hypogravity, 50 ml roterende cellekultursystem (RCCS) [26] fremstillet af Synthecon (Houston, TX), blev anvendt til at sammenligne resultater, der genereres ved hjælp af HFB. I et parallelt eksperiment, hvor vi podet det samme antal Saos-2-celler i samme vævsdyrkningsinkubator med identiske betingelser for rotorhastigheden, CO2, temperatur og en beholder volumen (50 ml), den HFB øgede CD133 (+) cellevækst fra SAOS-2-celler i forhold til RCCS fartøj og til jorden tyngdekraft kontrol. 5 × 10∧6 Saos-2-celler blev podet i HFB eller RCCS bioreaktorer hvoraf 350.000 (7%) var CD133 (+) og 4.650.000 CD133 (-) (tabel 2). Kultur medier, iltning, hastighed, temperatur og CO

2 blev holdt konsekvent konstant for de to dyrkningssystemer og i samme inkubator for en 7-dages løb. Efter en 7-dages løb, blev skibene høstet og cellerne blev reageret med et antistof fluoresceineret mod CD133 (Miltenyi, Tyskland) og tælles ved hjælp af en BD Facs Aria flowcytometer. Et isotype antistof blev anvendt som kontrol. Fra sammenligningen af ​​de to bioreaktor kulturer, viste vi, at et (+) 15-gange stigning i CD133 (+) celler nummer (5,370,960 CD133 + celler) blev opnået ved anvendelse af HFB på en 7-dages løb. Nr spredning af CD133 (+) celler blev observeret i kulturen afledt af RCCS dyrkningsbeholderen. Den RCCS dyrkningsbeholderen viste i stedet en drastisk reduktion i CD133 (+) cellepopulation [(-) 4,8 gange formindskelse] fra antallet af CD133 (+) celler udsået i bioreaktorer på dag-0 (Tabel 2). Faktisk er antallet af Saos-2 CD133 (+) celler faldt fra 350.000 til 72.800 i en 7-dages løb den RCCS, mens HFB dyrket Saos-2-CD133 (+) celler steg fra 350.000 til 5.370.960 i en tilsvarende periode af tid.

på grund af denne dramatiske forskel i væksten i Saos-2 CD133 (+) celler i to bioreaktorer genererer hypogravity (HFB og RCCS), vi ønskede at kontrollere, om pH kunne være en variable forårsager virkningerne på cellevækst observeret. Derfor målte vi pH i mediet af HFB og RCCS bioreaktorer opbevares i samme inkubator med en CO

2-niveau på 5% og en konstant temperatur på 37 ° C før og efter en kørsel af 7-dage. Vi sammenlignede pH i mediet fra HFB og RCCS fartøjer med de konditionerede medier af kontrol celler dyrket i en petriskål i jorden tyngdekraft tilstand versus ubrugte D-MEM medium. Ingen statistisk signifikant forskel blev fundet mellem de forskellige celledyrkningsbetingelser ved at gentage forsøgene tre gange. Faktisk viste ubrugte medium en pH på 7,82 ± 0,04. Medium fra kontrol Saos-2-celler dyrket i en petriskål i normale tyngdekraft betingelser viste et pH på 7,96 ± 0,23; medium fra Saos-2-celler dyrket i HFB havde en pH på 7,71 ± 0,23; og medium fra Saos-2-celler dyrket i RCCS bioreaktoren viste et pH på 7,9 ± 0,11, hvilket viser, at den forskellige vækst af CD133 (+) Saos-2-celler observeret mellem RCCS og HFB fartøjer ikke skyldtes ændringer i pH i dyrkning medier.

osteosarkom celler dør ved apoptose i Hydro-Fokusering Bioreactor (HFB)

da kun en lille brøkdel af osteosarkom SAOS-2 samt HOS-celler placeret i HFB celle kultursystem blev udvundet efter 3 eller 5 dages dyrkning, testede vi, om disse celler blev fjernet fra den oprindelige population ved at få dem til at undergå apoptose. Derfor har vi sammenlignet satserne for apoptose af SAOS-2-celler dyrket i HFB 3 og 5 dage til MACSorted CD133 (+) celler dyrket i HFB for 3 og 5 dage.

Til dette formål har vi analyserede Saos-2-celler dyrket i 3 dage eller 5 dage i bioreaktoren og fandt, at Saos-2-celler dyrket i HFB i 3 eller 5 dages dø ved apoptose som vist ved en flowcytometrisk assay af Annexin-V og propidium iodidfarvning af prøverne (figur 2 B og D). 24% af cellerne blev fundet i apoptose efter 3-dages kultur i HFB. Interessant, den del af celler, der dør ved apoptose steg til 62% efter 5-dages kultur i HFB, hvilket bekræfter den indledende observation (figur 1). Vigtigst, prøver af CD133 (+) MACSorted celler dyrket i HFB i 5 dage viste ikke en sådan stigning i apoptose ved Annexin V-farvning sammenlignet med kontrolprøven (figur 2E og F). I de samme dyrkningsbetingelser i HFB, den CD133 (+) prolifererer mens CD133 (-). Celler i stedet dø ved apoptose

A) Annexin-V-farvning af Saos-2-celler dyrkes i 1-G i 3 dage. Analysen tillader at skelne i diagrammet mellem levende celler (nederste venstre kvadrant), tidlige apoptotiske celler (nederste højre kvadrant), apoptotiske celler (øvre højre kvadrant) og nekrotiske celler (øverste venstre kvadrant). B) Annexin-V-farvning af Saos-2-celler dyrket i HFB i 3 dage. C) Annexin-V-farvning af Saos-2-celler dyrket i 1-G i 5 dage. D) Annexin-V-farvning af Saos-2-celler dyrket i HFB i 5 dage. E) Annexin-V-farvning af CD133 (+) MACSorted Saos-2-celler, der blev dyrket i 1-G i 5 dage. F) Annexin-V-farvning af CD133 (+) MACSorted Saos-2-celler, der blev dyrket i HFB i 5 dage. G) Relativ caspase-3-aktivitet af Saos-2-celler (total population) dyrket i 5 dage i HFB sammenlignet med Saos-2-celler (samlede befolkning) dyrket i statisk 1G tilstand.

Vi har også undersøgt dette fænomen ved at måle aktiviteten af ​​caspaser ved anvendelse af en kolorimetriske caspaser kit, der måler aktiviteten af ​​caspase-3 i prøverne. Ifølge data præsenteret fandt vi, at Saos-2-celler (samlede befolkning) dyrket i HFB i 5 dage viste en stigning på 1,6 gange i caspase-3-aktivitet påvist (figur 2 G), som er et mål for den apoptotiske indeks i disse celler.

stamcellemarkør ekspression øges efter kultur i Hydro-Fokusering bioreaktor

Måske den mest spændende kapacitet tillagt ved roterende, lav forskydning bioreaktor system er mulighed for at studere , under kontrollerede betingelser, interaktionen af ​​celler af en given type eller interaktionen af ​​én celletype med en anden, når celler i suspension kan frit danne deres egne foreninger. Vi ønskede at analysere ekspressionsniveauerne af forskellige markører i forbindelse med udviklingen af ​​stamceller af mesenchymal oprindelse. Ekspressionen af ​​CD133, CD34, CD38, osteocalcin, Sparc, Sox-9, RunX-2, Stro-1, CD117 /c-Kit, Oct3 /4, Endoglin, og Integrin-SS1 blev undersøgt ved flowcytometri. Figur 3A viser procenten af ​​fluorescerende celler i de forskellige markører undersøgt i Saos-2-celler dyrket i statisk tilstand og efter dyrkning i HFB i 5-dage. Ekspressionsniveauerne og antal celler, der udtrykker de undersøgte markører steg efter 5 dages dyrkning i HFB fartøj i forhold til de celler dyrket i normale tyngdekraft betingelser. Interessant, Saos-2-celler dyrket i HFB fartøj viste den højeste relative stigning i antallet af celler positive for Sox-9, CD133, osteocalcin, Integrin-SS1, Sparc, RunX-2, og Endoglin (94,7%, 89,3% , 82%, 81,8%, 81,3%, 79% og 76%, henholdsvis), sammenlignet med Saos-2-celler dyrket under en normal tyngdekraft betingelser. Oct3 /4, CD117, Stro-1, og CD34 viste også en stigning i antallet af celletal positivitet (75,9%, 67,5%, 47,6%, 22,36%, henholdsvis) sammenligning 1G-vækst versus Saos-2-celler dyrkes i simuleret hypogravity i 5-dage. Vi fandt ingen ændring i antallet af CD38 positive celler i de samme betingelser. Forsøget blev gentaget 5 gange med sammenlignelige resultater og standardafvigelser blev beregnet og er angivet på diagrammet som fejlsøjler. Figur 3B viser et eksempel på immunfluorescensfarvning og positivitet af Saos-2-celler til CD133, Sox-9, Sparc, og CD117 /c-Kit efter vækst i HFB fartøj i 5 dage.

A) Diagram over ekspressionsniveauerne af forskellige biomarkører. Lavendel søjler indikerer procentdelen af ​​celler, der udtrykker basale niveauer af de forskellige markører i parentale Saos-2-celler dyrket i normal 1-G tyngdekraft tilstand (kontrol). Lilla søjler indikerer procentdelen af ​​celler, der udtrykker de forskellige markører i CD133 (+) MACSorted Saos-2-celler, der var isoleret fra parentale Saos-2-celler dyrket i normal 1-G tyngdekraften tilstand. Gule søjler indikerer procentdelen af ​​celler, der udtrykker de forskellige markører i CD133 (+) MACSorted Saos-2-celler, der var dyrket i hypogravity tilstand. Lyseblå søjler indikerer procentdelen af ​​celler, der udtrykker de forskellige markører i parentale Saos-2-celler, der var dyrket i hypogravity betingelse for 5-dage, hvilket resulterer i en population af udvalgte og prolifererede CD133 (+) Saos-2-celler. B) Immunofluorescens farvning (40 ×) og positivitet i SAOS-2 celler til CD133, Sox-9, SPARC, og CD117 /c-Kit efter vækst i bioreaktoren i 5-dage.

CD133 (+) celler vokser tredimensionelt i Hydro-Fokusering bioreaktor og danner kugler

SAOS-2 CD133 (+) berigede osteosarcomceller formere og samle tredimensionelt som sarcospheres efter 3-dages kultur i bioreaktoren , som er endnu et karakteristisk for stamcelle vækst. Figur 4 A og B show på 10 og 40 × forstørrelse magt, henholdsvis sarcospheres dyrket i bioreaktoren efter 3 dages dyrkning i simuleret hypogravity. Interessant, CD133 (+) Saos-2-celler, der blev dyrket i simuleret hypogravity kunne genetablere den parentale cellelinje (bestående af ca. 10% ± 6,8 CD133 (+) celler og 90% ± 6,8 CD133 (-) celler ) efter en periode på en uge, når podet i behandlede kultur retter, som giver mulighed for vedhængende celler til at knytte til plastik miljø. Figur 4 C og D (10 × og 40 × henholdsvis) viser Saos-2-CD133 (+) celler prolifererede og vælges med HFB der blev efterfølgende dyrket i fastgørelse vævskulturskåle. I den rekonstituerede cellekultur nogle ikke-adhærerende celler blev mærkbar; disse kunne være stamceller-lignende celler også kendt som cancer stamceller.

A) HFB vokset SAOS-2 osteosarcomceller (CD133 +) er i stand til at formere sig og samle tredimensionelt som sarcosheres efter 3-dages kultur i bioreaktoren (10 × forstørrelse). B) HFB dyrket SAOS-2 osteosarcomceller (CD133 +) er i stand til at formere sig og samle tredimensionelt som sarcosheres efter 3-dages kultur i bioreaktoren (40 x forstørrelse). C) HFB dyrket SAOS-2 osteosarcomceller (CD133 +) podet i en bestrålet plast dyrkningsskål, rekonstituere normale vedlagte fænotype af de parentale Saos-2-celler efter en uges kultur (10 × forstørrelse). Pilene peger på CD133 (+) Saos-2-celler, der viser en afrundet og svagt fastgørelse fænotype. D) HFB dyrket SAOS-2 osteosarcomceller (CD133 +) podet i en bestrålet plast dyrkningsskål, rekonstituere normale vedlagte fænotype af de parentale Saos-2-celler efter en uges kultur (40 ganges forstørrelse). Pilen peger på CD133 (+) Saos-2-celler, der viser en afrundet og svagt fastgørelse fænotype.

Det er kendt, at stamceller-lignende celler vil danne celle sfærer når dyrket i ultralav-fastgørelse retter. Vi har derfor testet evne CD133 (+) SAOS-2 MAC-sorteres celler til at danne celleklynger hvis de placeres i ultralav-fastgørelse retter. Deres evne til at danne klynger var mindre effektiv sammenlignet med de celler, der er dyrket i hydrofocusing bioreaktoren, men de var stadig i stand til at danne sfærer. Figur 5 A og B viser sfærer dannet af Saos-2-CD133 (+) celler i ultralav-fastgørelse retter. Vi testede også evnen af ​​Saos-2-CD133 (+) MACSorted og berigede celler kan knytte til vævskulturskåle og kunne rekonstruere den parentale Saos-2-cellelinje. Som forventet MACSorted CD133 (+) berigede celler anbragt i fastgørelse vævskulturskåle efter at være dyrket i ultralav-fastgørelse retter til to uger, rekonstitueret den parentale Saos-2-cellelinje efter en uges kultur ved at binde til fadet, manifesterer en fladtrykt og differentieret fænotype over tid. Figur 5C og D viser adhærente Saos-2-celler afledt fra CD133 (+) MACSorted celler dyrket i adhærente vævskulturskåle. Figur 5 E viser Saos-2-cellelinje rekonstitueret efter 10-dages podning af CD133 (+) berigede celler i vedhængende vævskulturskåle.

A) MACSorted CD133 (+) Saos-2-celler samle tre- dimensionelt som sarcosheres efter 2 uger af kultur i ultralav-fastgørelse retter (20 × forstørrelse). B) Et andet eksempel på MACSorted CD133 (+) Saos-2-celler, der danner Sarco sfærer efter 2 ugers dyrkning i ultralav-fastgørelse retter (10 × forstørrelse). C) SAOS-2 osteosarcomceller afledt af tre-dimensionelle kulturer dyrket i ultralav-fastgørelse retter podet i knyttet retter viser en vedhængende en differentieret fænotype efter 3 dage. D) SAOS-2 osteosarcomceller afledt af tre-dimensionelle kulturer dyrket i ultralav-fastgørelse retter podet i knyttet retter viser en vedhængende en differentieret fænotype efter 5 dage. E) Saos-2-osteosarcomceller afledt af tre-dimensionelle kulturer dyrket i ultralav-fastgørelse retter podet i fastgørelse retter viser en holdbar og differentieret fænotype efter 10 dage.

En yderligere indikation af, at to forskellige populationer kan identificeres i Saos-2-cellelinien er bevis for, at CD133 (+) MACSorted Saos-2-celler har forøget evne til at vokse i blød agar sammenlignet med de parentale celler. Cellerne blev udpladet i 6-brønds plader udfører 6 replikater af hvert eksperimentelt punkt. Samme antal Saos-2-celler og af CD133 (+) Saos-2-celler (5 x 10

3 celler /brønd) blev podet i 6 replikaer i en seks-brønds skål. Effektiviteten af ​​CD133 (+) Saos-2-celler til at vokse i blød agar og samles i tredimensionale strukturer er meget højere end de parentale Saos-2-celler. Seks hundrede og fyrre ± 240 kolonier blev talt fra soft-agar 6 brønde seedede med CD133 (+) SAOS-2 beriget celler sammenlignet med kun 20 ± 12 kolonier regnet fra den bløde-agar retter seedede med CD133 (- ) Saos-2-celler. Interessant nok blev 120 ± 80 kolonier tælles fra den bløde agar retter podet med de parentale Saos-2-celler, hvilket antyder, at evnen til at danne kolonier i blød agar kan skyldes tilstedeværelsen af ​​en fraktion (konsekvent, ca. 10% ± 6.8) af stamceller-lignende celler i Saos-2-cellelinje, vi har i vores laboratorium (tabel 3). Figur 6 viser et eksempel på en blød-agar-assay udført med den parentale tumorcellelinie (figur 6A) eller med den CD133 (+) fraktion af Saos-2-celler (figur 6B). De parentale Saos-2-celler dannede sfærer, men med meget lav effektivitet sammenlignet med den berigede CD133 (+) celler.

A) Contrast fase mikroskopi af en blød agar-assay af parentale Saos-2-celler. B) Contrast fase mikroskopi af en blød agar-assay af HFB CD133 (+) prolifererede Saos-2-celler. C) Propidiumiodid flowcytometrianalyse af Saos-2-celler dyrket i 1-G kultur sorteret efter deres CD133 status viser to forskellige populationer: Den CD133 (+) og CD133 (-) celler med en anden cellecyklus profil. D) immunofænotype af Saos-2-celler dyrket i 1-G versus HFB kultur viser, at Saos-2-celler dyrket i 5 dage i simuleret hypogravity indeholder størstedelen af ​​cellerne farvet for Ki-67 og dermed i S-fase af cellecyklus

Yderligere bevis for, at der er to forskellige populationer i Saos-2-cellelinien, som synes at være sammensat af CD133 (+) og. (-) celler, er, at disse to forskellige populationer har en distinkt cellecyklus profil. Vi udførte en flowcytometrianalyse af Saos-2-celler dyrket i 1G kultur og fandt, at Saos-2-CD133 (+) celler, som blev sorteret efter deres CD133 status og farvet med propidiumiodid, havde en anden cellecyklus profil i forhold til CD133 (+) befolkning. Figur 6C viser et repræsentativt flowcytometrisk assay af Saos-2-celler som viser, at CD133 (-) Saos-2-populationen havde 13,8% af celler i G2 /M-fasen af ​​cellecyklussen, mens CD133 (+) celler viste en øget fraktion (49%) af celler i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus. Sammenlignelige resultater blev opnået i parallelle og gentagne forsøg.

Interessant Saos-2-celler dyrket i bioreaktoren i 5 dage og farvet med et anti-CD133 (Miltenyi, Tyskland) og proliferationsmarkør anti-Ki-67 vist øget proliferation af cellerne sammenlignet med Saos-2-celler dyrket i 1G kulturer. Figur 6D viser et repræsentativt flowcytometriassayet af Saos-2-celler, som viser, at cellerne dyrket i HFB prolifererer med en anden hastighed end den samlede Saos-2-cellepopulation. Faktisk den del af Saos-2 CD133 (+) celler, som også er positive for Ki-67, steg fra 14,27% til 53,98% sammenligner celler dyrket i 1G-vækst versus disse celler dyrket i 5 dage i HFB simuleret hypogravity tilstand , henholdsvis. Sammenlignelige resultater blev opnået i parallelle og gentagne forsøg.

Simuleret hypogravity øger apoptose og sensibiliserer cancer stamceller til kemoterapi

CSCS menes at være ansvarlig for at iværksætte og opretholde sygdommen. Nogle typer af tumorer er meget resistente over for kemoterapi og andre former for behandling.